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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
苏云金芽胞杆菌 cry2Ad基因的克隆
及其表达产物的活性分析
张静涛 1, 2 　束长龙 1 　宋福平 1 　刘楠 1 　张杰 1 　黄大　2
(1中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室 ,北京 100193; 2中国农业科学院生物技术研究所 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　苏云金芽胞杆菌 (B acillus thuringiensis, B t) SBT2是我国新分离出的一株野生菌株。扫描电镜显示该菌株产生
双锥体形晶体。琼脂糖凝胶电泳发现其质粒图谱含有 5个条带。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示此菌株产生 130 kD晶体蛋白。利
用 PCR2RFLP法进行杀虫基因类型鉴定 ,发现其含有 cry1A a、cry1D a、cry1Hb、cry1Jb、cry1Ka 、cry1 Ib、基因。Cry2Ad蛋白的活性
至今未见研究报道 ,本研究克隆和测序了该基因。并对其进行了表达。生物活性测定结果表明其表达产物对舞毒蛾 (L ym ant2
ria d ispar)、棉铃虫 (Helicoverpa arm igera)、亚洲玉米螟 (O strin ia furnacalis)、小菜蛾 ( Plu tella xy lostella)有低活性 ;对大猿叶甲
(Colaphellus bow ringi)无活性。
关键词 : 　苏云金芽胞杆菌 　cry2A d基因 　克隆 　表达 　生物活性
Clon ing, Expression and Insectic idal Activ ity of cry2Ad
Gene from B acillus thu ringiensis
Zhang J ingtao1 　Shu Changlong1 　Song Fup ing1 　L iu Nan1 　Zhang J ie1 　Huang Dafang2
(1 S tate Key Laboratory for B iology of Plant D iseases and Insect Pests, Institu te of Plant Protection, Chinese Academ y of
Agricultural Sciences, B eijing 100193; 2 B iotechnology Research Institu te, Chinese Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　A new B acillus thuring iensis strain, SBT2, was isolated from soil samp les in China. The strain formed the bipyram idal
crystal observed by scanning electron m icroscopy. Five bands were found in the large p lasm id p rofile of SBT2. SDS2PAGE analysis re2
vealed molecular weight of insecticidal crystal p rotein in this strain was 130 kD. By use of PCR2RFLP identification method, cry1A a、
cry1D a、cry1Hb、cry1Jb、cry1Ka 、cry1 Ib、cry2A d genes were found in this isolate. The cry2A d gene was cloned, sequenced and ex2
p ressed. The bioassay results indicated that the exp ressed Cry2Ad had insecticidal activity against Lym antria dispar, O strin ia furnaca lis,
Helicoverpa arm igera and Plutella xylostella. But there was no activity against Colaphellus bow ringi.
Key wo rds: 　B acillus thuring iensis　cry2A d gene　Cloning　Exp ression　 Insecticidal activity
收稿日期 : 2009205207
基金项目 :“十一五”863计划 (2006AA022189, 2006AA10A212)
作者简介 :张静涛 (19822) ,男 ,在读硕士研究生 ,研究方向 :农业微生物 ; E2mail: zhangjingtaofeng@ yahoo1com1cn
通讯作者 :黄大　,研究员 ,博导 ; Tel: 010262815839, E2mail: dfhuang@ ippcaas. cn　　苏云金芽胞杆菌 (B acillus thu ring iensis, B t)是一种广泛分布的重要杀虫微生物 ,杀虫作用主要由 cry等基因编码的蛋白而产生。目前已报道的杀虫晶体蛋白 ( insecticidal crystal p rotein, ICPs)有447种 ,分为 55类 Cry蛋白和 2类 Cyt蛋白 ,分属180种模式蛋白 [ 1 ] 。一些 cry1类基因在转基因植物商业化中已得到了成功的应用 ,但也面临着抗性风险的难题 ,研究表明 cry2类基因与昆虫的作 用方式与 cry1类不同 ,混合使用能有效延缓害虫抗性产生 ,因此 cry2类基因编码蛋白的活性分析显得十分重要。 cry2类基因编码大约 70 kD蛋白 ,形成方形晶体 [ 2, 3 ] 。目前已发现 6种 cry2类模式基 因 : cry2A a、 cry2A b、 cry2A c、 cry2A d、 cry2A e、cry2A f[ 3, 8 ] 。Cry2Aa蛋白对鳞翅目、双翅目和直翅目害虫有活性 [ 3, 9 ] 。Cry2Ac蛋白对鳞翅目和双翅目害虫有活性 [ 5 ] 。Cry2Ab, Cry2Ae, Cry2Af蛋白仅
2009年第 10期 张静涛等 :苏云金芽胞杆菌 cry2A d基因的克隆及其表达产物的活性分析
对鳞翅目害虫有活性 [ 7, 8, 10 ]。 cry2A d基因在 1999
年首次被发现 ,目前仅发现 5个 cry2A d基因 [ 1 ] 。
但是相对于其它 Cry2类蛋白 , Cry2Ad蛋白的活性
尚未见报道。
B t菌株 SBT2是本实验室自我国黑龙江土壤样
品中分离的野生菌株 ,经 PCR2RFLP鉴定其 cry2类 基因型含有 cry2Ad基因。本研究克隆了该 cry2A d全长基因 ,完成了全序列测定和在大肠杆菌中的表达 ,并分析了其杀虫活性。1　材料和方法1. 1　材料1. 1. 1　菌株与质粒所用菌株和质粒见表 1。
表 1　菌株与质粒
菌株与质粒 特征 来源
NovaB lue
　endA1 hsdR17 ( rK122m K12 + ) supE44 th i21 recA1 gyrA96 relA1 lacF′[ proA +B + lacIqZΔM 15: : Tn10 ]
( TetR )
Novagen公司
Rosetta (DE3)
pLysS
　F2om pT hsdSB ( R 2B m 2B ) ga l dcm λ ( D E3 [ lacI lacUV52T7 gene 1 ind1 sam 7 nin5 ] ) pLysSRARE
( Cam R )
Novagen公司
SBT2 　含有 cry2A d基因的野生型菌株 本实验室分离
pET221b ( + ) 　氨苄青霉素抗性 Novagen公司
pET2Ad 　载体和 cry2Ad基因重组质粒 本研究　　　
1. 1. 2　培养基 　LB培养基 : 1. 0%胰蛋白胨 , 0. 5%
酵母提取物 , 1. 0% NaCl, pH 7. 0;牛肉膏蛋白胨培
养基 : 0. 5%蛋白胨 , 0. 3%牛肉膏 , pH 7. 0。
1. 1. 3　生化试剂 　pfu高保真 DNA聚合酶购自北
京汇天东方公司 ,限制性内切酶、DNA聚合酶 ,连接
试剂盒等购自 Axygen, Promega和 Toyobo公司 , DNA
回收试剂盒购自美国 Axygen公司。
1. 1. 4　供试昆虫 　小菜蛾 ( P lu tella xy lostella )、大
猿叶甲 ( Colaphellus bow ring i)由本实验室饲养的标
准化试虫 ;棉铃虫 (Helicoverpa arm igera)和亚洲玉米
螟 (O strin ia furnaca lis) ,分别由中国农科院植物保护
研究所棉花害虫组和玉米害虫组提供的标准化试
虫 ;舞毒蛾 (L ym antria d ispar)由河北农业大学林学
院提供的标准化试虫。
1. 2　方法
1. 2. 1　扫描电镜及 SDS2PAGE　将 - 70℃冻存的
SBT2甘油菌在 LB 平板上 30℃活化过夜 ,转接至
1 /2 LB平板 , 30℃培养 20 h,产生晶体。刮菌 ,灭菌
水洗 3次 , 12 000 r/m in, 10 m in离心收集芽孢和晶
体。用 1 m l灭菌水悬浮。将菌液均匀涂于 1 φ 2薄
玻璃片上 ,晾干。离子溅射喷金 (2 nm ) ,日立 S2570
扫描电镜观察。SBT2晶体蛋白的 SDS2PAGE分析 参照文献 [ 12 ]。1. 2. 2　质粒提取及电泳 　B t质粒 DNA提取参照文献 [ 13 ]。0. 7%琼脂糖凝胶中 , 1 ×TAE电泳缓冲液 , 4 V /cm,电泳 6 h。1. 2. 3　PCR2RFLP分析 cry基因型 　cry1基因的鉴定参照文献 [ 14 ]所述方法进行 , cry1 I基因的鉴定参照文献 [ 13 ]所述方法进行 , cry2, cry3和 cry4 /10基因的鉴定参照文献 [ 15 ]所述方法进行 , cry5～cry9基因的鉴定参照文献 [ 16 ]所述方法进行。引物及PCR2RFLP分析见表 2,表 3。表 2　PCR2RFL P鉴定引物及序列基因型 引物 序列 (5′→3′)cry1 K5un2 AGGACCAGGATTTACAGGAGGK3un2 GCTGTGACACGAAGGATATAGCCACK3un3 CCTCCTGTAAATCCTGGTCCTK5un3 CAATGCGTACCTTACAATTGTTTAAGTAATcry1 I S5uni GCTGTCTACCATGATTCGCTTGS3uni CAGTGCAGTAACCTTCTCTTGCcry2 S5un2 GGAAGAACTACTATTTGTGATGCS3un2 AATAGTTTGAATTACCGCGAGC
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
表 3　cry1, c ry1 I和 cry2类基因 PCR扩增
产物和限制性酶切长度多态性
cry型基因 PCR产物 ( kb) RFLP片段大小 ( bp)
引物为 K5un2 /
K3un2
Pst I和 X ba I双酶切
cry1Aa 1. 6 1 117 518
cry1D a 1. 6 962 518 140
cry1Hb 1. 6 94 665 816
cry1Jb 1. 6 72 965 516 681
cry1Ka 1. 6 8 885 131 568 173
引物为 K5un3 /
K3un3
EcoR I和 Pst I双酶切
cry1Aa 1. 4 726 493 244
cry1D a 1. 4 819 310 307
cry1Hb 1. 4 1 304 144
cry1Jb 1. 4 861 572
cry1Ka NP NP
引物为 S5uni/
S3uni
B anⅠ和 B sp119Ⅰ双酶切
cry1 Ib1 1. 6 115 638 147
引物为 S5un2 /
S3un2
H infⅠ酶切
cry2Ad 1. 9 113 535 126 311 251
　　NP:没有产物
1. 2. 4　pEB 载体的构建 　用 B glⅡ和 S tyⅠ双酶切
pET221b质粒 ,电泳回收大片段 pE21;用 PCR扩增
pETB lue22质粒 600 bp表达区 ,电泳回收扩增片段 B2
2。用 T4 DNA聚合酶将片段 pE21和 B22末端补平 ,
连接两个片段转化大肠杆菌 NovaB lue菌株 ,挑选蓝
斑并进行酶切和 PCR鉴定 ,构建完成新的载体 pEB。
1. 2. 5　DNA分子克隆与检测 　大肠杆菌质粒 DNA
提取、DNA酶切、连接、转化和阳性转化子的筛选以
及表达产物 SDS2PAGE检测参照文献 [ 12 ]。
1. 2. 6　cry2A d全长基因的扩增 ,克隆及序列测定 　
参考 GenBank公布的 cry2基因序列设计 cry2类基
因全长通用引物。
正向引物 : Q2un5: 5′2ATGAATAGTGTATTGAAT2
AGCGGAAGAACTACT23′
反向引物 : Q2un3: 5′2ATAAAGTGGTGAAAGATT
AGTTGGAACAA23′
以 SBT2 质粒 DNA 为模板 ,利用 pfu高保真
DNA 聚合酶进行 PCR 扩增。首先 94℃预变性
5 m in;然后 94℃变性 1 m in, 54℃退火 1 m in, 72℃延
伸 3 m in,循环 30次 ;最后 72℃延伸 10 m in。回收
PCR产物 ,用限制酶 Ecl136 II处理 pEB 载体 ,将
PCR产物与处理后的 pEB载体进行连接并转化大肠
杆菌 Novablue菌株 ,以载体表达区反向引物 PEBR和
全长基因正向引物 Q2un5进行 PCR鉴定 ,筛选出阳
性克隆。cry2Ad基因测序由中国农科院农作物基因
资源与基因改良国家重大科学工程开放实验室测定
完成。DNA 序列分析采用 Informax2003Vector NTI
Suite 9软件进行。
1. 2. 7 　 cry2A d 基因表达和杀虫生物测定 　将
pEB2Ad转入受体菌株 Rosetta进行诱导表达 ,诱导
表达条件参见 Novagen公司操作手册。棉铃虫、亚
洲玉米螟、小菜蛾的生测方法参照文献 [ 17, 18 ]。
大猿叶甲和舞毒蛾的生测方法 :将新鲜的油菜菜叶
和白杨树叶浸入蛋白样品 , 10 s,自然晾干 ,接入待
测幼虫放入人工气象器中 , 96 h调查结果 ,计算校
正死亡率和致死中浓度 (LC50 )。
2　结果和分析
2. 1　扫描电镜及野生菌株蛋白图谱
通过扫描电镜观察野生菌株 SBT2产生大小不
一的双锥体形晶体 (图 1)。 SDS2PAGE电泳显示该
菌株产生晶体蛋白分子量约为 130 kD (图 2,泳道
1) ,与 B. thuring iensis subsp. kurstak i HD21中 130 kD
左右蛋白分子量相当 (图 2,泳道 2)。
S. 芽孢 ; C. 晶体
图 1　SBT2扫描电镜图
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2009年第 10期 张静涛等 :苏云金芽胞杆菌 cry2A d基因的克隆及其表达产物的活性分析
1. SBT2; 2. HD1; 3. Marker
图 2　SBT2蛋白 SD S2PAGE电泳结果
2. 2　SBT2质粒电泳图谱及 PCR2RFLP鉴定
SBT2菌株质粒不如 HD1菌株质粒丰富 ,仅含
有 147 kb、80 kb、35 kb、18 kb、12 kb 5个质粒条带
(图 3,泳道 3) ,两者所含大质粒条带相似 ,而小质
粒条带差异较大。相对于 HD1菌株 , SBT2菌株所
含质粒条带都在 10 kb以上。PCR2RFLP鉴定发现
此菌株中含有 cry1、cry1 I、cry2类基因 ,未检测到 cry3、
cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10类基因。K5un2 /
K3un2引物扩增产物经酶切后产生 1 117 bp、962 bp、
946 bp、888 bp、729 bp、658 bp和 518 bp的片段 (图
3,泳道 1) ; K5un3 /K3un3引物扩增产物经酶切后产
生 1 304 bp、861 bp、819 bp、726 bp , 572 bp的片段
(图 3,泳道 2 ) ,经分析确定菌株中含有 cry1A a、
cry1D a、cry1Hb、cry1Jb, cry1Ka (表 3 ) ; S5uni/S3uni
引物扩增产物经酶切后产生 1 156 bp、381 bp的片
段 (图 4,泳道 3 ) ,确定含有 cry1 Ib基因 (表 3 ) ;
S5un2 /S3un2引物扩增产物经酶切后产生 1 135 bp、
351 bp和 263 bp的片段 (图 4,泳道 4) ,说明含有
cry2A d基因 (表 3)。
1.λ/E; 2. HD1; 3. SBT2
图 3　SBT2菌株质粒电泳图
1. K5un2 / K3un2扩增产物 Pst I和 Xba I双酶切结果 ;
2. K5un3 / K3un3扩增产物 EcoR I和 Pst I双酶切结果 ;
3. S5uni/ S3uni扩增产物 B anⅠ和 B sp119Ⅰ双酶切结果 ;
4. S5un2 /S3un2扩增产物 H infⅠ酶切产物
图 4　SBT2菌株 PCR2RFL P鉴定图谱
2. 3　cry2Ad全长基因的克隆和序列分析
用 cry2类基因全长引物以 SBT2质粒为模板扩
增其中的 cry2类全长基因 ,琼脂糖凝胶电泳回收扩
增全长 cry2A d片段 ,连接 pEB载体 ,转化大肠杆菌
NovaB lue菌株 ,蓝白斑筛选转化的重组质粒并鉴
定插入方向 ,获得重组载体 pEB2Ad。对 pEB2Ad
测序结果表明 ,本研究得到的 cry2A d 基因全长
1 902 bp。由 DNA 序列推导的氨基酸为 633个 ,
其蛋白质分子量为 70. 7 kD ,预测的等电点为
8121,为弱碱性蛋白质。在 NCB I上应用 BLAST软件
比较同源性显示 ,该基因与 cry2Ad1基因的同源性最
高 (达 99% ) ,仅在第 291 875, 1 885位的 3个核苷酸
的差异 ,由此引起 2个氨基酸的变化 :第 10位由天冬
酰胺变为苏氨酸 , 639位由异亮氨酸变为亮氨酸。该
基因在 GenBank中注册 ,登录号为 FJ951837。
214　cry2Ad基因的表达
在 pEB载体上 cry2A d基因成功获得了表达 ,蛋
白表观分子量约为 70 kD (图 5) ,在 50 mM IPTG,
18℃, 150 r/m in诱导条件下该基因表达产物在可溶
性组分和非可溶性组分 ( 20 mM Tris2HCl, pH8. 0缓
冲液 )均可以被检测到 (图 5) ,阴性对照空载体转入
Rosetta菌中未发现相应分子量蛋白表达。这与根
据碱基推导的氨基酸所计算的大小一致。这结果说
明在大肠杆菌中表达的 Cry2Ad蛋白有部分是可
溶的。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
1. BSA; 2. cry2Ad表达产物的非溶性组分 ; 3. cry2Ad表达产物的可溶
性组分 ; 4. 非可溶性空载体 pEB 作为阴性对照 ; 5. 可溶性空载体
pEB作为阴性对照
图 5　cry2A d基因在大肠杆菌 Rosetta中表达结果
2. 5　杀虫生物活性测定
表达的 Cry2Ad蛋白在浓度 100μg/m l时 ,舞毒
蛾 ,棉铃虫 ,玉米螟的校正死亡率分别为 40. 00% ,
22. 92% , 51. 06% ,其对棉铃虫 ,玉米螟和小菜蛾的
体重抑制率分别为 64. 24% , 96. 94%和 18. 4% ,对
大猿叶甲无活性。
3　讨论
通过扫描电镜观察到 SBT2的晶体呈现大小不
一的双锥体形晶体 ,而已知的 B t菌株库斯塔克亚种
HD1晶体为均一的双锥体形晶体。野生菌株在 1 /2
LB平板培养 20 h后经 10% SDS2PAGE检测 , 130 kD
左右有明显的条带 ,这与 HD1野生菌株中表达的蛋
白分子量大小相当。 SBT2质粒图谱显示其含有 5
个质粒条带 ,与 HD1前 5个质粒条带相似 ,但没有
HD1质粒条带丰富 ,在 8 kb以下 HD1菌株还含有 5
个小质粒条带。利用已报道的 11种 PCR2RFLP鉴
定引物对该菌株进行基因型鉴定 ,结果发现含有的
cry基因为 cry1A a、cry1D a、cry1Hb、cry1Jb、cry1Ka 、
cry1 Ib、cry2A d, 未检测到 cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、
cry8、cry9、cry10类基因。HD1菌株中含有 cry1A a、
cry1A b、cry1A c、cry1 Ia、cry2A a、cry2Ab类基因。说明
该菌株所含基因类型十分丰富 ,但与 HD1明显不
同 ,具有进一步研究和开发的价值。
本研究通过设计 cry2A 类基因全长通用引物 ,
直接从野生菌株 SBT2中扩增得到 cry2Ad基因 ,其
与已知的 cry2A d1基因的同源性高达 99%。C ry2Ad
基因至今已发现 5个 ,这说明 cry2A d基因不仅在自
然界分布较少 ,而且比较保守 ,这与前人 cry2A a保
守性较强的报道相似 [ 9 ]。但是相对于其它 Cry2类
蛋白 , Cry2Ad蛋白的活性尚未见报道。本试验确定
了该基因对鳞翅目害虫舞毒蛾、棉铃虫、亚洲玉米
螟、小菜蛾有低活性 ;对鞘翅目害虫大猿叶甲无活
性。Cry2Ad蛋白对我国其他农业害虫的活性还有
待进一步研究。随着 cry1类基因的大面积应用 ,田
间昆虫产生抗性的风险逐渐增强 ,对与 cry1类基因
不易产生交互抗性的 cry2基因的研究已经受到研
究者的重视 [ 20 ]。本研究首次报道了 cry2A d基因表
达产物的活性。为进一步研究该类基因的杀虫作用
机理及改造应用提供了遗传材料。
致谢 :感谢植物保护研究所梁革梅老师提供亚洲棉铃虫初孵幼
虫 ,何康来老师提供亚洲玉米螟初孵幼虫 ,感谢河北农业大学林学
院杨敏生老师提供舞毒蛾初孵幼虫。
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(下转第 155页 )
051
2009年第 10期 王继雯等 :抗菌肽 hepcidin融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化
乏症和慢性病贫血的防治也具有重要价值。由于
hepcidin化学合成非常困难 ,构建用于 hepcidin蛋白
表达的基因工程菌株 ,并对融合蛋白表达条件加以
研究显得颇为重要。
本试验构建了用于 hepcidin基因表达的载体
pET2hec,将其转化至 E. coli BL21中诱导表达 ,分别
研究了诱导温度、诱导时机、诱导时间和诱导剂用量
对重组融合蛋白 H is2hepcidin表达量的影响。结果
表明 ,在 25℃条件下 ,融合蛋白有较高的表达量 ,原
因是在低温度下更有利于重组蛋白的诱导表达。在
工程菌株培养至 OD600为 016时进行诱导可以增加
重组蛋白的表达量 ,原因可能是菌体培养至 OD600为
016时 ,大肠杆菌进入对数生长期 ,新陈代谢加快 ,
加快了重组蛋白的表达。本试验之所以得出最佳诱
导剂浓度为 012 mmol/L,是因为诱导剂浓度对重组
蛋白的表达影响不大 ,从经济角度看 ,选用 012
mmol/L IPTG为最佳诱导剂浓度更加合适。以 8 h
作为最佳诱导时间 ,是考虑到虽然延长诱导时间可
获得较多的表达蛋白 ,但诱导时间超过 8 h后 ,融合
蛋白就不再有明显增加 ,本研究为 hepcidin的大量
生产和临床应用打下了基础。
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