全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-09-09
基金项目：863（2006AA10A212），973（2003CB114201）计划课题
作者简介：刘晶晶（1982-），女，博士研究生，主要从事 Bt 工程菌及功能基因相关研究工作
通讯作者：黄大昉，研究员，博导；Tel：010-82109842，E-mail：dfhuang@ippcaas.cn
前言
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在自然界中广泛存在，生活环境具有极强多样性，存在于土
壤、昆虫、仓储农产品、绿色植物叶表以及水栖环境中 [1~3]。 Bt 可以产生对多种农业害虫有毒性的晶体蛋白
（Insecticidal crystal protein，ICP），是目前世界上使用范围最广、应用最成功的杀虫微生物。已经发现 Bt 对包
括鳞翅目、鞘翅目和直翅目等在内的 9 个目 500 多种昆虫具有杀虫活性 [4]。 ICP 蛋白由 cry 基因编码，除极
少数 cry 基因定位于染色体 DNA 上，绝大部分毒蛋白是由 Bt 质粒上的基因编码的 [5~7]。 同时，这些质粒还
编码苏云金素、beta-外毒素、杀虫晶体蛋白的调节基因以及结合转移相关基因 [8]。苏云金芽胞杆菌一般含有
1~17 个内生质粒，包括含有杀虫晶体蛋白的质粒以及一些没有明显表型特征的隐含质粒 ，这些质粒大小
在 2~80MD 之间 [9~11]。 由于不同分子量的质粒电泳迁移率不同，Bt 内生质粒模式可以通过琼脂糖凝胶电泳
进行分析。 对 Bt 质粒的分析，可以用来定位苏云金芽胞杆菌质粒编码的 cry 基因等功能基因，并研究质粒
苏云金芽胞杆菌内生质粒提取方法的改进
刘晶晶 1，2 束长龙 2 张杰 2 宋福平 2 黄大昉 3
（1东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家
重点实验室，北京 100193；3中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要： 改进了苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）内生质粒提取技术，提取了Bt库斯塔克亚种、以色利亚
种和一株对鳞翅目害虫有活性的野生菌株的质粒，利用琼脂糖凝胶电泳分析了质粒图谱，进一步检测了质粒的浓度与纯
度。实验结果表明，该方法与传统技术相比，操作简单、耗时短，提取的质粒纯度高、条带清晰，染色体DNA污染较少。为
Bt杀虫基因克隆、质粒特性分析等研究创造了有利条件。
关键词： 苏云金芽胞杆菌 内生质粒 提取 质粒图谱
An Improved Method for Extracting Endogenous Plasmid from
Bacillus thuringiensis Strains
Liu Jingjing1，2 Shu Changlong2 Zha Jie2 Song Fuping2 Huang Dafang3
（1College of Life Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030；2State Key Laboratory of Biology for Plant
Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193；
3Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract： In this report，a novel method was improved for extraction of endogenous plasmids fromBacillus
thuringiensis（Bt）strains，and plasmids of 5 strains were prepared by this method，including 3B.thuringiensis subsp.kurstaki
strain（HD1，HD73 and a crystal negative strain of HD73-），a sort ofB.thuringiensis subsp.israelensis strain（Bt）andB.
thuringiensis isolate S6 with lepidopteran insecticidal activity. The concentration，the purity and the patterns of the
plasmids were analysed. The new method can not only save time，but also produce purer plasmids with clearer patterns，
and decrease contamination from chromosomal DNA. This study creates the advantage for the research on cloning of
pesticidal genes and characterization of endogenous plasmid fromB.thuringiensis.
Key words： Bacillus thuringiensis Endogenous plasmid Extraction Plasmid pattern
2008年第 6期
在不同菌株或不同种之间转移的特点 [12~14]。因此，清晰准确的 Bt 质粒图谱对菌株的鉴定以及质粒缺失突变
株的分析研究有极其重要的作用。 同时，高质量的质粒 DNA 是构建 DNA 文库与克隆质粒编码基因的前提
条件。 传统的碱裂解法制备 Bt 质粒过程繁琐、染色体污染严重，得到的 48kb 以上大质粒无法利用普通琼
脂糖电泳分离，而利用脉冲电泳分析大质粒图谱，不仅耗时长，且条带不清晰、重复性差。针对上述问题，改
进了 Bt 质粒提取方法，利用普通琼脂糖凝胶电泳即可分析 48kb 以上大质粒图谱、且操作省时、简便、质粒
图谱清晰、重复性好，为苏云金芽胞杆菌分子生物学研究创造了有利条件。
1 材料和方法
1.1 菌株及来源
本研究所用 Bt 菌株及不同血清型标准菌株（表 1）。
1.2 培养基
1.2.1 LB 液体培养基 胰蛋白胨 10.0g，酵母提取
物 5.0g，氯化钠 10.0g，加水定容至 1 000ml，pH 7.0，
6.81kg 灭菌 20min。
1.2.2 LB 固体培养基 LB 液体培养基加入 1.3%
琼脂粉，6.81kg 灭菌 20min。
1.3 溶液与试剂
溶液 A：10.0mM/L Tris-HCl，1.0mM/L EDTA，1.0mol/L 蔗糖 ，pH 7.0， 过滤除菌 。 使用时加入溶菌酶 ，
20.0mg/ml。
溶液 B：0.2mol/L NaOH，3%SDS，现用现配。
溶液 C：3.0mol/L NaAc pH 4.8。
溶液 D：6.0mol/L NH4Ac，1.0mg/ml 溴化乙啶。
溶液 E：10.0mM/L Tris-HCl，1.0Mm/L EDTA，1.0mg/ml RNase。
其余试剂按照分子克隆第 3 版配制 [15]。
1.4 苏云金芽胞杆菌质粒提取以及电泳图谱制备
1.4.1 菌体培养与收集 将待测菌种划线接种到固体 LB 培养基上，活化培养过夜。 刮取菌体，用 TE 溶液
洗涤，离心，收集约 100mg 菌体。
1.4.2 原生质体制备 向菌体中加入 100μl 溶液 A 悬浮细胞，总体积约 200μl。 37℃处理 10min。
1.4.3 细胞裂解 向已经制备好的原生质体中加入 400μl 新鲜配制的溶液 B，缓慢混匀，室温处理 5min，
裂解细胞。
1.4.4 质粒提取 向裂解物中加入 300μl 溶液 C，轻轻混匀，冰上放置 5min；12 000g 离心 3min，将上清液
转移至新 2.0ml 离心管内，加入 650μl 异丙醇，轻轻混匀，室温放置 5min；12 000g 离心 10min，弃上清，70%
乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀；加入 200μl 无菌纯水溶解沉淀。
1.4.5 质粒纯化 向上述 DNA 溶液中加入 200μl 的溶液 D，轻轻混匀；再加入 200μl 的 Tris 饱和酚，轻轻
混匀； 加入 200μl 的氯仿 /异戊醇， 轻轻混匀；12 000g 离心 3min， 小心将上层水相转移到一个新的离心管
中，加入 800μl 无水乙醇，轻轻混匀，室温放置 5min；12 000g 离心 10min，弃上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温
晾干；加入 50μl 溶液 E，室温放置 10min。
1.4.6 DNA 浓度及纯度分析 见分子克隆手册第 3 版 [16]。
1.4.7 电泳分析 将上述样品用 1%琼脂糖凝胶进行电泳，电压 60V。 电泳结束后紫外下拍照分析。
2 结果
2.1 苏云金芽孢杆菌质粒纯度分析

  
HD1 kurstaki H3a3b3c
HD73 kurstaki H3a3b3c
HD73cry- kurstaki H3a3b3c
Bti israelensis H14
S6 Unknown Unknown

表 1 Bt 菌株及不同血清型标准菌株
刘晶晶等：苏云金芽胞杆菌内生质粒提取方法的改进 121
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
通过对提取的苏云金芽胞杆菌的质粒样品的紫外光的吸收，测定分析了样品的 DNA 含量与纯度（表 2）。
结果显示， 质粒 DNA 样品的浓度在 393~1 010μg/ml
之间 ； 样品 OD260nm 与 OD280nm 光吸收的比值在 1.8~
2.0 之间，说明获得的 DNA 纯度较高，完全可以满足
基因克隆、鉴定等分子生物学研究需求。
2.2 苏云金芽孢杆菌质粒分析
采用本研究建立的质粒提取与分析方法， 对 3
株标准菌株 、1 株标准菌株的无晶体突变株以及 1
株鳞翅目特异的野生菌株进行了质粒图谱分析 （图
1）。 由图 1 可以看出与 λDNA 电泳迁移率相似的染
色体污染较少，质粒图谱清晰。从 3 个标准菌株的质
粒带型来看 ， 比较同属于库斯塔克亚种的 HD1 与
HD73，发现两者大型质粒 （迁移率小于 λDNA 的质
粒）的带型有较高的相似性，而小型质粒（迁移率大
于 λDNA 的质粒）则存在较大差异。
通过对库斯塔克亚种 HD73 与其无晶体突变株
HD73cry-比较，发现 HD73cry-与野生菌株相比 ，出现
了质粒缺失现象。 推测 HD73 内编码杀虫晶体蛋白
的相关基因定位于缺失的质粒上。野生菌株 S6 与库
斯塔克亚种 HD1 相比， 其大型质粒图谱与 HD1 一
致，而小型质粒仅存在 2 个条带的差异，根据 Arturo[17]对 Bt 各亚种的质粒图谱的比较结果，并分析 S6 对鳞
翅目特异性的杀虫活性特点，推测 S6 可能属于库斯塔克亚种。
3 讨论
生物信息学的高速发展，揭开了全基因组时代的序幕。 无论利用鸟枪法、BAC 文库和 Fosmid 文库等传
统测序方法，或是 Selex、Solexa 等高新技术来获得基因组序列信息，都需要高质量的 DNA 作为基础 [18]。 而
高质量的质粒 DNA，也是获取高通量 Bt 质粒序列信息的前提。本研究与传统碱裂解法相比，节省了大量时
间，并可直接利用琼脂糖电泳分析质粒图谱，带型清晰、完整，避免了繁琐、耗时的脉冲电泳分析。 此外，质
粒制备全程采用常规 2.0ml 离心管进行，利于在实验室进行 Bt 质粒图谱的高通量分析。 并在实际操作中，
尽可能避免了繁琐的移液器量程调整过程，利于建立标准化提取程序，进行大规模的质粒提取工作。
Arturo 与 Jorge 对苏云金芽胞杆菌不同血清型以及相同血清型的标准菌株质粒图谱进行了比较分析，
研究结果表明，除以色列亚种质粒存在一些相同的基本带型，其它亚种菌株即使为相同血清型，质粒带型
也存在明显差异。因此，苏云金芽孢杆菌质粒及其电泳图谱的分析对菌株的分类和生理生化研究具有极其
重要的指导作用。Arturo 的方法可以获得较好的小于 48kb 的质粒图谱，但存在较多的染色体 DNA 的污染，
无法分析与染色体电泳迁移率相近的质粒条带。 如 Bt 以色列亚种，在 Arturo 的方法中 48kb 染色体条带附
近仅有一条电泳迁移率略小的条带，本研究中除该条带外，还可清晰的看到 1 条电泳迁移率略大于染色体
的质粒条带。 此外，通过与 Arturo 的方法中大型质粒（电泳迁移率迁移率小于 λDNA 的质粒）条带的数目、
清晰度比较发现，Bt 库斯塔克亚种 HD1 大型质粒在 Arturo 方法中有 3 条带，且条带不清晰。 本研究中则存
在清晰的 5 条带；Bt 库斯塔克亚种 HD73 大型质粒在 Arturo 方法中有 3 条带，其中一条极浅 [17]，本研究中
存在清晰的 4 条带（图 1）。 上述比较结果充分证明，改进的质粒提取方法，染色体 DNA 污染少，不影响分
子量在 48kb 左右的质粒图谱分析，大型质粒电泳图谱清晰，带型更加完整。

Strain OD


OD

OD / OD


C×50(

S6 0.382 0.197 1.939 955
HD1 0.404 0.214 1.887 1010
HD73cry 0.220 0.112 1.964 550
HD73 0.157 0.083 1.892 393
Bti 0.189 0.095 1.989 473
表 2 苏云金芽胞杆菌质粒 DNA 浓度及纯度分析
*C：质粒 DNA 稀释 50 倍后的浓度（OD260×50）
图 1 苏云金芽孢杆菌质粒电泳图谱
1：λ DNA；2： 野生菌株 S6；3： 库斯塔克亚种标准菌株 HD1 质
粒图谱 ；4： 库斯塔克亚种标准菌株 HD73 的无晶体突变株
HD73 -质粒图谱 ；5：库斯塔克亚种标准菌株 HD73 质粒图谱 ；6：
以色列亚种标准菌株 Bti 质粒图谱
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2008年第 6期
（上接第 119页）
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通过分析质粒 DNA 纯度发现，所提取的质粒 DNA 的 OD260nm/OD280nm>1.8，说明蛋白质杂质去除的较为
彻底。 但该比值接近 2.0，说明存在 RNA 的干扰。 这是由于质粒提取纯化过程中，为了节省时间，仅在电泳
时加入 RNase，使 RNA 未充分去除。 虽然 RNA 的存在对基因克隆和质粒特性研究没有太大的干扰，但是
今后仍将考虑在质粒制备过程中增加 RNA 的去除时间，以获得更加纯净的质粒 DNA 样品。
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