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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):180-187
磷是植物生长过程中的一种主要营养元素，在
土壤中主要以难溶的矿物形态存在［1］。我国土壤全
磷含量较高，耕地土壤一般为 0.02%-0.11%［2］，但
是能被植物直接吸收利用的有效磷含量一般不超
收稿日期 ： 2014-11-17
基金项目 ：国家自然科学基金（31201687）
作者简介 ：于亭，女，研究方向 ：生物大分子的结构与功能 ；E-mail ：m18643173059@163.com
通讯作者 ：杨美英，女，副教授，研究方向 ：土壤解磷微生物化学与分子生物学 ；E-mail ：jlaumeiying@163.com
沙雷氏菌（Serratia marcescens）Yj1 的分离鉴定及菌
体有机磷降解酶的分离纯化
于亭 王春红 张婷婷 汲添 武志海 杨美英
（吉林农业大学，长春 130118）
摘 要 ： 从大豆土壤中分离纯化得到一株具有卵磷脂和乐果降解能力的菌株 Yj1，对该菌株进行鉴定、生长条件优化、酶活
性鉴定以及有机磷降解酶的分离纯化。结果表明，Yj1 与 Serratia marcescens WW4（CP003959.1）的 16S rDNA 相似度为 99%。正交
试验对所需培养基进行优化，得到该菌株的最佳生长条件为甘露糖、蛋白胨和 pH 8 的组合。Yj1 菌株在两种磷源条件下，菌株生
长量均很低，但 72 h 内以大豆卵磷脂为磷源时的菌体生长情况优于乐果。以大豆卵磷脂为磷源时酸性磷酸酶、碱性磷酸酶与有机
磷降解酶活性明显高于以乐果为磷源时的酶活，且 72 h 内碱性磷酸酶活性一直都高于酸性磷酸酶和有机磷降解酶。硫酸铵沉淀法
结合阳离子交换层析成功从 Yj1 菌体中分离纯化了有机磷降解酶，SDS-PAGE 结果显示纯化的蛋白为单一条带。且阳离子交换层析
的提纯倍数是硫酸氨沉淀的 5.303 倍，硫酸氨沉淀为粗酶的 1.416 倍。
关键词 ： 沙雷氏菌 ；Yj1 ；乐果 ；大豆卵磷脂 ；有机磷降解酶
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.027
Isolation and Identification of Serratia marcescens Yj1，and Separation
and Purification of Organophosphate Degrading Enzymes
Yu Ting Wang Chunhong Zhang Tingting Ji Tian Wu Zhihai Yang Meiying
（Jilin Agricultural University，Changchun 130118）
Abstract: The strain Yj1 isolated and purified from the soybean soil could degrade soy lecithin and dimethoate. The 16S rDNA
identification of the strain, optimization of growth conditions and examination of enzyme activities were performed and organophosphate
degradation enzyme from Yj1 was separated and purified. The results revealed that the similarity of 16S rDNA in Yj1 and Serratia marcescens
WW4（CP003959. 1）was 99%. The orthogonal experiment for the culture medium demonstrated that the optimal growth condition of Yj1
was the combination of mannose, peptone and pH8. The growth rate of Yj1 was poor in either of 2 phosphorus sources ；however, the growth
rate in soy lecithin was better than that in the dimethoate within 72 h. Moreover, the activities of acid phosphatase, alkaline phosphatase and
organophosphate degrading enzyme（ODE）were higher when the soybean lecithin as the sole phosphorus source than those of dimethoate, and
the activity of alkaline phosphatase was obviously greater than that of acid phosphatase and ODE within 72 h. ODE was successfully purified
from Yj1 by combining ammonium sulfate precipitation and SP Sepharose Fast Flow. SDS-PAGE results showed that the purified protein was in
a single band. The purified multiple by SP Sepharose Fast Flow was 5. 303 times as many by ammonium sulfate precipitation, and by the latter 1.
416 times as many by crude enzyme.
Key words: Serratia marcescens ；Yj1 ；dimethoate ；soy lecithin ；organophosphate degrading enzyme
2015,31(7) 181于亭等 ：沙雷氏菌（Serratia marcescens）Yj1 的分离鉴定及菌体有机磷降解酶的分离纯化
过全磷量的 5%［3］。大部分磷肥与土壤中的 Ca2+、
Fe 3+、Fe 2+、Al 3+ 等结合，形成难溶性磷酸盐，因
此全国 74% 的耕地土壤缺磷，严重影响着植物生
长。长期以来，为了提高农产品的产量，人们大量
使用化学肥料和农药，磷肥在施用后往往很快就被
固定形成无效态磷［4，5］，造成了作物的低吸收和
磷元素在土壤中的大量积累［6］。有机磷农药的有
效利用率也仅为 20%-30%，水田中施用的有机磷
农药几乎有 90% 左右都残留在农田中［7，8］，这些
难溶或不溶性的有机磷化合物造成了严重的环境
污染。
解磷菌能使土壤中难溶性或不溶性的磷转化
成易于被植物吸收利用的磷，从而提高土壤供磷水
平［9］，同时还能促进农作物对植物根系锌、铜等其
它营养元素的吸收、增强植物抗病能力，并减少环
境污染［10］。目前报道的解磷菌主要有细菌［11］、真
菌［12］ 和 放 线 菌［13］， 研 究 较 多 的 是 细 菌。 乐 果
（dimethoate）是广泛使用的有机磷农药之一，为中
等毒性、内吸性有机磷类杀虫剂、杀螨剂，在土壤
中很容易沉降聚集，污染农畜渔果产品，并通过食
物链的富集作用转移到人体，对人体产生危害［14］。
目前分离到的乐果降解菌有蜡状芽孢杆菌（Bacillus
cereus）［15］， 铜 绿 假 单 胞 菌（Pseudomonas aerugin-
osa）［16］，即绿脓杆菌，不动菌属（Acinetobacter）［17］，
沙门氏菌、阴沟肠杆菌、枯草芽孢杆菌［18］等。
有机磷降解菌不仅种类繁多，并且对于不同
的土壤、水域和植物的类型，解磷机制也不尽相
同［19，20］。有机磷降解酶主要是水解酶类，通过切
断 有 机 磷 化 合 物 中 如 ：P-O 键、P-F 键、P-S 键、
P-CN 等分子键，使之成为无毒的、溶于水的小分
子，而且一种有机磷降解酶往往能降解多种有机磷
化合物［21］。本研究从大豆土壤中分离到一株可降
解卵磷脂的有机磷解磷菌，命名为 Yj1，经过 16S
rDNA 鉴定后对其生物学特性进行研究时发现，该
菌株还可以有效降解乐果。进一步对该菌株降解卵
磷脂和乐果的特性进行研究，以期为土壤中有机磷
化合物的有效利用以及有机磷农药的降解提供有效
菌源，并为有机磷解磷菌剂的开发与应用提供基础
数据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试土壤大豆根际土壤于 2013 年 2 月，从吉林
农业大学大豆试验田（经度 125 19、纬度 43 43）
进行采集，4℃保存。
1.2 方法
1.2.1 菌株的筛选与纯化 取 1 g 土壤样品，加入
100 mL 灭菌的有机磷液体培养基，30℃，135 r/min
摇床培养。培养 10 d 后，取 1 mL 悬浊液逐级稀释
至 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，分别取以上各浓度
样品 100 μL 涂布于以卵磷脂为有机磷源的固体培养
基，30℃培养 24-48 h。选择有较大溶磷圈的单菌落，
反复纯化 4 次，直至形成均一的菌落，将其转至斜
面培养至菌苔长出，置于 4℃保存。
1.2.2 菌株鉴定 将纯化后的有机磷解磷菌单菌落
接种至 LB 液体培养基中，135 r/min，30℃恒温培养
过夜，12 000 r/min、4℃离心 10 min，收集菌体。进
行细菌总 DNA 的提取，具体方法参照萨姆克鲁斯
J 拉塞尔［22］的方法。以菌株总 DNA 为模板，利用
细菌 16S rDNA 通用引物进行 PCR，引物序列 ：R ：
5-AAGGAGGTGATCCAGCC-3，F ：5-AGAGTTTGA-
TCCTGGCTCAG-3。反应条件 ：98℃预变性 5 min ；
94℃变性 45 s，57℃退火 45 s，72℃延伸 2 min，33
个循环；后延伸 7 min，4℃保存。反应体系为：模板 0.2
μL， 上 下 游 引 物 F、R 各 0.2 μL，LA Taq buffer 2
μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，eTaq 聚合酶 0.2 μL，
无菌去离子水补至 20 μL。PCR 产物经 1% 琼脂糖凝
胶电泳鉴定。同时将产物纯化回收后，送上海生物
工程有限公司进行测序。测序序列与 GenBank 进行
BLAST 同源性比较，并利用 Mega5.10 软件与相关菌
株的 16S rDNA 构建系统发育树。
1.2.3 菌株生长条件的优化 以有机磷培养基为基
础，对碳源、氮源及 pH 值进行优化，采用 L93
3 正
交设计试验优化，供试因素及水平见表 1。挑取 Yj1
单菌落接种于 5 mL LB 培养基中，OD600=0.6 时，种
子液按 1% 接种量接种于以大豆卵磷脂为有机磷源
的培养基中，30℃，150 r/min 培养 72 h，每隔 6 h 取样，
利用分光光度计测定 OD600 的吸光值。并对 36 h 生
长量数据采用 SPSS16. 0 统计软件和 Excel 进行方差
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7182
的分析，进而确定碳源、氮源及 pH 值的最佳组合。
表 1 正交试验供试因子及水平
水平
因子
碳源 10 g/L 氮源 0.5 g/L pH 值
1 葡萄糖 蛋白胨 7
2 甘露糖 硫酸铵 8
3 蔗 糖 硝酸铵 9
1.2.4 不同有机磷源中菌体生长曲线的测定 以正
交试验中确定的最佳培养条件为基础，以大豆卵磷
脂、乐果为有机磷源的未接菌培养基为对照。另取
150 μL 种子液（种子液的制备同上）分别接入 150
mL 两种磷源的有机磷培养基，30℃，150 r/min 进行
培养，每 12 h 取样一次，测定 OD600 的吸光值。
1.2.5 酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性的测定 该酶
活测定按照伊鋆［23］的方法进行。酶活测定菌体培
养同上，每隔 12 h 吸取 1 mL 发酵液，加入 pH 值为 6.5
的 MUB 试剂，再加 0.025 mol/L 对硝基苯磷酸二钠
溶液 1 mL，震荡 10 s。37℃反应 1 h 后，加入 1 mL 0.5
mol/L 氯化钙溶液和 4 mL 0.5 mol/L 氢氧化钠溶液，
震荡并过滤悬液。将滤液在 420 nm 处比色，此为酸
性磷酸酶活性测定方法 ；碱性磷酸酶时所用 MUB 试
剂 pH 为 8.0，其它步骤同酸性磷酸酶测定方法。酸性、
碱性磷酸酶时以 A420/min 光吸收值增加 0.001 为一
个酶活力单位。
1.2.6 有机磷降解酶活性的测定 该酶活测定按照
金彬明［24］的方法进行。菌液的培养同上，每隔 12
h 取菌液 0.9 mL，8 000 r/min 离心 2 min，去上清，
用 0.9 mL pH 7.5 的 20 mmol/L 的 Tris-HCl 悬起，为
粗酶液。
取 0.1 mL 的 0.05 mol/L 乐果溶液、0.9 mL 的粗
酶液与比色管中，25℃下反应 45 min，加入 1 mL
10% 三氯乙酸终止反应，在加入 1 mL 10% 碳酸钠
溶液显色，测定 A405 光吸收值。有机磷降解酶时以
A405/min 光吸收值增加 0.001 为一个酶活力单位。
1.2.7 有机磷降解酶的纯化 将 OD600=0.6 的 Yj1 种
子液以 1‰的量接入 1 L 卵磷脂为磷源的有机磷培
养基中，30℃，150 r/min，培养 48 h 后 4℃、4 000
r/min 离心 30 min 离心收集菌体。每克菌以 15 mL 20
mmol/L 的 Tris-HCl（pH7.5）缓冲液悬起，每毫升溶
液加入 1 mg 溶菌酶充分搅拌后 4℃静置 30 min，冰
浴超声波破碎（1 400 W、工作 5 s、间歇 9 s、50 次
循环）。4℃下 10 000 r/min 离心 20 min。取上清逐步
进行 10%、20%、40% 和 65% 的硫酸铵沉淀。沉淀
用 40 mL 的 Tris- HCl（20 mmol/L pH7.5）缓冲液悬
起后，进行 Sephadex G-25 Fine 层析柱脱盐，取流川
液再进行阳离子交换层析（SP Sepharose Fast Flow），
分别以含有 0.1 mol/L、0.2 mol/L 和 0.5 mol/L 三个浓
度 NaCl 的 Tris-HCl（20 mmol/L，pH7.5） 进 行 阶 段
洗脱；利用层析系统（AKTAPRIME）检测流出组分。
取流川及出峰时的流出液体进行有机磷降解酶活力
测定，酶活测定方法同上。其中 0.2 mol/L NaCl 的
Tris-HCl 洗脱液的流出组分具有有机磷降解酶活性，
SDS-PAGE 检测分离结果。
2 结果
2.1 有机磷解磷菌的分离与纯化
以大豆卵磷脂为磷源，从吉林农业大学大豆试
验田土壤中分离到一株具有明显解磷效果的菌株，
将该菌株命名为 Yj1。在以大豆卵磷脂（图 1-A）和
乐果（图 1-B）为有机磷源的固体培养基中生长时，
均有明显透明圈。对该菌株的降解稳定性进行实验，
经过多次的连续传代实验，菌株遗传特性比较稳定。
A B
A ：大豆卵磷脂为磷源 Yj1 溶磷效果 ；B ：乐果为磷源 Yj1 溶磷效果
图 1 大豆卵磷脂和乐果为磷源 Yj1 溶磷效果
2.2 细菌16S rDNA鉴定和及系统发育树的构建
以菌株 Yj1 的基因组 DNA 为模板，利用细菌
16S rDNA 引物进行 PCR 扩增，得到长度约为 1.5 kb
的扩增产物。对其进行回收，并测序。将测序序列
利用 GenBank DNA 数据库进行 BLAST 同源性比较，
结果表明该菌株基因序列与 Serratia marcescens WW4
2015,31(7) 183于亭等 ：沙雷氏菌（Serratia marcescens）Yj1 的分离鉴定及菌体有机磷降解酶的分离纯化
（CP003959.1）有较高的同源性，相似度为 99%，因
此该菌株被鉴定为沙雷氏菌（Serratia marcescens）。
利用 Mega5.10 构建了 Yj1 与文献中相关有机磷
农药降解细菌的系统发育树。由图 2 可知，31 株溶
磷菌的 16SrDNA 序列在系统发育树中主要分为两个
大的分支。其中，构成第一个分支的菌以芽孢杆菌
属为主体 ；第二个分支菌株以假单胞菌属为主体。
Yj1 属于第一个分支，与芽孢杆菌属和假单胞菌属
形成一簇。
2.3 Yj1菌株发酵条件的优化
对 Yj1 菌株生长条件中 pH 值、碳源、氮源进
行 3 因素、3 水平的正交试验，结果如表 2，对所得
结果进行方差分析（表 3）。从表 2 看出，pH 值、碳
源、氮源对 Yj1 的生长均有影响。培养基的初始 pH
值在一定程度上影响菌株的生长量，pH 值为 8 时菌
株生长量最大。在以甘露糖为碳源时，菌株生长量
最大，葡萄糖和蔗糖为碳源时菌株生长量较低。氮
源不同菌株的生长量明显不同，菌株在以蛋白胨为
氮源时生长量最高，硝酸铵、硫酸铵为氮源时生长
量低于前者。综合正交试验结果与方差分析结果表
明，影响供试菌株生长量的主次顺序为碳源 > pH 值
> 氮源，本试验的最优组合为 A2B2C1，即为甘露糖、
pH8、蛋白胨。
2.4 不同磷源条件下Yj1生长曲线的测定
以大豆卵磷脂和乐果分别为磷源时，Yj1 的生
长曲线见图 3。从图 3 可以看出，在以两种有机磷
Bacillus cereus strain HY-1 eu915686.1
Bacillus cereus strain HY-4 eu915688.1
Bacillus cereus strain HY-2 eu915687.1
Bacterium JW-64-1 FJ848571.1
Sphingopyxis sp. DLP-2 JF833116.1
Delftia sp. ZM-1 EF061135.1
Delftia sp. ZM-1 EF061135.1
Serratia marcescens strain DAP33 EU302858
Pseudomonas plecoglossicida EU734169.1
Bacterium HP1 KC961631.1
Hyphomicrobium sp. MAP-1 GQ131420.1
Pseudomonas putida strain A5.5 DQ886481.1
Pseudomonas sp. LPx HM488993.1
Paracoccus sp. L3 EU004590.1
Burkholderia sp. CP7 JF280145.1
Methylobacterium MAP-2 HM146925.1
Pseudomonas nitroreducens strain HP2 KC961632.1
Ochrobactrum sp. Yw18 DQ468102.1
Acinetobacter sp. Strain ZX01 JX843792.1
Yj1 Serratia marcescens
Bacillus sp. TAP-1 HQ156466.1
Pseudomonas stutzeri CCUG 11256 U26262.1
Pseudomonas balearica SP1402 U26418.1
Serratia marcescens strain HL1 EU371058
Ochrobactrum sp. CP1 HQ589348.1
Serratia marcescens strain B4 GQ981178
Enterobacter ludwigii culture-collection CGMCC:3092 GQ380575.1
Enterobacter ludwigii culture-collection CGMCC:3092 GQ380575.1
Pseudomonas sp. CP6 JF280144.1
Paracoccus sp. M-1 DQ307757.1
Pseudomonas putida strain M1 GQ499333.1
Pseudomonas putida strain M1 GQ499333.1 2 999999
99
99
96
63
50
99
36
32
28
27
25
24
24
17
15
7
7
6
5
4
3
1
0
0
0
0
1
图 2 Yj1 系统发育树构建
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7184
化合物为磷源的培养基中生长时，菌体生长曲线均
呈现先增加后下降的趋势。大豆卵磷脂为磷源时，
24 h 菌体生长进入平台期。在开始的 48 h 菌体生长
量达到最大。乐果为磷源时，菌体初期生长率要明
显低于大豆卵磷脂中的生长率，60 h 菌体生长量达
到最大值，之后呈现下降趋势。两种磷源条件下，
菌株生长量均很低，OD600 值不超过 0.4。但是 72 h
内以大豆卵磷脂为磷源时的菌体生长情况优于乐果。
2.5 不同磷源条件下Yj1菌株解磷过程中酶活性的
测定
当以大豆卵磷脂为磷源测定酸性磷酸酶、碱性
磷酸酶与有机磷降解酶活性时，酶活性均呈先增长
后下降的趋势（图 4），酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和
有机磷降解酶分别在 36、12 和 48 h 出现峰值，酶
活分别为 948 IU、694 IU 和 301 IU。72 h 内有机磷
降解酶活性低于酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性。
当以乐果为磷源时，酸性磷酸酶活性最大值出
现的时间与大豆卵磷脂为磷源时相同。而碱性磷酸
酶和有机磷降解酶活性出峰时间与大豆卵磷脂明显
不同，分别是 60 h 和 12 h。72 h 内碱性磷酸酶活性
一直都依次高于酸性磷酸酶和有机磷降解酶。而且
从图 4 可看出，72 h 内以大豆卵磷脂为磷源时的酸
性磷酸酶、碱性磷酸酶活性与有机磷降解酶活性明
显高于以乐果为磷源时的酶活。
2.6 有机磷降解酶的纯化及酶活分析
为了进一步明确 Yj1 菌株中有机磷降解酶的特
性，收集以大豆卵磷脂为磷源、生长 48 h Yj1 所有
菌体，超声波破碎后进行硫酸氨沉淀以及阳离子交
换层析分离纯化，并对有机磷降解酶活性进行测定。
结果（图 5）表明，在 65% 硫酸铵的沉淀中测得有
机磷降解酶的活性，过 G-25 脱盐柱后在阳离子交换
层析过程中，0.2 mol 氯化钠洗脱液中酶活较强。以
SDS-PAGE 检测蛋白结果显示纯化的蛋白为单一条
带。
对分级纯化的酶液进行酶活测定，结果见表 4。
粗酶、硫酸铵沉淀以及阳离子交换洗脱液有机磷降
解酶的比活力分别为 57.270、81.100 和 430.107。提
纯倍数相比，阳离子交换层析是硫酸氨沉淀的 5.303
倍，硫酸氨沉淀仅为粗酶的 1.416 倍。
3 讨论
田 间 长 期 施 用 磷 肥 及 农 药 在 造 成 土 壤 中 磷
表 2 L933 正交实验结果
序号
A B C
生长量
pH 碳源 氮源
1 7 葡萄糖 蛋白胨 0.361
2 7 甘露糖 硫酸铵 0.293
3 7 蔗 糖 硝酸铵 0.309
4 8 葡萄糖 硫酸铵 0.472
5 8 甘露糖 硝酸铵 0.417
6 8 蔗 糖 蛋白胨 0.221
7 9 葡萄糖 硝酸铵 0.686
8 9 甘露糖 蛋白胨 0.442
9 9 蔗 糖 硫酸铵 0.335
K1 0.963 1.519 1.024 -
K2 1.110 1.152 1.100 -
K3 1.463 0.865 1.412 -
K1 0.321 0.506 0.341 -
K2 0.370 0.384 0.367 -
K3 0.488 0.289 0.471 -
R 0.167 0.218 0.130 -
最优组合 A2 B2 C1 -
主次顺序 甘露糖 > pH 8> 蛋白胨
表 3 正交结果方差分析
方差来源 平方和 自由
度 /df
方差估
计值 /ms
F P 值 显著性 /Sig
pH 0.044 2 0.022 0.917 0.528 -
碳 源 0.072 2 0.036 1.500 0.374 *
氮 源 0.028 2 0.014 0.583 0.666 -
误差效应 0.140 6 0.023 - - -
总 和 0.284 12 0.024 - - -
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20O
D
٬
0.15
0.10
0.05
0
0 12 24ษޫᰦ䰤h36 48 60 72བྷ䉶থ⼧㜲Ҁ᷌
图 3 不同磷源时菌株 Yj1 生长曲线
2015,31(7) 185于亭等 ：沙雷氏菌（Serratia marcescens）Yj1 的分离鉴定及菌体有机磷降解酶的分离纯化
素积累的同时，对环境也造成了极大的污染。解
磷微生物可以有效的分解土壤中的无效态磷，释
放 植 物 可 以 吸 收 利 用 的 磷 素［25］。 研 究 发 现， 假
单 胞 菌 属（Pseudomonas sp.）LPx［26］ 和 副 球 菌 属
（Paracoccus sp.）L3［13］能够降解乐果 ；降解毒死蜱
的 有 人 苍 白 杆 菌（Ochrobactrum anthropi）CP1［27］、
假 单 胞 菌 属（Pseudomonas sp.）CP6［27］ 和 伯 克 霍
尔德氏菌属（Burkholderia sp.）CP7［27］；生丝微菌
属（Hyphomicrobium sp.）MAP-1［27］ 和 甲 基 杆 菌 属
（Methylobacterium sp.）MAP-2［28］能够降解甲胺磷 ；
寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）PF32［29］能够降
解甲基对硫磷， 黏 质 沙 雷 氏 菌（Serratia marcescens
strain）HL1［30］、DAP33［30］ 和 B4［30］ 等。 本 实 验
从大豆根际土壤中分离得到的沙雷氏菌（Serratia
marcescens）Yj1 除了能够降解大豆卵磷脂之外，对
有机磷农药乐果也具有一定的降解能力。
碳源，氮源和 pH 值在一定程度上影响着微生
物的生长。赵小蓉［31］研究发现，曲霉 2TCiF2 在蔗
糖为碳源时溶磷活力最高，节杆菌 1TCRi7 只有在葡
萄糖为碳源时才具有溶磷能力。陈燕飞［32］研究显示，
大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均在 pH 为 7 的条件下
生长情况最佳。本实验以碳源、氮源和 pH 值为因
素进行了三因素三水平的正交试验，对菌株的发酵
条件进行优化。得出影响供试菌株生长量的主次顺
序为碳源 > pH 值 > 氮源。这与曲霉 2TCiF2 的碳源
生长条件实验结果一致。
钟传青等［33］研究表明，解磷微生物产生的植
酸酶、核酸酶和磷酸酶等加速了植酸、核酸、磷脂
等含磷有机化合物的分解，促进磷素释放，可以提
高植物磷素营养，且贫磷条件可以促进酸性和碱性
磷酸酶活性的增加。目前，关于酸性磷酸酶与碱性
磷酸酶特性的研究较多［34］。本实验对大豆卵磷脂和
乐果为磷源时的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶与有机磷
降解酶的活性进行了测定。结果表明，两种磷源条
件下 0-72 h 内，有机磷降解酶的活性低于酸性磷酸
䞨ᙗ⼧䞨䞦ᴹᵪ⼧䱽䀓䞦⻡ᙗ⼧䞨䞦䞦⍫ᙗ μmol·g·h-1
0
200
400
600
800
1000
1200
0 12 24 36 48 60 72ษޫᰦ䰤h
A 䞨ᙗ⼧䞨䞦ᴹᵪ⼧䱽䀓䞦⻡ᙗ⼧䞨䞦䞦⍫ᙗ μmol·g·h-1
0
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B
图 4 大豆卵磷脂（A）和乐果（B）分别为磷源时 Yj1 的酶活性测定
100
kD
M 1 2 3 4
70
50
40
30
25
14
ⴞⲴ㳻ⲭ
M ：marker ；1 ：流川 ；2 ：0.1 mol/L NaCl（1）；3 ：0.1 mol/L NaCl（2）；
4 ：0.2 mol/L NaCl
图 5 纯化得到的有机磷降解酶电泳图
表 4 酶活力损失表
样 品 总活力 /
IU
总蛋白浓
度 /（mg·mL-1）
比活力 提纯倍数
粗 酶 185 3.320 57.270 -
硫酸铵沉淀 103 1.270 81.100 1.416
阳离子交换层析 80 0.186 430.107 5.303
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7186
酶和碱性磷酸酶，在 48 h，大豆卵磷脂为磷源时的
有机磷降解酶活性高是乐果为磷源时的 6 倍。
刘玉焕等［35］从曲霉菌中分离纯化出有机磷农
药降解酶，此酶对有机磷农药乐果具有较好降解作
用。金彬明等［24］从海洋微生物 M-1 中分离纯化出
有机磷降解酶，最适 pH7.5。Munnecke［36］发现有机
磷农药降解酶的降解效果远远胜于微生物本身，特
别是对低浓度的农药。因此，有机磷农药降解酶目
前已被公认为是消除农药残留的最有潜力的新方法。
所以本实验以大豆卵磷脂为磷源，通过硫酸铵沉淀
法和阳离子交换层析法对有机磷降解酶进行了纯化，
提纯后的酶活分别为粗酶活的 1.416 和 7.510 倍。与
金彬明所纯化出的能够降解甲基对硫磷的有机磷降
解酶不同，本实验所纯化出的能够降解乐果的有机
磷降解酶与阳离子交换柱结合，带正电荷，且此蛋
白对有机农药乐果有较好的降解作用。
4 结论
本实验从大豆土壤中筛选并纯化得到了一株具
有稳定降解有机磷的沙雷氏菌（Serratia marcescens）
Yj1。该菌株的最佳培养条件为 ：pH8，以甘露糖为
碳源，以蛋白胨为氮源。以大豆卵磷脂为有机磷源
时菌体生长良好。碱性磷酸酶的活性优于酸性磷酸
酶以及有机磷降解酶的活性。通过硫酸铵沉淀法和
阳离子交换层析法，从 Yj1 菌体纯化获得了单一条
带的有机磷降解酶。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）