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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(6):183-188
哈 氏 弧 菌（Vibrio harveyi） 是 一 种 革 兰 氏 阴
性、发光的海洋浮游细菌，广泛分布于近岸温暖的
海水、海洋沉积物、海洋动物的体表等各种海洋场
所［1］，是近 10 多年才被认识的水产养殖动物重要
的条件致病菌。暴发性弧菌病是对虾的一种严重疾
病，曾引起多个国家对虾养殖的大面积死亡，如墨
西哥［2］、菲律宾［3］、澳大利亚［4］、中国［5］等，给
对虾养殖造成灾难性的经济损失［6］。该菌同时能够
感染大西洋棘白鲳（Chaetodipterus faber）［7］、大黄
鱼（Pseudosciaena crocea）［8］、斜带石斑鱼（Epinephelus
coioides）［9］等多种养殖鱼类。随着海水养殖业的迅
速发展，弧菌病的流行也越来越多。
收稿日期 ：2014-10-22
基金项目 ：广东省教育厅高等学校高层次人才项目
作者简介 ：朱帆，女，硕士研究生，研究方向 ：水产经济动物病害 ；E-mail ：15622071756@163.com
通讯作者 ：丁燏，男，博士，教授，研究方向 ：水产经济动物免疫学及病害控制 ；E-mail ：dingy@gdou.edu.cn
哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达
朱帆1，2，3  丁燏1，2，3  鲁义善1，2，3  简纪常1，2，3  吴灶和2，3，4
（1. 广东海洋大学水产学院，湛江 524088 ；2. 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088 ；3. 广东省教育厅水产
经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088 ；4. 仲恺农业工程学院，广州 510225）
摘 要： 经克隆哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶（GR）基因，并构建其原核表达载体，以获得相应的表达蛋白。将 GR 和 pET-32a（+）
通过 BamH I 和 Xho I 双酶切后，体外用 T4 连接酶连接，构建重组质粒 pET-GR；然后转化至大肠杆菌 BL21（DE3）中，利用异丙基 -β-D-
硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，应用 SDS-PAGE 分析表达情况和表达条件。SDS-PAGE 电泳获得分子量约为 68.9 kD 融合蛋白条带。
在 E.coli BL21（DE3）中重组质粒 pET-GR 的表达条件为 28℃，0.7 mmol/L 的 IPTG 浓度诱导 4 h 表达量最高，且主要以包涵体形
式表达。哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因在大肠杆菌中获得了高效表达。
关键词 ： 哈氏弧菌 ；谷胱甘肽还原酶 ；基因克隆 ；原核表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.029
Cloning and Prokaryotic Expression of Glutathione Reductase Gene in
Vibrio harveyi
Zhu Fan1，2，3 Ding Yu1，2，3 Lu Yishan1，2，3 Jian Jichang1，2，3 Wu Zaohe2，3，4
（1. Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088 ；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and
Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088 ；3. Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of
Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088 ；4. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225）
Abstract: The purpose of this study is to clone glutathione reductase（GR）gene from Vibrio harveyi, construct the prokaryotic expression
vector of it, and obtain the corresponding expressed protein. Digested GR and pET-32a（+）were cut with the double enzymes BamH I
and Xho I, then ligated with T4 ligase to construct the recombinant plasmid pET-GR. Then pET-GR was transformed into Escherichia coli BL21
（DE3）, which was induced by IPTG, and their expressions were analyzed by SDS-PAGE. An approximately 68.9 kD exogenous protein was
observed on the SDS-PAGE. The optimal expression condition for the recombinant plasmid pET-GR was that the recombinant E. coli BL21
（DE3）was induced for 4 h at 28℃ by 0. 7 mmol/L of IPTG and it expressed in E. coli as the inclusion bodies. The conclusion of the study is
that GR gene from V. harveyi can efficiently express in E. coli.
Key words: Vibrio harveyi ；glutathione reductase ；gene cloning ；prokaryotic expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6184
目前，抗生素仍然是控制弧菌病的主要手段，
然而由于抗生素的大量使用导致耐药菌的出现，使
弧菌病的控制变得更加困难［10，11］。细菌耐药的形
成机制有目标靶蛋白的修饰、主动药物转运系统、
细胞外膜通透性的改变等［12，13］，有研究表明，细
菌在抗生素的刺激下会产生氧化应激，细胞内产
生过量的氧化物和自由基（Reactive oxygen species，
ROS），导致细胞内的氧化和抗氧化失去平衡，从而
引起细胞损伤［14，15］。因此细菌细胞对活性氧和自
由基的清除可能是耐药性形成的一个原因。谷胱甘
肽（Glutathione，GSH）是广泛存在于动植物、微生
物细胞内重要的抗氧化剂，能够有效清除活性氧自
由基，维持细胞内稳定的氧化还原状态［16，17］。GSH
参与的大部分反应都是还原态形式，还原型 GSH 失
去电子形成氧化型谷胱甘肽（Glutathione oxidized，
GSSG）， 谷 胱 甘 肽 还 原 酶（Glutathione reductase，
GR）以还原型辅酶Ⅱ（NADPH）作为电子供体还原
GSSG 形成 GSH［18］。而 GSH 的抗氧化能力主要取决
于细胞内 GSH 的浓度和 GSH/GSSG 的比率［19］，因
此 GR 是 GSH 抗氧化作用中的重要组成部分，与细
菌的耐药性形成也密切相关。
本实验构建含哈氏弧菌 GR 基因的大肠杆菌
BL21（DE3）重组菌株，并对融合蛋白表达的 IPTG
诱导条件进行优化，旨为进一步研究 GR 的功能特
别是在细菌耐药性中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 和 质 粒 哈 氏 弧 菌（Vibrio harveyi）
ZJ0603，E.coli DH5α 和 E.coli BL21（DE3） 均 由 本
实验室保存 ；克隆质粒 pMD18-T，内切酶 BamH I，
Xho I 均购自 TaKaRa 公司；原核表达质粒 pET-32a（+）
由本实验室保存。
1.1.2 主要试剂 细菌基因组 DNA 提取试剂盒，
DNA 凝胶回收纯化试剂盒，购自 Thermo 公司 ；PCR
试剂盒，T4 连接酶，购自 TaKaRa 公司 ；PCR 引物
由上海生工合成 ；BamH I、Xho I 均购自大连宝生物
公司。
1.2 方法
1.2.1 GR 基因克隆 使用细菌 DNA 提取试剂盒，
提取哈氏弧菌基因组，根据 GenBank 中已发表的
哈氏弧菌 VIBHAR_00523 的 GR 基因序列（登录号
5552818）， 利 用 Primer 5.0 设 计 引 物，grs 5-CGGG
ATCCATGGCGACTCATTTTGATTAT-3（ 酶 切 位 点
BamH I）gra 5-CCGCTCGAGCTAACCTGTCATGGT
AACGAAC-3（酶切位点 Xho I）。以基因组 DNA 为
模板扩增 GR 的 ORF，PCR 程序为 ：94℃预变性 4
min ；94℃ 40 s，61℃ 40 s，72℃ 1 min，28 个循环 ；
72℃，7min；4℃ forever。PCR 结束后取产物进行 1.0%
琼脂糖凝胶电泳检测，并回收 PCR 产物，-20℃保存。
1.2.2 PCR 产物检测 将回收的 PCR 产物 16℃过夜
连接到 pMD18-T 载体，命名为 pMD18-gr，取 10 μL
连接产物转化至 E.coli DH5α 感受态细胞［20］；转化
产物涂布于含氨苄青霉素的 LB 琼脂平板，37℃培
养 8-10 h。挑取单个转化菌落，接种于 1 mL 含氨苄
青霉素的 LB 液体培养基中，37℃ 200 r/min 培养 1-2
h，菌落 PCR 检测阳性的单克隆送至上海生工测序
部测序。
1.2.3 pET-gr 目标载体的构建 测序结果比对正确
后，提取重组质粒 pMD18-gr 和质粒 pET-32a（+），
经过双酶切后用 T4 DNA 连接酶将酶切后的目的片
段和 pET-32a（+）连接构建重组质粒，命名为 pET-
gr，再转入受体菌 E.coli BL21（DE3），PCR 检测阳性
克隆并测序。
1.2.4 重组目标蛋白的诱导表达 将含有重组质粒
pET-gr 的大肠杆菌 BL21 按 1∶50 接种于含氨苄抗性
的 LB 液体培养基中 37℃ 200 r/min 培养。当 OD600
达到 0.4-0.6 时，加 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L，继
续培养 4 h。取 1 mL 菌液于 1.5 mL EP 管中，10 000
r/min 离 心 2 min， 弃 上 清， 菌 体 经 预 处 理 后 进 行
SDS-PAGE 分析。以同样的方法诱导含空质粒 pET-
32a（+）的 Ecoli BL21（DE3）作对照 ；并从时间、
温度、IPTG 浓度 3 个方面探索目标蛋白表达的最佳
条件。IPTG 浓度 ：其他培养条件不变时，设置不同
的 IPTG 浓度 0.1、0.2、0.4、0.7 和 1.0 mmol/L 诱导，
分别处理菌体进行 SDS-PAGE 分析 ；时间 ：其他培
养条件不变时，在诱导后的 2、4、6、8 和 10 h 分
别取样，分别处理菌体，进行 SDS-PAGE 分析；温度：
其他培养条件不变时，在不同温度 28℃，37℃条件
下诱导培养，分别收集菌体后利用超声波破碎，超
2015,31(6) 185朱帆等：哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达
声程序为 ：超声破碎 6 s，间歇 6 s，保护温度设置
为 37℃，直至菌液澄清，然后离心收集上清和沉淀
进行 SDS-PAGE 分析。
2 结果
2.1 目的基因ORF克隆与分析
设计的 GR 引物，经 PCR 扩增分别得到 1 000
bp 左右的条带（图 1-A），连接至 pMD18-T vector 后
转化入 E.coli DH5α，菌落 PCR 扩增的条带大小与之
相符（图 1-B）。
2.2 原核表达
2.2.1 原核表达载体的构建 克隆的 GR 基因连接
到 pET-32a（+）转化至 E.coli BL21（DE3）感受态
细胞中，阳性菌落的 PCR 鉴定有约 1 356 bp 的亮带
（图 3-A），提取质粒经 Xho I 和 BamH I 双酶切鉴定（图
3-B），出现的条带大小与预期结果一致，测序并分
析证明原核表达载体 pET32-gr 构建成功。
2.2.2 重组质粒的诱导表达 含重组质粒 pET-gr 的
大肠杆菌 BL21 经 IPTG 诱导，得到约 68.9 kD 的融
合蛋白，其中预计 GR 分子量为 48.9 kD，pET-32a（+）
表达的融合标签约为 20 kD ；没有诱导的含重组质
粒的 E.coli BL21（DE3）和诱导的含 pET-32a（+）空载
体的 E.coli BL21（DE3）作为对照，未发现目的蛋
白表达（图 4），因此目的基因表达成功。
GR 基因表达的条件优化结果表明，GR 在 IPTG
浓度为 0-1.0 mmol/L 范围内，表达量先升高后降低，
在 0.7 mmol/L 时表达量最大（图 5-A），诱导 4 h 时
表达量最大（图 5-B），最适诱导温度为 28℃（图
5-C）。在最佳诱导条件下诱导表达后，收集重组
菌经超声破碎细胞，SDS-PAGE 分析表明，37℃和
28℃诱导时沉淀和上清中都有明显的目的蛋白条带，
但是 28℃诱导时沉淀和上清的目的蛋白条带均相对
于 37℃诱导时的亮，并且两种温度诱导下沉淀中的
目的蛋白条比上清中的目的蛋白多（图 5-C），表明
重组蛋白在 E.coli BL21（DE3）中主要以包涵体形
式存在。
3 讨论
GSH 作为细胞内重要的抗氧化剂可以和许多化
合物反应，参与细胞内许多生理过程，以维持细胞
内硫醇的氧化还原状态。GSH 的抗氧化能力是通过
为关键的抗氧化防御酶如抗坏血酸、过氧化物酶等
提供还原当量来实现的［21］。但在清除 ROS 的解毒
过程中，形成大量的谷胱甘肽二硫化物（GSSG）即
GSH 的 氧 化 形 式， 而 GR 则 以 NADPH 作 为 辅 酶，
催化 GSSG 转变成 GSH［22］，它属于一种黄素蛋白还
原酶。因此，GR 通过保持较高的 GSH/GSSG 比率在
维持细胞内稳定的氧化还原水平中具有重要作用。
目前，在许多生物中已克隆出编码 GR 的基因
2000
bpbp
2 1 M
1000
1356
750
500
250
100
2000
bp bp
2 31M
1000
1356
750
500
250
100
A B
A ：GR 克隆，M ：DL 2000 DNA 分子量标准，1-2 ：PCR 产物鉴定 ；B ：阳
性克隆 PCR 鉴定，M ：DL 2000 DNA 分子量标准，1-3 ：菌落 PCR 产物鉴定
图 1 GR 基因的克隆（A）及菌落 PCR（B）
根据 NCBI 网站的 ORF Finder 软件分析，GR 基
因序列包含一个 1 356 bp 的完整开放阅读框（ORF），
编码 451 个氨基酸，分子量预测为 48.9 kD，理论
等电点为 5.29，SignalP 3.0 Server 分析显示该基因
没有信号肽序列，TMHMM Server v. 2.0 分析该基因
不存在跨膜区。NetGlyc 1.0 Server 预测其没有 N-糖
基化位点，NetPhos 2.0 Server 预测该基因有 3 个丝
氨酸磷酸化位点。8 个酪氨酸磷酸化位点和 4 个苏
氨酸磷酸化位点，一个 cAMP 和 cGMP 依赖性的蛋
白激酶磷酸化位点，2 个蛋白激酶 c 磷酸化位点，6
个酪蛋白激酶 II 磷酸化位点，14 个 N-十四酰化位
点，一个 CAAX box，11 个微体 C 末端定位信号序
列。氨基酸同源性分析序列分析显示，哈氏弧菌
GR 基因与轮虫弧菌（V.Rotiferianus），副溶血弧菌
（V.parahaemolyticus） 和 溶 藻 弧 菌（V.alginolyticus）
都具有很高的同源性，其中与轮虫弧菌的同源性达
到 99%。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6186
组 DNA 或 cDNAs，包括细菌［23］、植物［24］、和小鼠［25］
等。并且通过酶活性测定和基因表达定量分析，对
GR 在植物的抗逆性和抗氧化，以及动物癌细胞的耐
药性方面的作用已经进行了较多的研究。研究显示，
GR 在植物抗胁迫时参与氧化应激和对刺激的耐受
性具有重要作用［26］，具有较低 GR 活性的植物对温
1351
1261
1171
1081
991
901
811
721
631
541
451
361
271
181
91
1
1356
*
1350
1260
1170
1080
990
900
810
720
630
540
450
360
270
180
90
* 号代表终止子，横线部分为 cAMP 和 cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点，阴影部分为蛋白激酶 C 磷酸化位点，方框内为
吡啶核苷酸二硫化物氧化还原酶活性位点
图 2 GR 基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列
2000
bp bpbp
M 1 2 3 4
1000
750
500
250
100
2000
M 1 2 3 4
1000
10000
500
250
4000
5889
1356
7000
A B
A ：PCR 鉴定阳性菌落，M ：DL 2000 DNA 分子量标准，1-4 ：含有 GR 的阳
性克隆 ；B ：pET32-gr 的双酶切鉴定，M ：1 kb DNA 分子量标准，1 和 2 ：
GR 和 pET-32a（+）的双酶切，3-4 ：pET32-gr 的双酶切
图 3 GR 原核表达载体构建
130
kD
M 1 2 3 4
100
70
55
GR
40
35
25
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：阴性对照没有 IPTG 诱导 ；2 ：阴性对照有 IPTG
诱导 ；3 ：pET-gr 没有 IPTG 诱导 ；4 ：pET-gr 有 IPTG 诱导
图 4 pET-gr 原核表达分析
2015,31(6) 187朱帆等：哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶基因克隆及原核表达
度、重金属、盐度等环境胁迫更加敏感，GR 基因缺
失菌株在环境胁迫因子刺激下存活率更低，重组高
产 GSH 合成酶系统使大肠杆菌对重金属的耐受性提
高［27］，因此 GSH 抗氧化系统在植物抗逆性、抗胁
迫、动物肿瘤耐药性治疗、细胞抗氧化、抗衰老等
方面具有广阔的应用前景，但是细菌耐药性的形成
与 GSH 抗氧化系统的相关性研究相对较少。
抗生素作用于细菌，引起细菌细胞内的氧化应
激时，过量氧化物和自由基消耗 GSH，导致 GSH/
GSSG 比率降低，GSH 合成酶体系的表达和 GSSG 的
还原途径在调控维持细胞的氧化还原平衡时的分子
机制不是很清楚。本实验克隆并分析了哈氏弧菌 GR
基因序列，其中活性位点和可能的功能位点可以帮
助预测该基因的蛋白质结构，从分子水平预测抗氧
化系统与细菌耐药性的关系，同时可以进一步从构
建 GR 功能位点缺失的突变株来研究 GR 的功能和
参与的代谢过程。
因为本实验室制备的哈氏弧菌 GSH 抗氧化酶
GST 和 GPx 基因疫苗对斜带石斑鱼具有较好的保
护作用，而且有研究在大肠杆菌中表达的哈氏弧菌
GR［28］、SOD［29］纯化蛋白对鱼也有较好的保护作用，
本实验经克隆病原菌哈氏弧菌 GR 基因构建表达载
体，并得到了该蛋白表达的最佳条件，28℃诱导时
蛋白在上清中的表达量较多。探索重组活性蛋白的
表达条件，获得大量活性蛋白，可以从 GR 蛋白对
细菌的药物敏感程度的影响来探讨 GR 与细菌耐药
性的关系，从而进一步研究其在细菌耐药性中的功
能与作用 ；同时也可以用于弧菌疫苗的研究，以期
从 GR 角度对弧菌病起到较好的防疫作用。
4 结论
本研究克隆了哈氏弧菌谷胱甘肽还原酶 GR 基
因，得到 1 356 bp 碱基序列，将之与 pET-32a（+）
连接后，转化入 E.coli BL21（DE3）中构建了重组
菌株。表达条件优化结果为，当重组表达菌生长至
OD600=0.4-0.6 时，经 0.7 mmol/L 的 IPTG 在 28℃诱
导 4 h，表达出较多的 68.9 kD 蛋白，为获得高效表
达的蛋白以检测其生物学活性和以后实验中的应用
奠定了必要的基础。
参 考 文 献
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130
kD
100
70
55
GR
40
130
kD
1.0 0.7 0.4 0.2 0.1 M
100
70
55
GR
B
A IPTG concentration/mmol·L-1
2 h 4 h 6 h 8 h 10 hM
IPTG induction time
35
kD
100
70
55
GR
40
25
C ޘ㧼 к␵ ⊹⏰M 28ć induction ޘ㧼 к␵ ⊹⏰37ć induction
A ：IPTG 诱导浓度的优化 ；B ：诱导时间的优化 ；C ：诱导温度的优化
图 5 pET-gr 诱导条件的优化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.6188
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（责任编辑 李楠）