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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
炭疽菌的分布极为广泛，且寄主繁多，可侵害
多种树木，尤其是对一些丰产速生林能够造成严重
危害［1，2］。杉木炭疽病是杉木栽培区的主要发生病
害之一，几乎有杉木的地区都会有炭疽病发生。病
轻时，会导致杉木幼苗的针叶或嫩梢变褐枯萎，严
重时，常会造成杉木幼林成片的枯黄、枯死，对杉
木林造成了毁灭性的损害［3-5］。因此，需要寻找一
种高效、安全的防病方法来控制及预防该病在杉木
上的扩散。利用生防细菌或其代谢产物来防治植物
病害，使寄主植物周围的有益微生物和有害微生物
达到平衡，从而起到防病增产的目的［6］。
收稿日期 ：2013-12-10
基金项目 ：林业公益性行业科研专项（201004014）
作者简介 ：杨菁，女，硕士研究生，研究方向 ：应用微生物 ；E-mail ：123196515@163.com
通讯作者 ：周国英，女，博士，教授，研究方向 ：林业微生物 ；E-mail ：gyzhou2118@163.com
杉木炭疽病拮抗菌 AM53 的发酵条件优化
杨菁 周国英 谭益民 路宗岩
（中南林业科技大学 教育部经济林培育与保护重点实验室，长沙 410004）
摘 要 ： 旨在优化地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）AM53 的发酵条件。通过 Plackett-Burman 试验筛选到影响 AM53 活
菌数的重要因素为培养温度、初始 pH、摇床转速。经最陡爬坡试验和 Box-Behnken 试验，获得 AM53 的最佳发酵条件为培养温度
30.5℃，初始 pH8，摇床转速 185 r/min，接种量为 5%，培养 24 h。结果显示，在此条件下，OD600 平均为 1.861，其值与预测值基
本相符，说明该模型可信度高，可应用于 AM53 发酵条件优化。
关键词 ： 拮抗菌 AM53 发酵条件 Plackett-Burman 试验 Box-Behnken 试验
Optimization of Fermentation Conditions of Antagonistic Bacterium
AM53 Against Colletotrichum gloeosporioides
Yang Jing Zhou Guoying Tan Yimin Lu Zongyan
（The Key Laboratory for Economic Forest Cultivation and Conservation of Education Ministry，Central South University of Forestry and
Technology，Changsha 410004）
Abstract: It was to optimize the fermentation conditions of Bacillus licheniformis. The Plackett-Burman design was used to optimize the
fermentation conditions, and the results showed that culture temperature, the initial pH and the rotating speed had significant influence on the
count of the living AM53. After the steepest ascent test and Box-Behnken design, the optimal fermentation conditions of AM53 that we got were ：
culture temperature was 30.5℃, the initial pH was 8, rotating speed was 185 r/min and inoculation volume was 2%, cultured 24 hours. Under
this condition, the average of OD600 was 1.861, which means the experimental values agreed with the predicted values, the predicted model was
reliable and available for the optimization of AM53 fermentation conditions
Key words: Antagonistic bacterium AM53 Fermentation conditions Plackett-Burman design Box-Behnken design
发酵培养条件对微生物发酵液中的菌体含量
和代谢产物都有较大的影响［7-9］。响应面分析法
（Response surface methodology，RSM）可同时对影响
响应值的各因子水平及他们的交互作用进行优化和
分析，并快速有效地确定多个因子系统的最佳培养条
件［10，11］。该方法可以减少试验步骤，提高准确性。
本研究通过对从湖南攸县杉木根际土壤中筛选得到
的杉木炭疽病拮抗细菌地衣芽孢杆菌（Bacillus lich-
eniformis）AM53 进行发酵条件的优化，旨在获得最
佳的拮抗效果，为后续杉木炭疽病微生物制剂的研
究奠定基础。
2014年第8期 165杨菁等 ：杉木炭疽病拮抗菌 AM53 的发酵条件优化
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 指示菌株 ：杉木炭疽病的病原菌，
由本实验室分离及鉴定，保藏于本实验室的菌种保
藏中心，编号为 CSUFTCC F0101。
拮抗菌株 ：地衣芽孢杆菌 AM53，由本实验室
分离、筛选及鉴定，保藏于中国典型培养物保藏中心，
保藏号为 CCTCC No. M2012273。
1.1.2 培养基 液体发酵培养基（NB 液体培养基）：
牛肉膏蛋白胨培养基。
平板培养基 ：PDA 培养基，用于病原菌的活化
及抑菌活性的测定。
1.2 方法
1.2.1 菌悬液的制备、发酵及菌体浓度的测定 菌
悬液的制备 ：将斜面上生长良好的 AM53 菌株接种
到含 40 mL 培养液的三角瓶中（100 mL），于 28℃、
160 r/min，振荡培养 24 h 后获得。
基础发酵条件 ：按照一定的比例接种种子悬液
到含 20 mL NB 培养液的三角瓶中（100 mL），于一
定温度下振荡培养 24-48 h 后制成种子液。
菌体浓度的测定 ：取 AM53 菌株发酵液，空白
培 养 液 作 为 对 照， 在 722s 可 见 分 光 光 度 计 上 测
600 nm 时菌液的 OD（optical density）值，以 OD 值
的大小来表示菌体的浓度［12］。
1.2.2 Plackett-Burman 试验设计 使用 Design-expert
8.0 设计一个 5 因素 2 水平的 Plackett-Burman（PB）
试验，以菌体浓度 OD600 为响应值，从摇床转速、
初始 pH、温度、接种量和培养时间众多因素中，在
最少的试验次数情况下，筛选出对菌体产量具有显
著作用的因素。一般情况下，高水平（+）取低水平
（-）的 1.0-1.5 倍［13］。PB 试验各因素及其水平如表
1 所示。
表 1 Plackett-Burman 试验 5 种因素水平
因素
水 平
-1 +1
摇床转速（r/min） 140 180
初始 pH 5 7
培养时间（h） 24 48
接种量（%） 4 8
培养温度（℃） 26 30
1.2.3 最陡爬坡试验 在确定影响菌体浓度的显著
性因素后，设计最陡爬坡试验，从而进一步确定各
因素的变化方向和步长，以逼近最大的菌体产量的
极值点。
1.2.4 Box-Behnken 试验 应用 Design-expert 8.0 设
计的 Box-Behnken design（BBD）试验法，包含了 17
个试验点，主要分为两类 ：析因点有 12 个，即为自
变量取值在 A、B、C 所构成的三维顶点 ；零点即区
域中心点，零点试验重复 5 次，用于估计试验误差。
最后通过对数据的分析，获得最佳的发酵条件。试
验中各因素水平如表 2 所示。
表 2 Box-Behnken 试验因素水平
因素（X）
水平
-1 0 1
A- 培养温度（℃） 28 30 32
B- 初始 pH 7 8 9
C- 摇床转速（r/min） 160 180 200
2 结果
2.1 Plackett-Burman筛选试验
对 PB 试验结果（表 3）进行方差分析，方差分
析结果（表 4）显示，对菌体产量影响较为显著的
前 3 个因素分别为 ：培养温度（P=0.018）、初始 pH
（P=0.076）、摇床转速（P=0.090）。经过方差分析，
获得多元一次不等式（已编码）：
OD600=0.92467+0.23033 摇床转速 +0.24367 初始 pH-
0.02900 培养时间 +0.06667 接种量 +0.36883 培养温度
在该等式中，培养温度、初始 pH，摇床转速的
系数分别为 +0.36883，+0.24367，+0.23033，均为正数，
即培养温度、初始 pH 和摇床转速对 OD600 都呈正效
应［14］，因而提高 pH 和摇床转速，升高培养温度能
够增加 OD600 的值，即增加菌体浓度。根据 Plackett-
Burman 的试验结果，设计最陡爬坡试验。
2.2 最陡爬坡试验
根 据 对 Plackett-Burman 试 验 结 果 的 分 析， 设
计爬坡试验，结果（表 5）显示，最优的培养条件
为处理 3，因此以处理 3 中各因素的水平为 Box-
Behnken 试验的 0 水平点，设计试验。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期166
表 5 最陡爬坡试验设计及结果
处理 初始 pH 培养温度（℃） 摇床转速（r/min） OD600
1 7 28 160 1.632
2 8 30 180 1.782
3 9 32 200 1.717
2.3 Box-Behnken试验
采用 Box-Behnken 中心设计原理，对影响 AM53
菌株的活菌数的上述重要因素，即培养温度（℃）、
初 始 pH 和 摇 床 转 速（r/min）， 采 用 Design-expert
V8.0 软件对其进行 3 因素 3 水平的中心组合设计，
试验因素水平设计以及结果见表 6。
为考察各因素对 AM53 菌株活菌数的影响，以
菌体发酵液在 OD600 的吸收值为指标，利用 Design-
expert 8.0 软件对表 6 中的试验结果进行分析，得到
三因素与 OD600 值（Y）之间的回归方程 ：
Y=-36.555+1.519A+1.189B+0.113C+0.011AB+2.688E-
5AC-6.900E-4BC-0.0265E-3A2-0.087B2-2.927E-4C2
二 次 多 项 式 方 程 拟 合 的 方 差 分 析 结 果（ 表
7）显示，本试验的回归模型达到了极显著水平
（P<0.0001），回归方程的相关系数 R2=0.9889，说明
该模型回归显著，另外，失拟项不显著（P=0.2518>
0.05，a=0.05），误差项不显著，表明实际情况与回
归方程之间吻合度较好，试验误差较小，可用此回
归方程代替试验真实点，对试验结果进行分析。另外，
该回归模型各项的方差分析结果还表明，一次项和
二次项都有较显著影响，则响应值的变化较为复杂，
与各具体试验因素之间并不是简单的线性关系。因
此在一定范围内可变动 pH、培养温度和摇床转速之
表 4 PB 试验结果方差分析表（已编码）
来源 自由度 平方和 均方和 F P
摇床转速 1 0.63664 0.63664 4.09 0.090
初始 pH 1 0.71248 0.71248 4.57 0.076
培养时间 1 0.01009 0.01009 0.06 0.808
接种量 1 0.05333 0.05333 0.34 0.580
培养温度 1 1.06325 1.06325 10.48 0.018
残差 6 0.93465 0.15578
合计 11 3.97965
表 6 响应面试验设计及结果
处理 A B C OD600 值 /Y
1 0 -1 -1 1.552
2 -1 -1 0 1.618
3 0 0 0 1.863
4 0 -1 1 1.714
5 0 0 0 1.853
6 0 1 -1 1.605
7 -1 0 1 1.610
8 -1 0 -1 1.524
9 1 0 -1 1.641
10 0 0 0 1.864
11 0 1 1 1.711
12 1 0 0 1.732
13 -1 1 0 1.601
14 0 0 0 1.836
15 1 1 0 1.741
16 0 0 0 1.832
17 1 -1 0 1.667
表 7 回归方程方差分析表
方差来源 自由度 平方和 均方 F P 显著性
模型 9 0.2 0.023 69.19 <0.0001 **
A 1 0.023 0.023 69.4 <0.0001 **
B 1 1.38E-3 1.38E-3 4.22 0.0791
C 1 0.025 0.025 75.65 <0.0001 **
AB 1 2.04E-3 2.04E-3 6.23 0.0412 *
AC 1 4.62E-6 4.62E-6 0.014 0.9088
BC 1 7.62E-4 7.62E-4 2.32 0.1713
A2 1 0.047 0.047 143.83 <0.0001 **
B2 1 0.032 0.032 96.99 <0.0001 **
C2 1 0.058 0.058 176.03 <0.0001 **
总和 16 0.21
R2=0.9889 R2adj=0.9746 CV=1.06
*P<0.05，差异显著 ；**P<0.01，差异极显著
表 3 PB 试验设计及结果（已编码）
处理 接种量 初始 pH 温度 摇床转速 培养时间 OD600
1 1 -1 1 -1 -1 0.201
2 1 -1 1 1 -1 1.567
3 1 1 -1 1 1 1.412
4 1 1 1 -1 1 0.611
5 -1 -1 -1 1 1 1.648
6 -1 -1 -1 -1 -1 1.485
7 -1 1 -1 -1 -1 0.324
8 1 1 -1 1 -1 1.341
9 1 -1 -1 -1 1 0.457
10 -1 1 1 -1 1 1.418
11 -1 1 1 1 -1 0.574
12 -1 -1 1 1 1 0.058
2014年第8期 167杨菁等 ：杉木炭疽病拮抗菌 AM53 的发酵条件优化
间的关系，从而使发酵液中的活菌数达到最高水平。
利用 Design-expert 8.0 软件对表6 中的试验结果
进行二次多项式回归拟合，得到二次多项式回归方
程的响应面图及等高线图（图 1-图3）。
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
9.00
O
D
60
0
8.50
B ࡍpH A ษޫᓖ8.00 7.50
7.00 28.00
29.00
30.00
31.00
32.00
OD600
B
ࡍpH
A ษޫᓖ7.007.508.509.008.00 1.7 1.8 5 1.728.00 29.00 30.00 31.00 32.00
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
O
D
60
0
200.00
192.00
C:᩷ᒺ䖜䙏 A:ษޫᓖ184.00176.00168.00
160.00 28.00
29.00
30.00
31.00
32.00
1.8
1.7
1.6
5
OD600
C
:᩷ᒺ䖜䙏
A:ษޫᓖ200.00192.00184.00176.00168.00160.0028.00 29.00 30.00 31.00 32.00
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
200.00
192.00
184.00
176.00
168.00
160.00 7.00
7.50
8.50
8.00
9.00
O
D
60
0
C:᩷ᒺ䖜䙏 B:ࡍpH 1.6 1.71.85200.00192.00184.00176.00168.00160.007.00 7.50 8.508.00 9.00OD600C:᩷ᒺ䖜䙏
B:ࡍpH
图 1 A（培养温度）和 B（初始 pH）对 OD 值影响的响应面及等高线图
图 2 A（培养温度）和 C（摇床转速）对 OD 值影响的响应面及等高线图
图 3 C（摇床转速）和 B（初始 pH）对 OD 值影响的响应面及等高线图
Design-expert 8.0 软件对表 6 中的数据进行分析
后，可得到发酵液的最大 OD600 值为 1.864。各试验
因素的最佳取值分别为 ：培养温度为 30.52℃，初始
pH 为 8.09，摇床转速为 184.67 r/min。为了验证本
次分析结果的准确性，结合实际情况，将菌株 AM53
发酵培养条件的最佳条件修正为 ：培养温度 30.5℃，
初始 pH=8，摇床转速 185 r/min，进行 3 次重复试验，
所得发酵液的实际 OD600 值的平均值约为 1.861。可
见，实际结果与 Design-expert 8.0 软件的预测结果符
合良好，说明采用响应面法（RSM）优化菌株 AM53
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期168
的发酵培养条件是可行的。
3 讨论
杉木炭疽病是潜伏侵染性的病害，针叶带菌率
随着气温的升高而增加，到 8 月份达到最高。入秋后，
温度适宜时又会有少量的植株感病 ；11 月后逐渐下
降，到 3 月底降到最低，4 月份又开始回升，危害嫩叶、
嫩梢。目前，已见报道的杉木炭疽病防治方法大多
是营林防治和化学防治。其中，化学防治方法是在
病害发生的早期，采用波尔多液、可湿性退菌特、
多菌灵或炭疽福美等各药剂交替使用，从而防治杉
木炭疽病的发生与扩散。但是，化学药剂基本上只
有预防作用，却没有很有效的治疗作用［15-17］。同时，
化学农药的使用，也会破坏了自然界的生态平衡。
本研究从杉木叶片中分离得到了杉木炭疽病
的拮抗细菌 AM53，并鉴定了该菌株为地衣芽孢杆
菌（Bacillus licheniformis）。在抑菌试验过程中发现，
新鲜的发酵液具有稳定的抑菌效果，这与发酵液中
的活菌数、菌活力及代谢产物有着密切的关系，由
于拮抗菌 AM53 的培养基是基础的细菌牛肉膏蛋白
胨液体培养基，因而不再对其进行优化研究，对
拮抗细菌 AM53 的发酵条件展开了优化研究。经过
Plackett-Burman 筛选试验表明，培养温度、初始 pH
和摇床转速对 AM53 活体数有显著的影响作用，且
均为正效应。通过最陡爬坡试验的结果分析，找到
逼近响应值的区域。最后通过对 Box-Behnken 试验
结果的分析，找到拮抗菌 AM53 的最佳发酵条件，
在 该 发 酵 条 件 下， 拮 抗 菌 AM53 的 平 均 OD 值 为
1.861。
4 结论
本研究通过对杉木拮抗菌 AM53 的发酵条件进
行优化，优化后培养条件为 ：培养温度 30.5℃，初
始 pH=8，摇床转速 185 r/min，接种量为 5%，培养
24 h。在此条件下，OD600 平均值为 1.861。经验证
表明该模型能较好的预测该菌株实际发酵产酶的情
况，说明该模型可以在实践中应用。
参 考 文 献
［1］ 林业部南方森林植物检疫所 . 杉木炭疽病的研究Ⅱ、症状和病
原的探讨［J］. 南京林产工业学院学报 , 1980（2）：31-38.
［2］ Babu BK, Saxena AK, Srivastava AK, et al. Identification and
detection of Macrophomona phaseolina by using species-specific
oligouncleotide primers and probe［J］. Mycologia, 2007, 9 ：797-
803.
［3］ 诸瑞龙 . 杉树炭疽病发病规律的探讨［J］. 林业科技通讯 ,
1976（2）：13-14.
［4］ 江西森林病虫防治站等 . 杉木炭疽病的初步研究［J］. 林业病
虫通讯 , 1976（1）：3-11.
［5］ 王军 , 景何铭 , 黄定芳 . 杉木炭疽病的发生规律及防治研究［J］.
林业科学研究 , 1996, 9（1）：97-100.
［6］ 路宗岩 . 杉木炭疽病拮抗细菌的筛选及其菌剂研制［D］. 长沙：
中南林业科技大学 , 2012 ：8-9.
［7］ 谷春涛 . 地衣芽抱杆菌 TS-01 培养条件的研究［D］. 北京 ：中
国农业大学 , 2004.
［8］ 唐娟 . 地衣芽孢杆菌 C 和 L-3 菌株生物活性的初步研究［D］.
武汉 ：华中农业大学 , 2008.
［9］ 纪明山 , 王毅婧 . 地衣芽孢杆菌生防菌株 SDYT-79 发酵条件优
化［J］. 沈阳农业大学学报 , 2011, 2（42）：164-169.
［10］ 万芳芳 . 高产甲壳素脱乙酰酶菌株的筛选及发酵研究［D］.
长沙 ：中南林业科技大学 , 2012.
［11］ 郝聚喜 . 玉米芯固定化脂肪酶及其催化转化生物柴油的研
究［D］. 长沙 ：中南林业科技大学 , 2011.
［12］ 乔军 , 孟庆龄 , 贾桂珍 . OD 值法进行细菌计数的研究［J］.
中国家禽 , 1996（4）：26.
［13］ 孙晓鸣 , 王萍 , 邬向东 . 产中性蛋白酶芽孢杆菌配伍发酵响应
面法研究［J］. 中国食品学报 , 2010, 10（2）：117-124.
［14］ 骆健华 , 金志华 , 岑沛霖 . 响应面法优化热带假丝酵母 104 菌
株产羰基还原酶发酵培养基［J］. 高校化学工程学报 , 2006,
20（1）：68-73.
［15］ 王军 , 景何铭 , 黄定芳 . 杉木炭疽病的发生规律及防治研究［J］.
林业科学研究 , 1996, 9（1）：97-100.
［16］ 梁仰贞 . 油茶半边疯的发生与防治［J］. 农家科技 , 2006（3）：
32.
［17］ 许彦君 , 刘海龙 , 刘新晶 . 细菌对植物病害生物防治研究进
展［J］. 大豆科技 , 2011（5）：18-23.
（责任编辑 马鑫）