全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
DNA 作为生物机体中重要的遗传物质，其本身
携带着生命体所有的遗传信息，DNA 的完整性关系
到生物体的生长、发育、遗传、代谢和繁殖等多种
重要的生物学过程。然而，生物机体在自身复制、
转录过程中以及暴露于各种外界环境下，极易受到
体内或外界因素的影响而产生 DNA 损伤，正常情况
下，大部分的损伤能够被细胞识别并予以修复，但
当 DNA 损伤比较严重或机体 DNA 损伤修复能力缺
失，机体无法正常修复时，带有这种损伤的 DNA 就
会进入半保留复制过程，很容易发生碱基错配，从
而引起细胞凋亡，甚至促使机体形成肿瘤，以及形
收稿日期 ：2012-12-12
基金项目 ：集美大学创新团队基金项目（2010A001）
作者简介 ：梁姣，女，硕士研究生，研究方向 ：水产生物技术 ；E-mail ：18259226570@163.com
通讯作者 ：王淑红，女，博士，副教授 ；E-mail ：shwang@jmu.edu.cn
长距离实时定量 PCR 技术及其在 DNA 损伤
研究中的应用
梁姣1  王淑红1  张子平2  王艺磊1
（1. 集美大学水产学院，厦门 361021 ；2. 西东大学生物系，新泽西州 07079）
摘 要 : DNA 损伤作为评价环境化合物的遗传毒性、生物个体环境暴露水平和肿瘤罹患危险度的指标越来越受到人们的关
注。检测 DNA 损伤的方法很多，而 PCR 技术由于所需样品量少，检测灵敏度高等优点，近年来发展很快。综述 PCR 技术在 DNA
损伤研究中的应用，并重点介绍新近发展的长距离实时定量 PCR（long amplicon real-time quantitative PCR，LA-real time QPCR）的
关键技术。
关键词 : 长距离实时定量 PCR DNA 损伤 环境化合物
Long Amplicon Real-time Quantitative PCR Technology and Its
Application in DNA Damage Detection
Liang Jiao1 Wang Shuhong1 Zhang Ziping2 Wang Yilei1
（1. Fisheries College，Jimei University，Xiamen 361021 ；2. Department of Biological Science，Seton Hall University，
New Jersey 07079）
Abstract:  DNA damage as an endpoint for evaluating genotoxicity of environmental compounds and organism levels of environmental
exposure as well as the risk of tumor is always the research focus. Several methods were developed for detecting DNA damage, PCR technology,
due to its little DNA needs and high accuracy is widely used in DNA damage detection recently. Here, we review the application of PCR on DNA
damage detection, more over, the technical key steps of a newly developed technology called the long amplicon real-time quantitative PCR （LA-real
time QPCR） also were detailed .
Key words:  Long amplicon real-time quantitative PCR DNA damage Environmental compounds
成各种治疗癌症细胞的阻力［1-4］。
造成生物机体 DNA 损伤的因素有很多。生物体
氧化 - 还原反应代谢过程中产生的自由基，DNA 自
身在复制重组过程中发生的错配，碱基替换，另外
在电离辐射和紫外线照射情况下也会产生氧自由基，
环境中化学物质亦能造成一定程度的 DNA 损伤。常
见的 DNA 损伤会引起肿瘤、癌症［5，6］、糖尿病、心
血管疾病及神经退行性疾病等［7-10］。因此，DNA 损
伤作为外来化合物对机体毒性作用的一个指标，在
分子毒理上的应用越来越广泛。同时，DNA 损伤也
被用于环境化学物的遗传毒性、生物个体环境暴露
2013年第5期 53梁姣等 ：长距离实时定量 PCR 技术及其在 DNA 损伤研究中的应用
水平和肿瘤罹患危险度的评价。
1 DNA 损伤的类型
外来化合物引起的 DNA 损伤有多种不同的类
型，归结起来，可分为 4 种主要的类型 ：（1）碱基
损伤，包括形成嘧啶二聚体、碱基共价化合物、碱
基烷基化和碱基缺失、转换、颠换 ；（2）糖基破坏 ；
（3）DNA 链交联，包括 DNA 链内交联、链间交联和
DNA 蛋白质交联 ；（4）链断裂［11］，其中链断裂中的
单链断裂（single strand break，SSB）是由于间接的
DNA 损伤所引起的。同时，单链断裂也是由于 DNA
核糖损伤程度增加直接引起，以及受到内源性活性
氧或过氧化氢、电离辐射攻击而产生［12］，更严重
的会引起双链断裂（double strand break，DSB）［13］。
2 DNA 损伤检测的方法及优缺点
近 年 来， 研 究 者 陆 续 建 立 了 很 多 DNA 损 伤
的检测方法，如线粒体基因拷贝数［14］，限制性酶
切 片 段 长 度 多 态 性 分 析（restriction fragment length
polymorphisms，RFLP）［15］及温度梯度凝胶电泳（te-
mperature gradient gel electrophoresis，TGGE）［16］
等。另外，还包括单细胞凝胶电泳试验（彗星试验，
comet assay）［17］、碱解旋（alkaline unwinding）［18］和
微核测定法（micronuclei test）［19］等。虽然这些方
法各有特点，但 DNA 损伤研究对象都集中在基因组，
不能对特定基因的损伤进行直观或精确的定位定量
检测与分析。此外，这些方法对 DNA 损伤的程度也
不能做到精确的定量。目前，虽有一些可用于特定
基因检测的方法，如单链构象多态性（single-strand
conformation polymorphism，SSCP）［20］和 8-氧基鸟嘌
呤（8-oxoG）［21］的分析测定，但这些方法主要用于
碱基突变或特定碱基损伤的检测，而不能检测基因
的总体损伤情况。同时，这些方法都需要大量的
DNA 及引物，而 8-oxoG 虽然不需要引物，但经常需
要和其他技术，如高效液相色谱 - 电化学法、酶联
免疫吸附法等结合使用［22］，工作量大且耗时较长。
3 PCR 技术在 DNA 损伤研究中的应用
日 本 Higuchi 等 ［23］ 于 1992 年 首 次 采 用 动 态
PCR 方法和封闭式检测方法对目的核酸数量进行定
量分析，提出荧光定量 PCR 技术的概念。1995 年，
美国 Applied Biosystems 公司成功研制了 TaqMan 技
术，1996 年又推出了首台荧光定量 PCR 检测系统。
该系统通过在 PCR 反应体系中加入荧光染料，使之
与双链 DNA 结合从而收集荧光信号，利用收集的荧
光信号再对整个 PCR 进程进行实时监测，并使用 Ct
值进行分析，通过做标准曲线对未知模板进行定量
分析［24，25］。相较于常规 PCR 方法无法对起始模板
准确定量且只能对终产物进行分析的局限性，实时
定量 PCR 方法是目前确定样品中 DNA（cDNA）拷
贝数最敏感、最准确的方法，具有自动化程度高、
重现性好和无污染等特点，目前已经在分子生物学
领域和医学领域得到广泛的使用。
常规 Real-time QPCR 技术应用于 DNA 损伤的
研究虽早已有报道，但其通常需要与其他技术结合
使用，并且操作步骤繁琐，同时也增加了试验过程
中误差形成的可能性。Neher 等［26］通过单个线虫暴
露于苯并芘和荧蔥中，用提取的 DNA 先采用 PCR
技术扩增出 ced-1 基因 16 144 bp 和 rpa-1 281 bp 长
度的片段，进而通过 Real-time QPCR 技术从扩增的
ced-1 基因中选择 109 bp 的片段作为扩增的目的片
段，rpa-1 中选择 81 bp 的片段作为扩增的参比片段，
经苯并芘和荧蔥处理下的 DNA 会形成加合物，而加
合物的存在会抑制 DNA 的扩增。将处理组目的片段
和参比片段的比值与未处理组目的片段和参比片段
的比值相比，当比值≤ 0.05 时，表明有抑制了 PCR
反应的 DNA 加合物的存在。通过 Real-time QPCR 结
合 8-oxoG 技术，孙玉等［27］采用亚甲蓝联合可见光
（MBL）方法处理肝癌细胞株（HepG2），使得 DNA
链中鸟嘌呤被氧化成 8-oxoG，而 8-羟基鸟嘌呤 DNA
糖苷酶（8-oxoguanine DNA glycosydase）可特异切割
8-oxoG 位点，与未经处理的 DNA 相比，经酶切后完
整的 DNA 模板减少，再经 Real-time QPCR 法扩增
时，表现为 Ct 值较大的现象，从而可以反推 DNA
中 8-oxoG 的含量，进而成功构建了 DNA 的氧化损
伤模型。
Rothfuss 等［28］ 利 用 Real-time QPCR 分 析 神 经
母瘤细胞系 SH-SY5Y 经 H2O2 暴露后线粒体基因组
不同位置 DNA 损伤情况，试验过程中，选取线粒体
ND5、ND1/ND2、CO Ⅱ /ATPase6/8 及 D-Loop 4 个位置，
扩增其大小在 1 kb 左右的片段，根据 mtDNA 区域
每 10 kb DNA 所包含对应长片段的长度计算出 DNA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期54
的损伤，得出线粒体 DNA 损伤率与扩增片段的长度
成反比的结论，并验证了线粒体不同区域对损伤的
敏感程度不同的说法。
Santons 等［29］在研究哺乳动物细胞核 DNA，线
粒体 DNA 损伤及修复的过程中建立了一种长距离
PCR 的方法，该种方法检测 DNA 损伤的原理是基
于多种类型的 DNA 损伤都可以减缓或阻止 DNA 聚
合酶的进程。其优点在于能直接从总 DNA 中直接检
测线粒体 DNA 的完整性而不用再单独分离出线粒体
DNA，并且能够准确的检测核 DNA 和线粒体 DNA
的损伤程度。之后，很多学者将该技术应用于人类
疾病和模式生物 DNA 损伤的检测。Jung 等［30］用长
距离定量 PCR（LA-QPCR）方法检测大西洋鳉鱼线
粒体 DNA 和核 DNA 损伤的情况，通过向相对未受
污染的鱼体内注射苯并芘，测定肝、脑、肌肉组织
中 DNA 的损伤程度。同时，还检测了受污染区域的
大西洋鳉鱼肝、肌肉 DNA 的损伤，认为长距离定
量 PCR 技术为评估 DNA 损伤提供了灵敏的检测手
段。在研究人类疾病方面，长距离定量 PCR 技术也
发挥了重要作用。用此方法，Van 等［31］验证了正
常人类的成纤维细胞中转录的次黄嘌呤转移酶基因
比非转录的 beta-球蛋白基因修复率更高的说法。而
Fukagawa 等［32］也采用长距离定量 PCR 的方法验证
了衰老和基因肥胖型会造成体内线粒体 DNA 缺失。
此外，长距离定量 PCR 技术还可用于检测人肺癌细
胞系 PLK3/PRK 基因内含子及外显子的结构和多态
性分析［33］。
尽管 LA-QPCR 技术在 DNA 损伤检测方面得到
很多的应用，但该方法采用的是终点检测法，对模
板浓度和 PCR 循环数都有较高的要求，不能对 PCR
情况进行实时监测。近年来，一些学者考虑将实时
定量 PCR 技术和长距离定量 PCR 技术结合。Vidal
等［34］于 2005 年最早报道了 LA-real time QPCR 技术
在检测 A 型血友病凝血因子 VIII 基因 22 号内含子
倒置试验中的应用。该研究分别扩增了阳性个体，
阴性个体及女性 A 型血友病携带者 3 个试验组内含
子区域 12 kb 及 11 kb 长度的片段，并根据 Ct 值的
大小可以一步快速检测 A 型血友病 VIII 基因突变的
情况。 Maruyama 等［35］应用 LA-real time QPCR 技术
扩增了 4.1 kb、8.5 kb 和 15.5 kb 的质粒片段，可以
灵敏的检测河流中胞外质粒的存在。Edwards［22］采
用 LA-real time QPCR 技术成功扩增了 15 kb 几乎可
以覆盖整个线粒体基因组的长片段，可以快速，高
重复性的检测线粒体的 DNA 损伤。
4 长距离实时定量 PCR 技术
常规的 Real-time QPCR，为了保证扩增效率，
扩增目的片段的长度要求在 50-300 bp 之间，一般
不会超过 400 bp［36］。LA-QPCR 能够扩增的目的片
段可达 20 kb 左右［37，38］，这就对 PCR 反应条件提
出了很多的挑战。经过多次探索并参考前人的研究
结 果， 结 合 Real-time QPCR 技 术 和 LA-PCR 技 术，
我们建立了一整套 LA-real time QPCR 的相关技术，
现详细介绍如下。
4.1 DNA模板
LA-real time QPCR 扩增 DNA 的片段长度可以达
到 20 kb，这就要求所提取的 DNA 具有高度的完整性，
生物体基因组 DNA 的链一般比较长，在提取 DNA
的过程中，由于用力过猛或试验操作不当，很容易
造成 DNA 链的断裂。我们知道，在 PCR 扩增的过
程中，引物分正向、反向同时从 3 和 5 端向中间扩
增，如果 DNA 链发生断裂，PCR 扩增就会中断，近
而影响 PCR 的扩增效率。因此，在裂解组织块的过
程中，我们使用研磨棒研磨组织块，加入细胞裂解
液后水浴裂解细胞，而非使用均浆机对组织快速研
磨，同时提取 DNA 时，动作要轻缓，加入试剂后尽
量避免反复吹打。在整个 LA-real time QPCR 的过程
中，模板质量很重要，因为模板长度较长，在利用
琼脂糖凝胶电泳检测模板质量时，胶的浓度要控制
在 0.6% 左右。目前市售的适合长片段 DNA 检测的
marker 已有多种，例如，TaKaRa、天根生化科技公
司等生产的 λ-Hind Ⅲ digest DNA marker。
4.2 DNA聚合酶
TaKaRa 公司研制的 LA-Taq 是应用 LA-PCR 原
理研制的具有 3 → 5 核酸外切酶的活性（具有校对，
Proof reading 的活性）的耐热性 DNA 聚合酶。无论
是扩增短链 DNA 还是长链 DNA，其效率都优于其
他同类产品，尤其在扩增大于 10 kb 的 DNA 片段方
面，其优势更加明显，而且保真性很强。在 PCR 进
程中高温加热前抗 Taq 单克隆抗体与 LA-Taq 酶结合，
2013年第5期 55梁姣等 ：长距离实时定量 PCR 技术及其在 DNA 损伤研究中的应用
抑制聚合酶的活性，从而抑制低温条件下由引物的
非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，
能更有效地减少 PCR 过程中的非特异性反应，增强
PCR 扩增的特异性，得到良好的 PCR 结果［39］。
4.3 荧光染料
在荧光定量 PCR 反应体系中，需要加入荧光报
告基团以确定反应过程中扩增产物的量的变化。而
常用的荧光染料包括 SYBR Green Ⅰ，这是一种非
饱和菁类荧光素，能够特异的识别双链 DNA 并结合
在 DNA 双链上［40］，是应用最广泛的化学检测物质，
但这种结合也是非特异的，它能够与任何的 dsDNA
（如引物二聚体等）结合，造成试验的假阳性结果。
另外，还会出现的另一个问题是它会抑制 PCR 的进
程，优先结合 G+C 含量丰富的片段［41］，当扩增的
片段较短时，SYBR Green Ⅰ对 PCR 反应的抑制作用
影响不大，但当扩增片段的长度大于 10 kb 左右的
情况下，SYBR Green Ⅰ的抑制作用将使 PCR 不能
正常扩增。我们在试验中采用了不同浓度的 SYBR
Green Ⅰ都未能成功扩增出长度为 14 092 bp 的斑马
鱼线粒体片段。
在本实验室建立的 LA-real time QPCR 技术中
所采用的荧光染料为 SYTO-82。Gudnason 等［41］的
研究表明，SYTO-82 不抑制 PCR 的进程，不会优
先结合 G+C 含量丰富的片段，而且较高的工作浓
度也不会影响解链温度和 Tm 值。因此，在 LA-real
time QPCR 时 使 用 SYTO-82 作 为 荧 光 染 料， 得 到
了较好的扩增效率（E=1.696），且不同模板浓度下
R2=0.994，说明扩增效率重现性很好，即使用 SYTO-
82 作为荧光染料扩增片段长度为 14 092 bp 的片段
仍可以得到良好的扩增效率。同时为了平衡 PCR 加
样误差所引起的 PCR 管与管之间的差异，在 PCR
反应体系中加入 ROX 参考染料［42］。
4.4 引物
引物的选择是 PCR 能否成功扩增的关键，一般
来说，长片段引物的碱基数要比普通 PCR 反应所需
的引物要长，一般为 24±2 个核苷酸，这样能够增
加其与模板结合的稳定性 ；而且 G+C 含量也要控制
在 50% 左右。决定 PCR 反应的另一个重要因素是
引物的 Tm 值，因为扩增的片段比普通 PCR 反应较
长，这就需要 Tm 值也比普通的较高，其范围应该
在 68℃左右。与普通 PCR 的引物设计一样，在设计
长片段引物的过程中，也要考虑错配和引物二聚体
的问题，从而使引物的设计符合长片段 PCR 反应的
要求［29］。
4.5 数据分析
在使用常规实时定量 PCR 技术研究基因表达的
过程中，样本间的误差会干扰试验数据，为了得到
更精确的数据，通常需要一个或多个内参基因来消
除起始样本的误差及反应效率的误差。一般常选择
看家基因（housekeeping gene）作为内参［28、43，44］，
LA-real time QPCR 也需要相应的内参对 DNA 中某片
段的初始浓度进行标准化，以消除样品提取过程中
产生的影响。首先选取长度约 20 kb 的 DNA 片段，
设计引物，扩增出较长的片段，在扩增的长片段中
选取 200 bp 左右长度的片段，设计引物扩增该片段，
因选取的短片段与长片段在同一个序列中，相对于
长片段，短片段受损伤的几率很低，其拷贝数可以
用来校准长片段的拷贝数。
常规的 Real-time QPCR 技术一般采用 2-ΔΔCt 的
方法计算目的基因的相对表达量，该方法是建立在
参比基因和目的基因的扩增效率都接近 100% 的基
础上的。但是，当扩增的片段较长时，无论怎么优
化条件，其扩增效率不可能达到 100%。Rothfuss 等 ［28］
根据 Real-time QPCR 建立起来的半长距离实时定量
PCR（Semi-long real time PCR）技术虽然扩增的长度
在 1 kb 左右，但 1 kb 的片段扩增效率在 69.4%-89%
之间，在分析数据时他们仍采用了 2-ΔΔCt 的计算方
式，致使结果有很大的误差。而本试验在扩增斑马
鱼线粒体长度为 14 092 bp 的片段时，计算得出的
扩增效率为 69.6%。因此，我们在数据分析时，采
用 ET
CtT（C）-CtT（S）/ER
CtR（C）-CtR（S）的公式［45］，公式中
ET、ER 分别指长距离片段和短距离片段的扩增效率，
CtT（C）-CtT（S）、 CtR（C）-CtR（S）分别指长距
离片段和短距离片段介导的处理组和对照组 DNA 模
板定量扩增得到的 Ct 值，数据分析考虑了不同片段
的扩增效率，使结果更加准确。
5 结语
随着人们对 DNA 损伤及其修复机制研究的不断
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期56
深入，对于 DNA 损伤检测技术的要求也越来越高。
LA-real time QPCR 技术由于所需 DNA 量少，检测灵
敏度高等优点，尽管在区分不同类型和具体损伤位
点方面有所欠缺，但就现有的试验技术而言，LA-
real time QPCR 无疑为 DNA 损伤的检测提供了更为
方便快捷的技术手段。随着技术的不断进步，或与
其他检测方法的联合应用，相信 LA-real time QPCR
在检测环境污染物对生物体 DNA 损伤以及人类一些
相关疾病的诊断方面将会得到越来越多的应用。
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（责任编辑 狄艳红）