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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
收稿日期 ：2014-03-11
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30972259，41276157）
作者简介 ：王成暖，女，硕士研究生，研究方向 ：海洋生物学 ；E-mail ：wangchengnuan@163.com
通讯作者 ：沈和定，男，博士，教授，研究方向 ：海洋生物学 ；E-mail ：hdshen@shou.edu.cn
石磺（Onchidium）属于软体动物门（Mollusca），
腹足纲（Gastropoda），肺螺亚纲（Pulmonata），石磺
总科（Onchidioidea），石磺科（Onchidiidae），栖息
于海滩海淡水交汇处的滩涂潮间带及红树林区 ；广
泛分布于极地外的世界各地［1，2］。在我国瘤背石磺
主要分布于东南沿海地区。近年来，海岸滩涂资源
中国沿海瘤背石磺不同地理群体遗传多样性的
ISSR 标记研究
王成暖  沈和定  郑培
（上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）
摘 要 ： 研究以盐城（YC）、上海（SH）、温州（WZ）、厦门（XM）、深圳（SZ）、海南（HN）6 个不同地理群体的瘤背石
磺为试验材料，利用 ISSR 分子标记进行了遗传多样性研究。结果表明，6 个地理群体的多态位点百分率在 54.20%-70.99% 之间，
Nei’s 基因多样性指数和 Shannon’s 信息指数分别在 0.156 4-0.219 1 和 0.242 1-0.332 4 之间。AMOVA 分子变异分析表明，瘤背
石磺 47.25% 的变异发生在群体间，52.75% 的变异发生在群体内，居群内的遗传变异大于居群间的遗传变异。平均 Fst 值为 0.4725，
种间分化系数（Gst）为 0.370 5，基因流（Nm）为 0.849 7，表明 6 个地理群体间已经发生了较大程度的遗传分化，其中推断遗传
漂变可能是影响群体分化的主要因素之一。
关键词 ： 瘤背石磺 地理群体 ISSR 遗传多样性 遗传分化
Evaluation of Genetic Diversity in the Onchidium struma from Different
Geographical Populations in China by Inter Simple Sequence Repeat
（ISSR）
Wang Chengnuan Shen Heding Zheng Pei
（College of Fisheries and Life Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）
Abstract: The genetic diversity of Onchidium struma collected from Yancheng（YC）, Shanghai（SH）, Wenzhou（WZ）, Xiamen
（XM）, Shenzhen（SZ）, Hainan（HN）in China, was studied using the inter simple sequence repeat（ISRR）technique. The results
indicated that the values of percentage of polymorphic band, Nei’s gene diversity and Shannon’s information index were 54.20%-70.99%,
0.1564-0.2191 and 0.2421-0.3324. According to AMOVA analysis, there were significant（P < 0.001）genetic differences among the six
populations, 47.25%was attributed to among populations and the rest（52.75%）to differences within populations. The pairwise Fst =0.4725,
gene differentiation coefficient（GST=0.3705）among populations and gene flow（Nm=0.8497）indicated that greater genetic differentiation
occurred among the populations. Genetic drift was one of the main factors that affecting the population differentiation.
Key words: Onchidium struma Geographical population ISSR Genetic diversity Genetic differentiation
被大力开发，海岸环境的破坏污染日益严重，这对
以滩涂为主要栖息地的生物，尤其是石磺这一类对
环境污染敏感的生物造成极大的生存威胁。
保护生物多样性，其最终是保护其遗传多样性。
遗传多样性反应一个物种适应环境的能力及其进化
潜力［2］。对物种遗传多样性的研究可为其生存现状
2014年第9期 209王成暖等：中国沿海瘤背石磺不同地理群体遗传多样性的 ISSR 标记研究
和保护价值的评估提供非常重要的信息［3，4］。因此，
对生物资源开展合理开发利用和种质科学保护等一
系列工作，研究物种的遗传多样性和遗传结构有其
重要意义。ISSR（Inter simple sequence repeat，简单
重复序列区间）是由 Zietkiewicz［5］等创建的一种新
型分子标记技术。该技术因模板 DNA 用量少、多态
性丰富、稳定性好、操作简易等特点［6］，被广泛应
用于各种贝类的群体遗传学研究。Marco Casu 等［7］
通过 ISSR 标记发现濒危软体动物 Patella ferruginea
的两个不同地理群体间发生十分明显的遗传分化 ；
姜因萍等［8］通过 ISSR 标记研究大珠母贝的遗传多
样性 ；Dong 等［9］通过 ISSR 标记评估不同地理群体
苹果螺的遗传多样性。目前用 ISSR 标记对瘤背石磺
进行遗传多样性的研究尚未见报道。
因此，本文利用 ISSR 标记，对我国盐城（YC）、
上海（SH）、温州（WZ）、厦门（XM）、深圳（SZ）、
海南（HN）6 个不同地理群体的瘤背石磺的遗传多
样性进行了研究，以期为揭示中国沿海地区瘤背石
磺的群体遗传多样性和遗传结构状况，为评价瘤背
石磺的种质资源及其利用和保护等提供理论依据。
本研究一共选取了 6 个地理群体，共 150 个个体进
行多样性研究。地理群体的选择尽可能覆盖瘤背石
磺在我国的分布点，首次用 ISSR 标记对瘤背石磺地
理种群多样性进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用瘤背石磺分别采自盐城（YC）、上海
（SH）、温州（WZ）、厦门（XM）、深圳（SZ）、海南（HN）
6 个地理群体，每个地理群体 25 个个体，共计 150
个个体。样品活体运回实验室，解剖取腹足，分装
样品并保存于 75% 无水乙醇 4℃冰箱中备用。
1.2 方法
基 因 组 DNA 提 取 采 用酚-氯 仿 抽 提 法， 具 体
步骤参见文献［10］，-20℃保存备用。经优化的
PCR 反应体系为 ：25 μL 总体积中包括 2×Taq PCR
Master Mix 13 μL、ISSR 引物 1 μL、DNA 模板 1 μL、
去离子水 10 μL。采用的 PCR 反应程序为 94℃预
变 性 5 min，94℃ 变 性 30 s，52、52、52、42、52、
48、42、52、42℃ 退 火 45 s（ 表 1），72℃ 延 伸 40
s，30 个循环后，72℃延伸 10 min，4℃保存。利用
PCR 优化体系，筛选出 9 个重复性好、特异性高的
引物用于 PCR 扩增。PCR 扩增得到的产物经 1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测，EB 染色后，在凝胶成像系统
下观察并拍照记录（图 1）。
表 1 用于 ISSR 分析的 9 个引物序列及其退火温度
引物 序列（5 → 3） 退火温度（℃）
UBC809 （AG）8G 52
UBC862 （AGC）6 52
UBC865 （CCG）6 52
UBC866 （CTC）6 42
UBC867 （GGC）6 52
UBC868 （GAA）6 48
UBC880 GGA（GAG）2AG（GA）2 42
UBC881 （GGGTG）3 52
UBC895 （AG）2TTGGTAGCTCTTGATC 42
1.3 数据统计分析
根据得到的成像结果，统计扩增条带呈“10”
矩阵（位点处有条带标为 1，无条带标为 0）用于软
件分析。用 POPGENE（version 1.32）软件计算以下
遗传参数 ：多态位点比例、Nei’s 基因多样性指数、
Shannon’s 信息指数、居群间的遗传分化系数和基
因流、遗传相似度和 Nei’s 遗传距离。利用软件
ARLEQUIN［11］中的分子方差分析（AMOVA）得到
群体间、群体内的遗传分化及 Fst 值。基于 Nei’s
遗传距离，用 MEGA（version 4.0）软件中的组平均
法（UPGMA），对 6 个地理群体进行聚类分析。用
IBDWS 软件中的 Mantel 检测评估瘤背石磺群体的遗
传距离和地理距离的相关性。
2 结果
2.1 不同地理群体的遗传多样性
瘤背石磺 6 个地理群体的多态位点百分率分别
在 54.20%-70.99% 之间，Nei’s 基因多样性指数和
Shannon’s 信息指数分别在 0.1564-0.2191 和 0.2421-
0.3324 之间，从表 2 可见，SZ 群体的多态位点比例
高于其他居群，XM 群体的多态位点比例次之，YC
群体的多态位点比例最低。结合 Nei’s 基因多样性
指数和 Shannon’s 信息指数，SZ 和 XM 群体的遗传
多样性水平较高，YC 种群的遗传多样性水平较低。
在物种水平上，瘤背石磺的 Nei’s 基因多样性指数
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期210
及 Shannon’s 信息指数分别为 0.295 6 和 0.456 2。
遗传变异主要来自群体内，但群体间的变异也处
在较高水平。所分析的 6 个瘤背石磺地理群体间
Gst=0.3705，由 Gst 估算的基因流（Nm）为 0.849 7。
两两群体间遗传距离在 0.085 8-0.278 1 间，遗传分
化在 0.757 3-0.917 7 间，群体间的平均遗传距离为
0.176 9，平均遗传相似度为 0.839 4（表 4）。
bp
M
900
700
500
300
M 为 Maker Ⅱ
图 1 引物 UBC880 在 WZ 群体中扩增结果
表 2 瘤背石磺 6 个地理群体的遗传多样性
群体名称
多态位点
比例（%）
Nei’s 基因多样
性指数（H）
Shannon’s 信息
指数（I）
YC 54.20 0.1564±0.1805 0.2421±0.2628
SH 65.65 0.1755±0.1762 0.2751±0.2544
WZ 59.54 0.1873±0.1970 0.2833±0.2806
XM 68.70 0.2151±0.1950 0.3266±0.2736
SZ 70.99 0.2191±0.1947 0.3324±0.2733
HN 62.60 0.1631±0.1764 0.2563±0.2545
2.2 不同地理群体的遗传变异分析
AMOVA 分 析 表 明， 瘤 背 石 磺 47.25% 的 变 异
发生在群体间，52.75% 的变异发生在群体内，平
均 Fst 值 为 0.472 5（ 表 3）， 说 明 瘤 背 石 磺 群 体 的
表 3 瘤背石磺 6 个地理群体遗传变异的 AMOVA 分析
变异来源 自由度 df 平方和 方差组分 变异百分比（%） 固定指数 Φ-statistics
Among population 5 1510.040 11.56396 47.25 0.47252
Within populations 144 1858.880 12.90889 52.75
表 4 瘤背石磺 6 个地理群体的遗传距离 D（对角线下）和
遗传相似度 I（对角线上）
种群 YC SH WZ XM SZ HN
YC 0.7841 0.8558 0.8959 0.8779 0.7912
SH 0.2432 0.8791 0.8471 0.8228 0.7573
WZ 0.1557 0.1288 0.9177 0.8726 0.7886
XM 0.1100 0.1660 0.0858 0.9145 0.8152
SZ 0.1303 0.1950 0.1362 0.0894 0.7713
HN 0.2342 0.2781 0.2375 0.2043 0.2596
2.3 不同地理群体的聚类分析
根据所得遗传距离指数，用非加权的组平均法
（UPGMA）分别进行聚类分析（图 2）表明，WZ 群
体与 XM 群体最先聚为一支，HN 群体与其他群体的
遗传距离最远。经 Mantel 检测，瘤背石磺 6 个地理
群体的遗传距离与其地理距离无相关性（图 3）。
3 讨论
3.1 瘤背石磺的遗传多样性
物种的遗传多样性水平在一定程度上体现出物
种对环境的适应能力，物种的遗传多样性越高其对
环境的适应能力越好，更容易扩大分布范围和开拓
新的环境［12］。瘤背石磺群体遗传多样性（H：0.295 6，
I ：0.456 2）与其他海洋贝类比较，厚壳贻贝（H ：
0.341 0，I ：0.509 6）［13］， 扁 玉 螺（H ：0.339 5，I ：
0.511 3）［14］，长竹蛏（H ：0.285 4，I ：0.439 0）［15］，
显示瘤背石磺群体多样性水平处于中等水平。瘤背
石磺在我国东南沿海江苏、上海至广西及海南岛均
有分布［16］，因其分布较广相对于一些狭布种可能积
累较多的遗传变异获得更高的遗传多样性［17］。此外，
国家重视环境及野生动植物资源保护，建立了生态
保护区如盐城湿地国家生态保护公园、深圳华侨城
0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00
HN
SH
YC
SZ
XM
WZ
图 2 基于 Nei’s 遗传距离的瘤背石磺 6 个地理群体的
UPGMA 聚类图
2014年第9期 211王成暖等：中国沿海瘤背石磺不同地理群体遗传多样性的 ISSR 标记研究
湿地公园、海南东寨港国家级自然保护区等，为保
护野生物种的生物多样性创造有利条件。将瘤背石
磺 6 个地理群体间的遗传多样性进行比较，发现 YC
群体的多样性水平最低，在保护和可持续利用的过
程中要加以重视。SZ 群体和 XM 群体的多样性水平
相对其他地理种群较高，有相对丰富的遗传种质，
可作为今后开展瘤背石磺良种选育的优先选择。
3.2 瘤背石磺群体间的遗传分化
研究表明，同种不同群体遗传相似度 I=0.8-
0.97，遗传距离 D =0.03-0.2［18］。本研究中，瘤背石
磺群体间的平均遗传距离为 0.176 9，平均遗传相似
度为 0.839 4，属于同种不同地理群体。Balloux 等［19］
指出 Fst ＞ 0.25 时，表示群体间遗传分化极大。本研
究中，6 个瘤背石磺地理种群的平均 Fst 值为 0.472 5，
说明种群间的遗传分化程度较高。对于群体分化的
原因，Mantel 检测显示瘤背石磺群体的遗传距离和
地理距离无显著相关性。UPGMA 聚类结果也显示遗
传距离和地理距离没有显著相关，如 YC 群体和 SH
群体虽然地理距离较近，但在聚类结果里并没有聚
在一起。Ye 等［20］采用 ISSR 标记对中国东海厚壳贻
贝群体遗传结构分析，结果显示厚壳贻贝群体的遗
传距离和地理距离无显著相关性。故推测造成瘤背
石磺群体遗传分化的原因可能是其他因素造成。根
据群体遗传学理论，不管居群大小，如果基因流 Nm
< 1，遗传漂变就成为影响居群遗传结构的主要因素；
当居群间的基因流 Nm ≥ 1 时，就可以防止由遗传
漂变引起的居群间遗传分化［21］。瘤背石磺 6 个地理
群体间的基因流 Nm= 0.8497，不足以防止因遗传漂
变引起的遗传分化。且瘤背石磺雌雄同体，异体交
配，体内受精［22］，浮游幼虫期仅 1-2 周，自然水流
的作用下只能在较小范围内形成基因交流，且不同
地理群体的瘤背石磺因环境温度不同造成繁殖时间
不同［23］。此外，由于气候变化、水环境污染、滩涂
围垦和人为滥捕等原因，一些地区石磺群体数量迅
速下降甚至已经绝迹。这种现象可能导致瘤背石磺
群体分布的不连续性，阻碍群体间的基因交流。由
此推断各瘤背石磺群体间缺少基因交流，遗传漂变
可能是影响瘤背石磺地理群体分化的原因。
4 结论
本研究中的瘤背石磺采自 6 个不同地理群体，
通过 ISSR 标记技术发现，瘤背石磺群体的遗传多样
性处于中等水平，各地理群体间发生了遗传分化。
经 Mantel 检测显示瘤背石磺群体的遗传距离和地理
距离无显著相关性，各地理群体间基因流 Nm < 1，
推断各瘤背石磺群体间缺少基因交流，遗传漂变可
能是影响瘤背石磺地理群体分化的原因。
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0.00
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0.06
0.09
0.12䚇Ր䐍⿫Fst٬ ൠ⨶䐍⿫ሩᮠ٬0.150.180.21
0.24
P=0.0890
r=.37060.27
0.30
799 1199 1599 1999
图 3 瘤背石磺 6 个地理群体的 IBD 分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期212
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（责任编辑 李楠）