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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):186-192
瘤背石磺（Onchidium struma）俗称土海参、海
癞子、土鸡、乌纱鳖、涂龟、土鲍等，属于软体
动 物 门（Mollusca） 腹 足 纲（Gastropoda） 肺 螺 亚
纲（Pulmonata）柄眼目（Stylommatophora）石磺科
（Onchidiidae），全身裸露无壳，是用肺呼吸的一种
进化贝类［1］。在我国主要分布于江苏、上海、浙江、
收稿日期 ：2015-01-14
基金项目 ：国家自然科学基金项目（41276157），上海高校水产学一流学科建设项目
作者简介 ：程知庆，女，硕士研究生，研究方向 ：海洋生物资源研究与开发 ；E-mail ：986256709@qq.com
通讯作者 ：沈和定，男，博士，教授，研究方向 ：海洋生物学 ；E-mail ：hdshen@shou.edu.cn
瘤背石磺多糖提取工艺优化及其体外抗氧化活性评价
程知庆  沈和定  姚理想  刁亚  刘宸
（上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306）
摘 要 ： 采用传统的热水浸提法提取瘤背石磺多糖，运用响应面法优化多糖的提取工艺，并以粗多糖对其体外抗氧化活
性作初步研究。通过单因素实验，探讨浸提温度、浸提时间、料液比对瘤背石磺多糖提取率的影响并选取实验水平，采用 Box-
Behnken 设计实验方案，利用 Design-Expert 8.05 软件分析数据。通过清除羟基自由基和 DPPH 自由基的能力来检测多糖抗氧化性能。
结果显示，最佳水提条件为浸提温度 92℃、浸提时间 30 h、料液比 1∶29（g/mL），在最优工艺条件下瘤背石磺多糖的提取率为
9.206%，瘤背石磺多糖对羟基自由基和 DPPH 自由基都具有一定的清除率。采用该方法优化提取多糖，合理可靠，为以后的工业
化生产提供理论依据，且多糖具有明显的体外抗氧化活性。
关键词 ： 瘤背石磺 ；多糖 ；提取工艺 ；响应面法 ；抗氧化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.027
Process Optimization of Extracting Polysaccharides from Onchidium
struma，and Evaluation of Its Antioxidant Activity in Vitro
Cheng Zhiqing Shen Heding Yao Lixiang Diao Ya Liu Chen
（Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources，Shanghai Ocean University，Ministry of Education，
Shanghai 201306）
Abstract ： Taking Onchidium struma as the raw material, its polysaccharides was extracted by the traditional method of hot water.
Process of extracting polysaccharides from O. struma was optimized by response surface methodology. Through the single factor experiment,
the effects of extraction temperature, extraction time, and liquor-to-material ratio to the extraction rate of polysaccharide were investigated.
Furthermore, the experiments were done by Box-Behnken, and the data was analyzed by Design-Expert 8.05 software. Antioxidant activity of O.
struma polysaccharides was determined by the capacity of scavenging free hydroxyl radical and DPPH radical. On the basis of the analysis of
regression equation, determination of factors affecting the extraction of polysaccharide was conducted by the extraction rate of polysaccharide
served as response value. Extraction temperature at 92℃, extraction time of 30 h, and liquor-to-material ratio of 1∶29 g/mL, leaching rate of O.
struma polysaccharide reached 9.206%. O. struma polysaccharide had ability to clear off free hydroxyl radical and DPPH radical. Conclusively,
the extraction technology is reasonable and reliable for the extraction of polysaccharides O. struma, which provides the theoretical support for the
future industrial production, and its polysaccharides have significant antioxidation in vitro.
Key words ： Onchidium struma ；polysaccharide ；extraction ；response surface method ；antioxidation effect
2015,31(8) 187程知庆等：瘤背石磺多糖提取工艺优化及其体外抗氧化活性评价
福建、广东、香港、海南、广西等地，其生长在陆
地和海洋的过渡带，分布于滩涂潮间带高潮线附近。
民间流传瘤背石磺具有滋补、壮阳、清凉、祛火、
祛湿等功效［2-4］。营养成分分析结果表明，瘤背石
磺具有较高的药用价值和保健作用［5］。
研究发现贝类多糖也具有多种生物活性及药用
价值，紫贻贝［6］多糖具有良好的抗氧化活性 ；范秀
萍［7］研究发现波纹巴非蛤多糖（PUG-1）对高脂模
型小鼠具有较好的降低血脂与预防动脉粥样硬化作
用，贝类多糖还具有如抗肿瘤［8-10］、抗病毒［11］、抗
衰老［12］等生物活性，从生物体内提取出来的多糖
对正常细胞毒副作用小，多糖药物的研制成为当今
世界新药的重要发展方向之一，从而使多糖生物资
源的开发和利用成为了研究热点。管菊［13］在研究
中发现瘤背石磺中的总糖含量约为 26.06%，目前国
内外关于石磺的研究主要集中在系统分类、生物学
特性、受精机制、繁殖、胚胎发育、神经系统以及
营养价值等方面，其多糖的提取、工艺条件优化及
其生物活性的研究报道几乎没有。考虑到实际实验
的可操作性及实验室仪器的局限性，综合考量最后
采取经典的多糖提取法——热水浸提醇沉法，该法
具有经济、简单、容易操作，仪器设备易得的优点。
李雪梅［14］利用热水浸提法提取出扇贝中的水溶性
多糖，并对提取条件进行优化。本研究采用热水浸
提法提取瘤背石磺中的多糖，通过响应面法［15，16］
实验设计对多糖的提取工艺条件进行优化，并对粗
多糖的体外抗氧化能力做初步测定，以期为瘤背石
磺生物活性物质的研究和开发提供一些参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 瘤背石磺预处理 瘤背石磺（采自上海崇明
岛）解剖去其内脏，置于 -80℃的低温下备用。
1.1.2 试剂 无水葡萄糖、苯酚、浓硫酸、1，1- 二
苯基 -2- 苦肼基（DPPH 自由基）、水杨酸、硫酸亚铁、
过氧化氢等化学试剂均为分析纯。
1.1.3 仪器 多功能粉碎机（永康市小宝电器有限
公司），AL104 电子分析天平（精确至 0.0001 g，梅
特勒 - 托利多仪器（上海）有限公司），美谱达 UV-
6100 型紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公
司），DHG-9077A 型电热恒温干燥箱（上海精密实
验设备有限公司），HWS-26 双列六孔恒温水浴锅（上
海慧泰仪器制造有限公司），TDL-40B 低速台式大容
量离心机（上海圣科仪器设备有限公司），MLLI-Q
超纯水仪（美国 Millipore 公司）。
1.2 方法
1.2.1 瘤背石磺粗多糖的提取工艺流程 瘤背石磺
→绞碎→石油醚浸泡 12 h →乙醇浸泡 4 h → 50℃烘
箱烘干→水浴浸提→过滤离心→取上清液→浓缩→
脱蛋白（Sevage 试剂脱蛋白）→离心（除蛋白）→
透析（4 d）→浓缩→醇沉（加入 4 倍体积 95% 乙醇，
4℃静置过夜）→离心 45℃恒温干燥→灰白色瘤背
石磺粗多糖。
1.2.2 葡萄糖标准曲线的描绘 多糖含量的测定采
用苯酚 - 硫酸法［17］，绘制标准曲线（图 1），得回
归方程为：y=0.0075x+0.0012，R2=0.9927，结果表明，
葡萄糖的微克含量在 16-72 μg 范围内，线性关系
良好。
1.2.3 瘤背石磺提取液中多糖含量的测定 准确称
取瘤背石磺干燥粉 1 g，放入 50 mL 的锥形瓶中，按
照设定的料液比加入蒸馏水，在设定的时间和温度
下提取，过滤离心分离，取上清液，按照苯酚 - 硫
酸法测定并计算提取液中多糖的含量。计算方程
如下 ：
多糖的提取率（%）=C×N×V/M×10-3×100%
式中，C 为待测液的浓度 ；N 为稀释倍数 ；V 为待测
液体积 ；M 为样品质量。
1.2.4 单因素实验 通过热水浸提法，分别考察料
液比（20、30、40、50 和 60 mL/g），提取温度（80、
85、90、95 和 100℃），提取时间（15、20、25、30
和 35 h）这 3 个因素进行单因素的优化实验，采用
苯酚 - 硫酸法测石磺多糖浓度，以多糖得率为指标，
考察各个因素对瘤背石磺多糖得率的影响。
1.2.5 响应面实验 在上述单因素基础上，根据
Box-Behnken Design（BBD）中心组合实验设计原理，
设计出 3 因素 3 水平实验方案［18］。以瘤背石磺多糖
的提取率为响应值，利用 Design Expert 8.05 软件对
实验结果进行数据分析，得出最佳提取工艺条件。
实验因子和水平，见表 1。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8188
表 1 响应面设计因素与水平表
因素
编码水平
-1 0 1
A（浸提温度 /℃） 85 90 95
B（浸提时间 /h） 25 30 35
C（料液比 mL/g） 20 30 40
1.2.6 瘤背石磺多糖体外抗氧化实验
1.2.6.1 清除 DPPH 自由基能力的测定 参照陈玉
琴等［19］的实验方法，略有改动，降低了其中 DPPH
自由基的浓度为 0.5 mmoL/L，进行实验，重复实验
3 次，求取平均值，以 VC 作对比。
清除率（%）=［1-（A 样品 -A 空白）/A 对照］×100%
1.2.6.2 清除羟基自由基能力的测定 参考李粉玲
等［20］的实验方法，略有改动，10 倍稀释了实验试
剂的浓度，并延长反应时间至 30 min。重复实验 3
次，求取平均值，以 VC 作对比。
清除率（%）=［1-（A 样品 -A 空白）/A 对照］×100%
2 结果
2.1 瘤背石磺多糖提取的单因素实验
2.1.1 温度对总糖得率的影响 图 1 显示，随着浸
提温度的提高，瘤背石磺多糖的提取率明显增高，
当温度高于 90℃时，多糖的提取率增加相对缓慢。
由于加热时间过长，受实验条件限制，温度最高只
能稳定在 95℃，所以浸提温度选择 85℃-95℃。
趋势，在料液比为 30 mL/g 时提取率达到最高，随
着料液比的继续增大，提取率降低。故选择 30 mL/g
为响应面的最优值。
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
80 85 90 ⑙ᓖćᨀਆ⦷% 95 100 105
图 1 浸提温度对瘤背石磺多糖提取率的影响
2.1.2 时间对总糖得率的影响 图 2 显示，随浸提
时间的延长瘤背石磺多糖的提取率不断提高，浸提
时间达到 30 h，提取率达到最大值。随着浸提时间
的延长，提取率下降。故选择浸提时间在 30 h 左右。
2.1.3 料液比对总糖得率的影响 图 3 显示，当料
液比低于 30 mL/g 时，多糖的提取率一直呈现上升
8
10
6
4
2
0
15 20 25ᨀਆᰦ䰤hᨀਆ⦷% 30 35 40
图 2 浸提时间对瘤背石磺多糖提取率的影响
8.0
7.5
7.0
6.5
5.5
6.0
20 30 40ᯉ⏢∄mL·g-1ᨀਆ⦷% 50 60 70
图 3 料液比对瘤背石磺多糖提取率的影响
2.2 响应面法优化实验
依据单因素实验结果，选择浸提温度、浸提时
间、料液比 3 个因素为响应面实验的自变量，以多
糖提取率为响应值，进行 3 因素 3 水平的优化实验。
利用 Design expert 8.05 软件进行数据处理和回归分
析，结果如表 2 所示。
2.2.1 模型方程的建立与显著性检验 通过 Design-
Expert 8.05 软件对表 2 中的数据进行处理，得到多
糖提取率对浸提温度、浸提时间、料液比 3 个因素
的二次多项回归方程为 ：
R1=-312.57062+7.07377A-0.10520B-0.056838C+
0.018870AB+7.13000×10-3AC-4.66500×10-3BC-
0.042800A2-0.024870B2-7.86500×10-3C2
对该模型进行方差分析，结果（表 3）显示，
P<0.000 1， 表 明 模 型 极 显 著 ；失 拟 项 P=0.576 5>
0.05，没有显著性，说明所选的模型对该实验拟
合程度较好，误差较小。其中模型的复相关系数
R2=0.990 0，校正后的 R2=0.977 2，说明该模型可以
2015,31(8) 189程知庆等：瘤背石磺多糖提取工艺优化及其体外抗氧化活性评价
解释 97.72% 的响应值 Y 的变化，预测 R2 值 0.932 5
与校正的值 0.977 2 相差不大，表明实验的实际值与
预测值拟合的较好。
A、B、C 三个因素的一次项均小于 0.01，说
明这 3 个因素对多糖提取率都极显著。交互项 AB、
AC 都小于 0.01，均达到了极显著的水平，BC 小于 0.05
达到显著水平，3 个因素的二次项均达到极显著水
平（P<0.01），说明 3 个因素之间都存在一定的交互
作用，且因素之间的交互作用对多糖提取率都显著
影响。表 3 的方差分析显示，3 个因素对瘤背石磺
多糖提取率的影响程度依次为 A（浸提温度）>C（料
液比）>B（浸提时间）。
2.2.2 瘤背石磺多糖的响应面分析 利用 Design
Expert 8.05 软件，绘制各影响因素对瘤背石磺多糖
的响应曲面图，根据响应曲面的坡度和等高线的形
状可以比较判断各因素及其交互作用对提取率影响
的强弱。该拟合方程的二次项系数都是负数，所以
图 4- 图 6 中每个响应曲面都是开口向下的凸形曲面，
等高线沿某一因素轴方向曲线的疏密程度反映在响
应曲面上表现为曲面的陡峭程度，等高图上曲线越
密，响应曲面则越陡，说明响应值对该因素的变化
较敏感，图 4- 图 6 中的响应面 3D 图显示，当各因
素在一定范围内增大时，响应值也随之增大，当各
因素超出响应面极值继续增加时，响应值则减小，
等高图中的中心点投影在 3D 图中为最高点，则该
点的提取率最高，而根据等高线图 4- 图 6 中等高线
沿各自轴方向的疏密程度可以比较出各因素的影响
力大小分别是 ：A>B、A>C、C>B。等高线的形状可
反映出交互影响的强弱，椭圆形表示两因素交互作
用显著，而圆形则与之相反，图 4- 图 6 中的等高曲
线都是椭圆形，说明浸提温度和浸提时间、浸提温
度和料液比、浸提时间和料液比之间交互作用较为
显著且各因素之间的交互作用对多糖的提取率影响
显著。最后得出 3 种因素对多糖提取率的影响是 ：
A（浸提温度）>C（料液比）>B（浸提时间），该结
果与回归模型显著性检验相吻合。
2.2.3 优化与验证实验 根据上述响应面的模型与
结果分析，得到最佳条件下的瘤背多糖的提取率为
9.206%，其中浸提温度为 91.65℃，浸提时间 29.93 h，
料液比 29.05 mL/g。为了检测响应面法所得数据的
可靠性，同时也为了实验操作方便，选取浸提温度
92℃，浸提时间 30 h，料液比 29 mL/g。在此条件下，
平行重复实验 3 次的平均值为（9.062±0.091）%。
实际测得的平均值与理论预测值相差很小，说明该
模型可靠性高，工艺的重复性好。
表 2 瘤背石磺多糖提取率的响应面实验方案及结果
序号
因素
提取率 /%
A B C
1 0 1 -1 7.959
2 0 0 0 9.171
3 1 1 0 8.445
4 1 0 1 8.124
5 0 -1 1 7.827
6 -1 0 -1 7.012
7 -1 -1 0 7.251
8 -1 0 1 5.871
9 0 -1 -1 8.012
10 -1 1 0 6.046
11 0 0 0 8.951
12 0 0 0 9.186
13 0 1 1 6.841
14 1 0 -1 7.839
15 1 -1 0 7.763
16 0 0 0 9.198
17 0 0 0 8.834
注 ：A ：浸提温度 /℃；B：浸提时间 /h ；C：料液比 /（mL·g-1）
表 3 拟合二次多项式模型的方差分析
方差来源
自由度 平方和 均方
F 值
P 值
显著性
（DF） （SS） （MS） （Pr>F）
模型 9 17.04 1.89 77.17 <0.0001 **
A 1 4.49 4.49 182.90 <0.0001 **
B 1 0.30 0.30 12.43 0.0096 **
C 1 0.58 0.58 23.75 0.0018 **
AB 1 0.89 0.89 36.29 0.0005 **
AC 1 0.51 0.51 20.73 0.0026 **
BC 1 0.22 0.22 8.87 0.0206 *
A2 1 4.82 4.82 196.52 <0.0001 **
B2 1 1.63 1.63 66.36 <0.0001 **
C2 1 2.60 2.60 106.18 <0.0001 **
残差 7 0.17 0.025
失拟误差 3 0.062 0.021 0.75 0.5765
纯误差 4 0.11 0.027
总差 16 17.21
注 ：* ：P<0.05，差异显著 ；** ：P<0.01，差异极显著
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8190
2.3 瘤背石磺多糖体外抗氧化实验
2.3.1 DPPH 自由基清除能力 图 7 显示，在测定
的浓度范围内，VC 和瘤背石磺多糖对 DPPH 自由基
都有较强的清除能力，但与多糖相比，VC 的清除能
力明显更强且一直维持在较高水平。多糖对 DPPH
自由基的清除力随着瘤背石磺多糖浓度的增加呈正
相关关系，当浓度大于 2 mg/mL 时，多糖对 DPPH
自由基的清除率明显增强。当多糖浓度为 10 mg/mL
时，清除率最高达到 76.98%。对 DPPH 的清除率
IC50 为 4.36 mg/mL。
2.3.2 羟基自由基清除能力 图 8 显示，在测定的
多糖浓度范围内，瘤背石磺多糖和 VC 均对羟基自
25.00 85.00
87.00
89.00
91.00
93.00
95.00
35.00
33.00
5
31.00
29.00
27.00
25.00
85.00 87.00 89.00 91.00 93.00 95.00
27.00
29.00
31.00
33.00
35.00
6.5
7.5
8.5
9.5
9
8
7ᨀਆ⦷% ᨀਆ⦷%
B: ⎨ᨀᰦ䰤 B: ⎨ᨀᰦ䰤A: ⎨ᨀ⑙ᓖ
A: ⎨ᨀ⑙ᓖ987 8
图 4 提取率 f=（A，B）响应曲面及等高线图（C=30.00）
25.00 85.00
87.00
89.00
91.00
93.00
95.00
40.00
35.00
30.00
25.00
20.00
85.00 87.00 89.00 91.00 93.00 95.0027.00
29.00
31.00
33.00
35.00
6.5
7.5
8.5
9.5
9
8
7ᨀਆ⦷% ᨀਆ⦷%
C: ᯉ⏢∄ C: ᯉ⏢∄A: ⎨ᨀ⑙ᓖ
A: ⎨ᨀ⑙ᓖ
87
8
8
7.5
8.5
7.5
6.5
图 5 提取率 f=（A，C）响应曲面及等高线图（B=30.00）
25.00
27.00
29.00
31.00 33.00
35.00
40.00
35.00
30.00
25.00
20.00
25.00 27.00 29.00 31.00 33.00 35.00
20.00
25.00
30.00
35.00
40.00
6.5
7.5
8.5
9.5
9
8
7ᨀਆ⦷% ᨀਆ⦷%
C: ᯉ⏢∄ C: ᯉ⏢∄B: ⎨ᨀᰦ䰤
B: ⎨ᨀ⑙ᓖ 8
8
8 8
7.5
8.5
8.5
图 6 提取率 f=（B，C）响应曲面及等高线图（A=90.00）
2015,31(8) 191程知庆等：瘤背石磺多糖提取工艺优化及其体外抗氧化活性评价
由基有较强的清除力。与多糖相比，VC 的清除能力
更强且一直维持在较高的水平。瘤背石磺多糖对羟
基自由基的清除力随多糖浓度的增加而增强，最高
清除率达到 80%。说明瘤背石磺多糖对羟基自由基
的清除能力达到较高的水平。对羟基自由基的清除
率 IC50 为 3.12 mg/mL。
而使多糖的提取率上升，所以在适度范围内浸提温
度的升高有利于多糖的提取，但温度过高会破坏多
糖的结构，部分多糖水解为单糖或低聚糖，从而导
致多糖提取率下降［21］；在一定的浸提时间内，多糖
随着浸提时间的延长，在水中的溶解度不断增加，
当多糖扩散达到平衡时，多糖的提取率下降，浸提
时间过长会影响甚至破坏多糖结构从而导致多糖的
提取率下降 ；浓度梯度是提取的动力，在一定范围
内提高料液比有利于多糖的提取，但当料液比超过
某一极限时，再提高料液比则效果不明显，同时考
虑到节约能源，所以选择最优料液比为 30 mL/g。
在多糖抗氧化实验中，以 VC 作为阳性对照，
考察多糖对两种自由基的清除能力。首先 DPPH 自
由基由于其化学结构中含有十分活泼的单电子，其
醇溶液呈紫色，并且在 517 nm 处有一强吸收峰，瘤
背石磺多糖的加入可以捕获并清除其单电子，导致
溶液褪色和吸收强度的减弱［22］；其次根据 Fenton 反
应，H2O2 与 Fe
2+ 发生氧化还原反应，生成 OH·自由
基，其存活时间较短但具有极高的反应活性，与水
杨酸结合生成一种在 510 nm 处有强吸收的有色物
质，抗氧化剂多糖的加入清除并降低了 OH·自由基
的浓度，则有色物质生成量减少，溶液颜色变淡且
吸光度减小［23］。
4 结论
利用响应面法优化瘤背石磺多糖提取的工艺条
件，确定多糖的最佳提取工艺为浸提温度 92℃，浸
提时间 30 h，料液比 29 mL/g，提取率为 9.062%。
对瘤背石磺多糖体外抗氧化实验表明，在一定的浓
度范围内，多糖对 DPPH 自由基和羟基自由基的清
除能力都较强。
参 考 文 献
［1］Britton KM. The Onchidiacea（Gastropoda, Pulmonata）of Hong
Kong with a worldwide review of the genera［J］. Journal of
Molluscan Studies, 1984, 50（3）：179-191.
［2］邱立言 . 苏沪沿海瘤背石磺的形态和习性［J］. 动物学杂志 ,
1991, 26（3）：33-36.
［3］ 沈和定 , 陈汉春 , 陈贤龙 , 等 . 石磺繁殖生物学的实验研究［J］.
水产学报 , 2006, 30（6）：753-760.
120
60
80
100
40
20
0
0 2 4 ⎃ᓖmg·mL-1␵䲔⦷% 6 8 12VCཊ㌆10
图 7 瘤背石磺多糖对 DPPH 自由基的清除率
100
120
60
80
40
20
0
0 1 2 ⎃ᓖmg·mL-1␵䲔⦷% 3 4 5 6VCཊ㌆
图 8 瘤背石磺多糖对羟基自由基的清除率
3 讨论
本实验对瘤背石磺多糖提取工艺条件进行优化，
对其抗氧化活性进行评价。选取 3 个影响因素（浸
提温度、浸提时间、料液比）进行单因素的优化实
验，在单因素基础上，根据 Box-Behnken Design（BBD）
中心组合实验设计原理，以多糖提取率为响应值，
设计出 3 因素 3 水平实验方案，利用 Design Expert 8.05
软件对实验结果进行数据分析，得出最佳提取工艺
条件。通过多糖清除 DPPH 自由基和羟基自由基的
能力来评价多糖的抗氧化活性。
在单因素的实验中，浸提温度、浸提时间和料
液比对多糖提取率的影响均呈现先升高后降低的趋
势。当浸提温度低于 95℃时，随着温度的逐渐升高，
分子的运动加剧，加快了多糖溶解扩散的速度，从
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8192
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（责任编辑 马鑫）