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第43卷 第4期
2013年4月
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSITY OF CHINA
43(4):058~062
Apr.,2013
管角螺遗传多样性的AFLP分析
*
潘 英1,慕翠敏2,李 琪2,苏翔驹1,区小玲1,何俊锋1,吴雪萍1,陈德金1
(1.广西大学动物科技学院,广西 南宁530004;2.中国海洋大学水产学院,山东 青岛266003)
摘 要: 近年来,由于对管角螺的捕捞强度加大,其自然资源大大减少。为进一步了解管角螺的遗传变异和群体结构状
况,本文首次利用AFLP(Amplified fragment length polymorphism,扩增片段长度多态性)分子标记技术对我国南方沿海
管角螺5个地理群体(连云港、温州、台山、湛江、防城港)进行遗传多样性分析。采用2对AFLP引物组合对管角螺5个群
体的150个个体进行扩增,共扩增出310个位点,多态位点277个,多态位点比例为89.35%,基因多态性分别为0.382 4、
0.476 6、0.393 8、0.437 4和0.392 8,说明5个群体的遗传多样性存在一定的差异。群体间及群体内遗传分化指数表明,
管角螺5个地理群体的遗传变异主要来自于群体内个体间,而群体间无明显的遗传分化。UPGMA(非加权组对平均法)
系统树分析表明,湛江和防城港群体间的亲缘关系较近,而台山和温州群体间的亲缘关系较远。
关键词: 管角螺;地理群体;AFLP;遗传多样性
中图法分类号: Q953 文献标志码: A 文章编号: 1672-5174(2013)04-058-05
管角螺(Hemifusus tuba)隶属于软体动物门
(Molusca),腹足纲(Gastropoda),盔螺科(Galeodi-
ae),角螺属(Hemifusus),俗称角螺、响螺、海螺、号螺,
为热带和亚热带浅海暖水性较大型的经济腹足类。在
我国主要分布在江苏、浙江、福建、广西、广东和海南等
省的沿海地区。近年来,由于捕捞强度加大,其自然资
源大大减少。了解管角螺的遗传结构和种质资源状
况,对确保我国管角螺种质资源的合理利用具有重要
的现实意义。
目前,国内外有关角螺的研究主要集中在管角螺
的摄食、繁殖、摄食及饥饿对其幼体的影响、幼螺生长
及种内残杀[1-3]、呼吸和循环方面的动力学[4];国内主
要在繁殖发生[5-9]、人工育苗[10-11]、生态习性[12-13]、营养
成分分析[14-16]和生化代谢[17-20]、染色体核型[21]、角螺
属齿舌形态的比较[22]等方面。
当前有关管角螺种群遗传学研究,仅见形态差异
用于区分管角螺不同地理种群间的研究报道[23],以及
利用RAPD分子标记对管角螺不同地理群体进行研
究[24]。我国管角螺的主要地理群体的遗传基础背景依
然模糊,缺乏对中国沿海管角螺种质资源状况的全面
了解。本研究采用AFLP技术首次对我国南方沿海管
角螺的遗传变异进行分析,为开展管角螺人工繁育和
资源保护提供遗传背景资料。
1 材料与方法
1.1材料
图1 管角螺样品采集地点
Fig.1 Sample sites of H.tubaalong the coast of China
本实验选用的管角螺5个地理群体样品分别于
* 基金项目:国家自然科学基金项目(31060353);广西科技攻关项目(11107012-9);南宁市科技开发计划项目(201102045B);广西海洋生物技术
重点实验室开放基金项目(GLMBT-201201)资助
收稿日期:2012-04-11;修订日期:2012-08-27
作者简介:潘 英(1968-),教授,博导,从事海洋贝类遗传育种研究。E-mail:nnpying@sohu.com
4期 潘 英,等:管角螺遗传多样性的AFLP分析
2007年11月采集于广东湛江(ZJ)、浙江温州(WZ),
2008年3月采集于江苏连云港(LYG),2008年8月采
集于广东台山(TS)与广西防城港(FCG)自然海区。样
品的采集地点见图1。所取样品均活体运输到实验室,
每个群体随机抽取了30个个体作为研究对象,解剖取腹
足肌,置无水乙醇于-20℃中保存,用于DNA提取。
1.2方法
1.2.1基因组DNA的提取及检测 取冷冻样品约
50~100mg腹足肌肉组织并切成接近粉末状,采用
CTAB法[25]并稍加改进抽提基因组DNA,TE缓冲液
溶解,1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度及纯度,
并稀释到100ng/μL,-20℃保存用于AFLP实验。
1.2.2AFLP分析 PCR选择性扩增反应在预实验
中使用了4种EcoR I引物和4种 Mse I引物共16对
引物组合。根据预实验结果,从扩增带数目适中、条带
清晰、多态性高的引物组合中选取了E-AGG/M-CTG
和E-AAG/M-CTG这2对引物组合,对管角螺5个地
理群体进行AFLP分析,实验方法参照 Kong等[26]的
方法。扩增产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳
分离,银染后统计条带。
1.3数据分析
根据各群体基因组DNA的 AFLP标记电泳检测
结果,对电泳图谱中同一位置上 AFLP条带的有无进
行统计,有条带出现记为“1”,无条带记为“0”,获得0、1
原始数据矩阵。根据统计结果,采用软件 AFLP-
SURV 1.0[27]进行数据分析并计算群体遗传学参数,
采用TFPGA软件的UPGMA进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1AFLP扩增结果
通过筛选的2对AFLP引物组合对管角螺5个群
体共150个个体进行了扩增,获得310条片段大小在
90~300bp之间的条带。2对引物组合共扩增出310
个位点,多态位点277个,多态位点比例为89.35%。
平均每对引物组合扩增出155条带,其中138.5条带
呈现出多态性。对各引物组合扩增的条带数和多态性
条带比例的统计结果显示,不同的引物组合扩增的结
果存在一定差异(见表1)。
表1 2对AFLP引物组合的检测结果
Table 1 Amplification results of two AFLP primer combination sets
引物组合
Primer pair
总带数
Total bands
单态性条带数
Monomorphic bands
多态性条带数
Polymorphic bands
多态带百分数/%
Percent of polymorphic bands
E-AGG/M-CTG 160 22 138 86.25
E-AAG/M-CTG 150 11 139 92.67
合计 Total 310 33 277
平均 Average 155 16.5 138.5 89.35
2.2地理群体的遗传结构及遗传多样性分析
2对选择性引物在5个群体的310个位点中,未发
现种群间特异性位点。管角螺群体的遗传多样性指数
见表2。从表2可知,5个群体的多态位点数均为
100%。基因多样性为0.382 4~0.476 6,最高为LYG
群体的0.476 6,最低为ZJ群体的0.382 4,5个群体的基
因多样性关系由大到小为LYG>FCG>WZ>TS>ZJ。
表2 管角螺5个群体的遗传多样性
Table 2 Genetic diversity of five populations of H.tuba
群体名称① 个体数② 多态位点③P/% 基因多样性④He/%
湛江ZJ 30 89.39 0.382 4
连云港LYG 29 88.35 0.476 6
温州 WZ 27 90.24 0.393 8
防城港FCG 26 89.32 0.437 4
台山TS 30 89.47 0.392 8
①Population name;② Number;③Polymorphic loci;④ Gene diversity
2.3地理群体间的遗传分化、相对遗传距离和聚类分
析
群体间的配对比较Fst值见表3。管角螺5个地理
群体间的遗传分化指数Fst=0.066 0,即有6.6%的遗
传变异存在于群体之间,绝大部分(93.4%)存在于群
体内,显示各群体间的分化程度较弱,而群体内的遗传
变异程度较高。各群体遗传分化指数 Fst中,ZJ与
FCG群体的Fst最小,为0.003 4(<0.05),故ZJ与
FCG群体的分化程度微弱;而 WZ与TS群体的Fst最
大,为0.166 7(0.15<0.166 7<0.25),分化程度较
大;其余群体大多属于分化中等。
5个地理群体间的遗传距离见表4。各群体间的
遗传距离0.003 4~0.182 4。其中ZJ与FCG群体的
最小,为0.003 4,遗传相似性最高;WZ与TS群体的
最大,为0.182 4,遗传相似性最低,与遗传分化指数相
近。
95
中 国 海 洋 大 学 学 报 2 0 1 3年
表3 管角螺5个群体间配对比较Fst值
Table 3 Pairwise comparion of five populations of H.tuba
群体Population 湛江ZJ 连云港LYG 温州 WZ 防城港FCG 台山TS
湛江ZJ 0.000 0 0.059 0 0.070 2 0.003 4 0.070 3
连云港LYG 0.059 0 0.000 0 0.053 7 0.026 2 0.083 9
温州 WZ 0.070 2 0.053 7 0.000 0 0.061 1 0.166 7
防城港FCG 0.003 4 0.026 2 0.061 1 0.000 0 0.058 9
台山TS 0.070 3 0.083 9 0.166 7 0.058 9 0.000 0
表4 管角螺5个群体间的遗传距离
Table 4 Genetic distance of 5populations of H.tuba
群体
Population
湛江
ZJ
连云港
LYG
温州
WZ
防城港
FCG
台山
TS
湛江ZJ 0.000 0
连云港LYG 0.060 8 0.000 0
温州 WZ 0.0728 0.055 2 0.000 0
防城港FCG 0.003 4 0.026 5 0.063 1 0.000 0
台山TS 0.072 9 0.087 6 0.182 4 0.060 7 0.000 0
利用TFPGA软件UPGMA法对管角螺5个群体
进行聚类分析(见图2),结果显示,ZJ与FCG群体首
先聚为一类,尔后与LYG群体聚在一起,最后为 TS
与 WZ群体。说明ZJ与FCG群体二者的遗传差异较
小,亲缘关系最近,而 WZ群体与其他4个群体间的遗
传差异较大,亲缘关系较远。
图2 管角螺5个群体的UPGMA聚类图
Fig.2 UPGMA dendrogram of 5populations of H.tuba
3 讨论
3.1我国管角螺自然群体的遗传多样性和种质资源状
况
遗传多样性是评价物种资源状况的一个重要依
据,是物种适应周围环境变化、维持生存和进化的遗传
基础。管角螺自然分布主要在我国东、南沿海,尤其是
我国浙江以南、广东、广西、福建和海南沿海等地。由
于我国海岸线漫长,地形复杂,因长期地理隔离和生态
环境不同,导致不同海域的管角螺在壳形态等外观特
征和DNA水平上均存在一定的差异。
本研究首次采用AFLP技术对我国管角螺5个地
理群体进行了遗传多样性分析表明,结果呈现出丰富
的多态性和较高的灵敏度,检测效率高,表明AFLP技
术适用于管角螺的群体遗传学研究。在扩增出的310
个位点中有277个多态位点,多态位点比例为89.35%,
显示了我国管角螺野生种群的遗传多样性水平较高,
说明种群遗传结构尚未遭到明显破坏。一般认为,平
均多态位点比率和平均杂合度是衡量生物群体遗传多
样性高低的参数[28]。影响遗传多样性差异的自然因素
主要来自地理的区域性,人为因素如过度捕捞、环境污
染以及人工放流都有可能是造成当地的遗传多样性的
丢失。尽管本研究表明,中国沿海管角螺地理群体目
前尚保持了较高的遗传多样性,但环境污染和不合理
的捕捞方式都可导致遗传多样性的降低。
3.2管角螺5个地理群体的亲缘关系比较
同一物种的不同群体遗传距离的大小相应反映了
生物遗传多样性丰富程度的高低,而遗传多样性丰富
程度是适应各种生境的基础。管角螺5个群体相互间
的遗传距离在0.003 4~0.182 4之间,说明各群体已
出现一定程度的遗传分化。对群体内及各群体间的遗
传多样性进行分析,结果显示管角螺各群体间的分化
程度较弱,而群体内的遗传变异程度较高。这可能是
由于遗传漂变或是基因突变引起的,这种变化在群体
内部比较明显,而群体之间由于基因库较大,因而表现
不明显。
Wright[29]认为,Fst在0~0.05之间表示群体间遗
传分化微弱;0.05~0.15之间表示群体遗传分化中等;
0.15~0.25之间表示群体遗传分化较大;当Fst>0.25
时,表示遗传分化极大。从管角螺群体间的遗传分化
Fst值可以看出,ZJ与FCG群体的遗传分化最小,即亲
缘关系最近;而 WZ与TS群体的遗传分化最大,即亲
缘关系最远;而LYG与ZJ和FCG群体这一支则遗传
分化较小。根据其地域分布特点,出现这种结果作者
初步估计可能有以下几种原因:ZJ与FCG群体的地理
位置相近,生长环境相似,即有可能是由同一支分化而
来,后因地理位置的差异而出现较小的分化。TS与ZJ
群体虽同属广东省,但其分化极大,究其原因,一则可
能是二者由不同种源进化而来,但其地理位置相近,而
且又没有难以跨越的地理隔离,因而此种可能性极小;
06
4期 潘 英,等:管角螺遗传多样性的AFLP分析
另一缘由可能是其靠近珠江三角洲,生活环境中混入
大量淡水,盐度相对较低,在长期的自然选择中出现较
大的遗传分化。
3.3AFLP分析结果与壳形态参数变异、RAPD分析结
果的比较
本文AFLP分子标记分析结果与罗福广等[23]的
壳形态性状分析结果总体上是一致的,但也存在一定
差异。林志华等[30]认为DNA水平的差异主要是由地
理距离造成的遗传分化而引起,而形态差异除决定于
遗传差异,还受到环境因子的影响。国外对不同种群
的形态变异研究表明[31-32],不同物种种群间形态变异
的主要特征并不完全一致,被认为是由于贝类对长期
生活环境适应的结果,环境因子中的水温、底质以及摄
食饵料的种类是决定变异的重要因子。Levinton
等[33]也认为,不同地区的生境差异(温度、盐度和洋流
等)是产生和保持地理群体间遗传结构差异的重要因
素。目前我国管角螺主要分布于我国南方诸省沿海,
其北界为江苏,南至海南省,地理跨度较大,不同海区
气候和底质等生态环境因子差异也较明显,而这些生
态因子是管角螺生长的重要决定因素。管角螺是海洋
底栖肉食性贝类,它只在一定海区受饵料的影响做短
距离的移动,活动范围有限。这与管角螺运动能力差,
底栖生活密切相关。由于不同海区的气候、温度、盐度
等理化因素和饵料、生境存在一定的差异,因而地理因
素造成了一个群体与同种的另一群体存在某种程度的
地理分隔,从而在形态、生理甚至遗传上形成一定的差
异。从气候及底质上看,防城港、湛江属热带海域,泥
沙底质,生态环境及摄食习惯大都相同。而温州属于
亚热带海域,软泥底质;连云港属于暖温带海域,沙质
底。不同的地理条件及生态环境是造成管角螺群体间
遗传差异较大的原因,因此导致管角螺遗传变异的主
要原因是对长期生活环境适应的结果。在长期的进化
中逐渐形成了遗传信息的地理隔离,导致群体间出现
了一定程度的遗传分化。因此,作者猜测,LYG群体
究其根源可能是来自于ZJ与FCG一支,然后由于地
理位置的隔离,分化较ZJ与FCG群体大一些。另外,
也有可能是因为LYG与ZJ及FCG群体的生活环境
类似,因而其分化较小。这也说明亲缘关系的远近与
地理位置并没有明显的相关性。
罗福广等[24]采用RAPD方法研究管角螺的Gst=
0.322 4,而本研究的结果Fst为0.066 0,遗传分化指数
较前者偏高,主要原因是应用了不同类型的分子标记
技术。本实验采用2对引物共检测到310个位点,其
中多态位点277个,故认为可以较好地反映群体的遗
传变化。
种内遗传多样性或变异愈丰富,物种对环境变化
的适应能力也愈强。只有在掌握物种多样性水平高低
及其群体的遗传结构的基础上,才能制定有效的保护
策略和措施。从本文研究结果来看,管角螺各地理群
体均具有较丰富的遗传多样性,群体间存在较弱的遗
传变异,这种遗传变异主要来自群体内个体间。研究
结果可以作为中国沿海管角螺遗传多样性和种群分化
的基础信息。管角螺群体的遗传多样性比较丰富,存
在着较高程度的遗传变异,种质资源处于良好状态,也
表明目前人工养殖和放流尚未对其种质资源造成不利
影响。
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AFLP Analysis Revealed Diferences in Genetic Diversity of Hemifusus tuba
PAN Ying1,MU Cui-Min2,LI Qi 2,SU Xiang-Ju1,OU Xiao-Ling1,
HE Jun-Feng1,WU Xue-Ping1,CHEN De-Jin1
(1.Colege of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning 530004,China;2.Colege of Fishery,Ocean
University of China,Qingdao 266003,China)
Abstract: Hemifusus tuba has been facing high catching pressure and the risk of stocks exhausting in re-
cent years.To determine its genetic variation and describe its population structure,individuals of 5natu-
ral populations of H.tubainhabiting Chinese coast including Lianyungang(LYG),Wenzhou(WZ),
Taishan(TS),Zhanjiang(ZJ)and Fangchenggang(FCG)were colected and analyzed with amplified
fragment length polymorphism(AFLP)technique at first time.Two primer pairs amplified 310loci of 150
individuals,of which,277loci were polymorphic,accounting for 89.35%.Five populations differentiated
slightly;the expected heterozygosity ranged from 0.3824to 0.4766,and most genetic variation existed
within populations.Fstvalue and inter-population genetic distance showed that the differentiation among
populations was not significant.UPGMA tree showed a close relationship between population ZJ and
FCG.Frequencies of dominant genes were similar among 5populations.It was concluded that the natural
populations of H.tuba had high intra-population genetic diversities and low inter-population differentia-
tion.Our findings wil certainly facilitate the stock management and conservation as wel as genetic im-
provement of H.tuba.
Key words: Hemifusus tuba;natural population;AFLP;genetic diversity
责任编辑 朱宝象
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