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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第3期
收稿日期 ： 2013-12-10
基金项目 ：国家自然科学基金项目（81171511）
作者简介 ：高睿迪，女，研究生，研究方向 ：皮肤性病学 ；E-mail ：854170648@qq.com
通讯作者 ：杨慧兰，教授，研究方向 ：病毒分子生物学 ；E-mail ：huilany88@hotmail.com
单纯疱疹病毒 2 型潜伏相关转录体 RL1 的表达及其抗
凋亡作用
高睿迪1  杨慧兰1  钟菲菲2  吕芳彪2
（1. 南方医科大学，广州 510515 ；2. 广州军区广州总医院皮肤科，广州 510010）
摘 要： 单纯疱疹病毒 2 型潜伏相关转录体（LAT）-RL1 对放线菌素 D 诱导的凋亡作用的研究。构建重组 pEGFP-RL1 质粒，
转染 Vero 细胞，RT-PCR 及荧光鉴定重组质粒的表达。放线菌素 D 诱导 Vero 细胞凋亡，通过 Hochest33342 荧光染色观察细胞形态变化，
流式细胞术检测细胞凋亡率，JC-1 荧光观察膜电位变化，Caspase 3 凋亡蛋白检测。RT-PCR 和荧光观察表明该真核表达载体能在
Vero 细胞中高表达。Hochest33342 染色转染了 pEGFP-RL1 的 Vero 细胞经放线菌素 D 凋亡诱导后，细胞形态正常。流式结果表明
转染重组质粒 pEGFP-RL1 且经诱导凋亡组与正常对照组凋亡率无差异，而显著低于诱导凋亡组和转染空质粒 pEGFP-C2 诱导凋亡
组。转染重组质粒 pEGPF-RL1 的细胞 JC-1 染色后，红色细胞的比例要远大于绿色细胞的比例，而转染空质粒 pEGFP-C2 被染成绿
色细胞的数量较多。Caspase-3 结果表明转染了空质粒 pEGFP-C2 的 Vero 细胞经诱导凋亡后，活性显著高于转染了 pEGFP-RL1 经
放线菌素 D 诱导凋亡后的 Vero 细胞和正常 Vero 细胞。HSV-2 LAT RL1 具有抗放线菌素 D 诱导的 Vero 细胞的凋亡作用。
关键词 ： 单纯疱疹病毒 LAT RL1 放线菌素 D 凋亡 Vero 细胞
The Expression and Anti-apoptotic Function of Herpes Simplex Virus
Type 2 Latency Associated Transcript-RL1
Gao Ruidi1 Yang Huilan1 Zhong Feifei2 Lü Fangbiao2
（1. Southern Medical University，Guangzhou 510515 ；2. Genenral Hospital of Guangzhou Military command of PLA，Guangzhou 510010）
Abstract:  It was to study the expression of herpes simplex virus type 2 latency-associated transcript（LAT）RL1 and its anti-apoptosis
function induced by actinomycin D in vero cells. The recombinant plasmid pEGFP-ORF1 was constructed and transfected into Vero cells,
expression was determined by green fluorescent protein and RT-PCR .The changes of Vero cells morphology induced by Actinomycin D were
observed by Hochest33342 fluorescence staining, cells apoptosis rate was detected by flow cytometry . Membrane potential JC-1 fluorescence was
observed, and Caspase 3 detected of apoptosis protein activity. Results showed that the green fluorescent protein has a high expressed efficiency
in Vero cells, and target gene was detected by RT-PCR. Hochest33342 staining reavealed that Vero cells transfected with pEGFP-RL1 and
induced apoptosis by actinomycin D had no changes in morphology. Flow cytometry assay showed that the cells apoptosis rate were no significant
difference between pEGFP-RL1group and the normal group, but the cells apoptosis rate of pEGFP-RL1 was remarkable lower than the pEGFP-
C2 group. Transfected with the recombinant plasmid pEGPF-RL1 cells by JC-1 staining, the proportion is much larger than red cells green cells
transfected with empty vector pEGFP-C2. Caspase-3 results indicate that induction of apoptosis by transfected with empty vector pEGFP-C2 Vero
cells, and the activity was significantly higher than those transfected with pEGFP-RL1 by actinomycin D-induced apoptosis of Vero cells and
normal cells. HSV-2 LAT RL1 gene can effectively expressed in Vero cells and can protect Vero cells from apoptosis induced by actinomycin D.
Key words:  Herpes simplex virus LAT RL1 Actinomycin D Apoptosis Vero cells
单纯疱疹病毒是人类常见病毒性疾病的病原体，
根据血清型的不同可分为 HSV-1 和 HSV-2，HSV-1
主要引起口唇疱疹，HSV-2 主要引起生殖器疱疹［1］。
在体内易引起潜伏感染，当人体免疫力低下或者受
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期188
到某些不良刺激时病毒会被再次激活，引起复发感
染并出现相应的临床症状。目前对疱疹病毒潜伏感
染和再激活的机制还不是十分清楚，而潜伏相关转
录体（LAT）是疱疹病毒潜伏感染期间唯一大量表
达和可被检测到的病毒基因组转录产物，被认为在
病毒潜伏感染的建立、维持和再激活的过程中都起
着重要的作用［2，3］。目前有关 LAT 作用假说很多，
但具体是哪一种作用机制尚不明确。本实验室的前
期研究表明 ORF1 具有抗凋亡功能，ORF1 为初始
LAT 中的一个开放读码框，他主要通过编码蛋白来
起到作用，而 RL1 则是 LAT 中的另外一个片段，很
有可能是通过编码 microRNA 来起作用。LATS 能够
编码多个有功能的 miRNA，microRNA 能够通过与
靶 mRNA 特异性的碱基配对，引起靶 mRNA 的降解
或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达的调
控，miRNA 可能在潜伏感染中发挥重要作用。在病
毒潜伏期间 LAT 编码的 miRNA 对其靶基因进行干
扰作用，抑制细胞凋亡，使病毒长期潜伏［4］。本试
验通过构建表达质粒转染 Vero 细胞后，观察 HSV-2
LAT-RL1 编码 microRNA 对放线菌素 D 所致的细胞
凋亡的作用，为探讨 HSV-2 编码 miRNA 的潜伏复
发机制中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌（E.coli）Top10 菌株、Vero 细胞、质
粒 pEGFP-C2 由广州军区总医院医学实验科保存 ；
RPMI1640 细胞培养液，胎牛血清为美国 HyClone 公
司生产 ；病毒 DNA 提取试剂盒、由生工生物有限公
司提供，T4 DNA 连接酶由宝生物工程（大连）有限
公司生产 ；放线菌素 D 为美国 Sigma 公司生产 ；胰
酶，Giemsa，Hochest 33342 由广州威佳科技有限公
司提供 ；高保真 DNA 聚合酶 PLATINUM®PFX DNA
POLYMERASE、Trizol、无内毒素质粒中提试剂盒购
自 Invitrogen ；限制性内切酶 Hind III、Kpn I 产自美
国 NEB 公司 ；转染试剂盒 LipofectamineTMLTX 产自
Invitrogen 公司 ；caspase-3 活性检测试剂盒 ：购自贝
博生物有限公司，凯基细胞凋亡线立体膜电位检测
试剂盒 ：购自南京凯基因生物科技有限公司 ；逆转
录试剂盒购自美国 Invitrogen 公司 ；凋亡检测试剂盒
Guava Nexin® Reagent 100 Tests 由美国 Millipore 公司
生产。
1.2 方法
1.2.1 Vero 细胞培养 体积分数 10% 胎牛血清的
RPMI1640 培养基中贴壁生长，于 37℃、5% CO2 及
一定湿度的培养箱中培养，培养瓶铺满时用胰蛋白
酶消化传代，培养细胞至对数期。
1.2.2 HSV-2 333 株基因组提取及重组质粒 pEGFP-
RL1 的构建和鉴定 HSV-2 病毒感染 Vero 细胞，提
取其基因组，以提取的 HSV-2 病毒基因组为模板
PCR 扩增 RL1 片段，双酶切 pEGFP-C2 和 RL1 扩增
产物，T4 DNA 连接酶连接，转化 E.coli TOP10，卡
纳抗性筛选阳性克隆，用 Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ限制性内
切酶对重组质粒进行双酶切电泳鉴定和测序鉴定，
用无内毒素质粒中提剂盒提取质粒 pEGFP-RL1。
1.2.3 重 组 质 粒 pEGFP-RL1 转 染 Vero 细 胞 消
化 Vero 细 胞， 分 别 以 1.0×104 cells/ 孔 和 4.0×104
cells/ 孔密度接种于 96 孔与 6 孔细胞培养板，常规
条件下培养，待细胞长至 80% 的融合度时进行转染
试验，详细转染步骤见 LipofectamineTMLTX 转染试剂
盒。在荧光显微镜下观查绿色荧光蛋白的表达情况
及转染效率。
1.2.4 RT-PCR 检 测 LAT RL1 的 表 达 将 转 染 后
细胞荧光显微镜下观察 Vero 细胞中绿色荧光蛋白
的表达情况，并收获细胞提取总 RNA。逆转录合
成 cDNA， 以 此 为 模 板，PCR 扩 增 RL1 及 β-actin。
扩增 RL1/β-actin 基因的条件 ：94℃预变性 7 min ；
94℃变性 30 s，55℃退火 20 s，72℃延伸 2 min，共
35 个循环 ；72℃再延伸 5 min 后冷却至 4℃。PCR
产物经 1% 琼脂糖电泳鉴定。
1.2.5 放线菌素 D 诱导 Vero 细胞凋亡 转染了质粒
的细胞培养 24 h 后，加入终浓度为 1 μg/mL 的放线
菌素 D，常规培养 36 h，用于后续试验。
试验分 3 组 ：（1）未作任何处理的 Vero 细胞
（正常对照组）；（2）转染了空质粒 pEGFP-C2、经放
线菌素 D 诱导凋亡的 Vero 细胞（空白载体组）；（3）
转染了重组质粒 pEGFP-RL1、经放线菌素 D 诱导凋
亡的 Vero 细胞（重组质粒组）。
1.2.6 Vero 细胞凋亡情况的 Hoechst33342 荧光染色
2014年第3期 189高睿迪等 ：单纯疱疹病毒 2 型潜伏相关转录体 RL1 的表达及其抗凋亡作用
观察 将各组中 Vero 细胞以 5 ×104 个 /mL 接种于细
胞爬片上，贴壁后用 ActD（1 mg/L）处理 36 h，PBS
洗 3 次，加入固定液固定 10 min，PBS 洗 2 次，每
次 3 min ；加入 0.5 mL 的 Hoechst33342 染色液 37℃，
培养 20-30 min，弃染色液，加一滴抗荧光淬灭封片
液，在荧光显微镜下观察并拍照。
1.2.7 流 式 细 胞 术 检 测 细 胞 凋 亡 弃 去 培 养 液，
胰 酶 消 化 收 集 各 组 细 胞， 用 300 mL 10%NBS 的
PRMI1640 培养液重悬细胞，各组中取 100 μL 细胞
悬液，加入 Annexin-V-PE/7-AAD 室温下避光孵育 20
min 后，上流式细胞仪进行分析。
1.2.8 JC-1 细胞凋亡线粒体膜电位检测 将 Vero 细
胞以 5 ×104 个 /mL 接种于细胞爬片上，贴壁后分别
用用 ActD（1 mg/L）处理 36 h 用 PBS 洗涤细胞两次；
配制 JC-1 工作液 ；滴加 100 μL JC-1 工作液，加盖
玻片，37℃，5%CO2 的培养箱中孵育 15-20 min；1×
染色结合液洗涤 1-2 遍 ；将盖玻片倒置于载玻片上，
于荧光显微镜下观察。
1.2.9 Caspase 3 凋亡蛋白检测 收集（2-5）×106
个细胞，在 4℃，500 g 条件下离心 2-3 min，小心
吸去培养基，尽可能吸干，收集细胞，用冷的 PBS
洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清，在
细胞中加入 100 μL 冷的裂解缓冲液，高速涡旋震
荡 15 s，置冰上 15 min，每隔 5 min 高速涡旋震荡
15 s，在 4℃，500 g 条件下离心 5 min，快速将上清
吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或 -80℃冰箱
保存备用，对上述处理过的上清进行蛋白定量，A
取 10 μL 大约含 20-50 μg 蛋白的裂解上清，加入 90
μL 检测缓冲液 B 再加入 10 μL Ac-DEVD-pNA，在
37℃下避光反应 1-2 h，有黄色产生即可进行检测，
如果颜色变化不明显，时间可以延长，甚至孵育过
夜 C 测定 A405 nm 或 A400 nm D。根据凋亡诱导的细胞的
吸光值与空白对照细胞的吸光值的比值计算相对的
Caspase 3 活性程度。
2 结果
2.1 RL1片段的PCR扩增及重组质粒pEGFP-RL1的
鉴定
PCR 扩增出的目的条带与预期大小相符合（约
1 400 bp）（图 1），重组质粒 pEGFP-RL1 双酶切后，
获得大小 4.7 kb 和 1 400 bp 左右的 2 个片段（图 2）。
A ：转染 pEGFP-RL1 重组质粒 24 h 后 Vero 细胞中荧光表达情况（200×）；
B ：转染 pEGFP-C2 空质粒 24 h 后 Vero 细胞中荧光表达情况（200×）
图 3 质粒表达的绿色荧光在 Vero 细胞中的分布特点
3000
bp
M 1 2
1500
1000
500
M ：500-12000 wide range marker ；1 ：RL1 扩增产物 ；2 ：阴性对照
图 1 目的片段 LAT RL1 的 PCR 产物
3000
bp
M1
1500
1000
500
M:500-12000 wide range marker ：1. Kpn I 和 Hind III 酶切 pEGFP-RL1
图 2 重组质粒 pEGFP-C2/LAT RL1 的酶切
2.2 重组质粒转染Vero细胞及荧光分布特点
转染 24 h 后在荧光倒置显微镜下观察绿色荧
光蛋白的分布情况，显微镜下可见表达的绿色荧光
（图 3）。
A B
2.3 RT-PCR检测重组质粒在Vero细胞中的表达
空载体 pEGFP-C2 组和重组质粒 EGFP-RL1 组
的 Vero 细胞均可扩出 452 bp 的β-肌动蛋白内参条带，
仅转染重组质粒的 Vero 细胞可扩增出约 1 400 bp 左
右的目的条带（图 4），说明 RL1 在 Vero 细胞中成
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期190
功转录，重组质粒转染 Vero 细胞后，可通过倒置荧
光显微，说明 RL1 在 Vero 细胞中成功表达。
A ：正常细胞（4.41%±0.09%）；B ：转染重组质粒 pEGFP-RF1 诱导凋亡
的 细 胞（5.92%±1.07%）；C ：转 染 了 空 质 粒 pEGFP-C2 诱 导 凋 亡 的 细 胞
（29.62%±2.19%）
图 6 流式细胞术分析细胞凋亡情况
A ：未转染质粒的正常对照 Vero 细胞 ；B ：转染 pEGFP-RL 经 ActD 诱导凋
亡的 Vero 细胞 ；C ：转染 pEGFP-C2 经 ActD 诱导凋亡的 Vero 细胞（200×）
图 5 Hochest 33342 荧光染色
2000
bp
M 1 2 3 4 M
1000
750
500
250
100
2000
bp
1000
750
500
250
100
M ：100 bpDNALadderMarker ；1 ：转 染 pEGFP2-C2 的 Vero 细 胞
组无目的片段 ；2 ：转染 pEGFP2-C2 的 Vero 细胞组的 β-actin 内
参条带；3：转染 pEGFP-C2/LAT-RL1 的 Vero 细胞组的 RL1 片段；
4 ：转染 pEGFP-C2/LAT-RL1 的 Vero 细胞组 β-actin 内参条带
图 4 RT-PCR 鉴定 LAT RL1 基因在 Vero 细胞中的表达
2.4 Hochest 33342染色观察细胞凋亡
在转染 pEGFP-C2 空载体组中可以很明显地看
到凋亡小体和致密浓染的颗粒块状荧光（图 5-C）；
正常对照组（图 5-A）及转染 pEFGP-RL1 重组载体
组（图 5-B）荧光较淡，无凋亡小体和致密的浓染
现象。
A B C
2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡
在 研 究 RL1 抗 Vero 凋 亡 作 用 时， 凋 亡 细 胞
占细胞总数正常对照组为（3.41±0.09）%，重组
质 粒 pEGFP-RL1 组 为（4.23±0.13）%， 空 载 体 组
为（28.21±0.25）%。 经 统 计 学 分 析， 重 组 质 粒
组细胞凋亡率与正常对照组比较差异无统计学意
义（P>0.05），显著低于空载体组（P<0.01，图 6）。
HSV-2 LAT RL1 在 Vero 细胞中具有抗放线菌素 D 诱
导的凋亡作用。
10+0
10+0 10+1 10+2
10+2
3.41%±0.09%
10+3 10+4
10+1
10+2
10+3
10+4
Apepaore
A
pe
pa
or
e
A
10+0
10+0 10+1 10+2
10+2
4.23%±0.13%
10+3 10+4
10+1
10+2
10+3
10+4
Apepaore
A
pe
pa
or
e
B
10+0
10+0 10+1 10+2
10+2
28.21%±0.25%
10+3 10+4
10+1
10+2
10+3
10+4
ApepaoreC
A
pe
pa
or
e
2014年第3期 191高睿迪等 ：单纯疱疹病毒 2 型潜伏相关转录体 RL1 的表达及其抗凋亡作用
2.6 JC-1荧光染色观察细胞凋亡
JC-1 荧光染色出现绿色荧光说明线粒体膜电位
下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现
红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态
也比较正常。图 7 中可以很明显地看出转染重组质
粒 pEGPF-RL1 的细胞 JC-1 染色后，红色细胞的比
例要远大于绿色细胞的比例，而转染空质粒 pEGFP-
C2 被染成绿色细胞的数量较多，由此可间接说明，
转染的重组质粒具有抗放线菌素 D 诱导的 Vero 细胞
的凋亡作用。
对病毒的抵抗力和耐受力有关。凋亡是宿主细胞抵
抗病毒感染、抑制病毒扩散的重要机制。
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，生物体内内环
境的稳定不但依赖于细胞的增殖和分化，也依赖于
细胞凋亡，它是生物界重要的生命现象之一［8，9］。
研究证明 HSV-1 及 HSV-2 LAT 均具有抗凋亡的作用，
通过阻止宿主细胞凋亡，抑制病毒释放，使得病毒
能够在神经节中维持潜伏感染状态［10-11］。
本研究将 HSV-2 LAT RL1 重组到真核表达载
体 pEGFP-C2 上， 并 转 染 进 Vero 细 胞， 通 过 RT-
PCR 鉴定了其能高效表达。用的放线菌素 D 诱导细
胞凋亡，Hochest33342 荧光染色观察细胞的形态结
构，发现重组质粒转染 Vero 细胞的形态结构与正常
Vero 细胞无明显变化，而空质粒组细胞出现明显的
凋亡现象 ；JC-1 荧光染色显示，重组质粒组显示红
绿荧光的相对比例与正常细胞组类似，而明显高于
空质粒组 ；流式细胞仪分析表明，转染了重组质粒
pEGFP-RL1 经放线菌素 D 诱导的细胞凋亡率与正常
细胞的细胞凋亡率之间无显著差异，显著低于转染
空载体并经放线菌素 D- 诱导组，Caspase-3 活性显
著高于转染了 pEGFP-RL1 经放线菌素 D 诱导凋亡后
的 Vero 细胞和正常 Vero 细胞，而正常 Vero 细胞中
Caspase-3 的活性值与转染了重组质粒凋亡诱导后的
细胞中的 Caspase-3 的活性值无显著性差，由此，试
验结果初步证明，HSV-2 LAT RL1 具有抗放线菌素
D 诱导凋亡的作用，为进一步研究 HSV-2 LAT 编码
microRNA 奠定了良好的基础，也为后续深层次研究
HSV-2 潜伏建立和复发激活的信号通路等方面提供
A ：转染 pEGFP-RL1 经 ActD 诱导凋亡的 Vero 细胞 ；B ：转染 pEGFP-C2 经
ActD 诱导凋亡的 Vero 细胞 ；C ：未转染质粒的正常对照 Vero 细胞
图 8 Caspase-3 活性（Vero cells）
A B C
A ：未转染质粒的正常对照 Vero 细胞 ；B ：转染 pEGFP-RL1 经 ActD 诱导凋
亡的 Vero 细胞 ；C ：转染 pEGFP-C2 经 ActD 诱导凋亡的 Vero 细胞（200×）
图 7 JC-1 荧光染色 Vero 细胞
2.7 Caspase3 活性检测
Caspase3 家族在介导细胞凋亡的过程中为关键
的执行分子，它在凋亡信号转导的许多途径中发挥
功能，在细胞凋亡的晚期和死亡细胞中，Caspase3
的活性明显下降。在 Vero 细胞中，转染了空质粒
pEGFP-C2 的 Vero 细胞经放线菌素 D 诱导凋亡后，
Caspase-3 活性显著高于转染了 pEGFP-ORF1 经放线
菌素 D 诱导凋亡后的 Vero 细胞（P<0.05）和正常
Vero 细胞（P<0.05），而正常 Vero 细胞中 Caspase-3
的活性值与转染了重组质粒凋亡诱导后的细胞中
的 Caspase-3 的活性值无显著性差异（P>0.05）（图
8）。 说 明 HSV-2 LAT RL1 没 有 激 活 或 少 量 激 活
Caspase-3，它能抑制诱导的 ActD 诱导的细胞凋亡。
caspase-3 的试验结果可以间接说明 HSV-2 LAT RL1
具有抗凋亡的作用。
3 讨论
单纯疱疹病毒普遍易感，人是其唯一的自然宿
主有嗜神经性，有大量的研究表明 HSV-2 感染可
显著增加人类免疫缺陷病毒（HIV）感染机率［5-7］。
HSV 造成宿主系统感染乃至损伤是一个病毒与宿主
相互作用的过程，这既与病毒特性有关，亦与宿主
A B C
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
ca
sp
as
e-
3
ac
tiv
ity
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期192
了试验基础。
4 结论
本试验将重组质粒 pEGFP-RL1 转染到 Vero 细
胞，放线菌素 D 诱导细胞凋亡，通过 Hochest33342
荧光染色，JC-1 荧光染色，MTT 法检测，流式细胞
仪分析，Caspase-3 活性检测，证明 HSV-2 潜伏相关
转录子 RL1 具有抗凋亡作用。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）