全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第3期
纤维素是自然界中最丰富、最廉价的可再生有
机物质资源，据估计，其生成量每年高达 10×1010 t。
纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节，但由
于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍非常有限，
目前仅有 20％的纤维素物质被开发利用，大量的纤
维素物质因无法降解利用而被废弃［1］。
我国植物纤维素资源丰富，每年农作物秸秆总
产量为 6×108 t 左右［2］，林木枝桠和林业废弃物获
得量约 9×108 t［3］。然而，这些资源大部分被就地焚
烧掉［4］，仅少部分用作饲料、工业造纸原料或还田
利用，综合利用水平低且影响生态环境。如何有效
收稿日期 ：2013-10-22
基金项目 ：广西农业科学院科技发展基金项目（桂农科 2012JM10）
作者简介 ：廖青，女，助理研究员，研究方向 ：农田环境与生态 ；E-mail ：liaoqing81@163.com
通讯作者 ：李杨瑞，教授，博士生导师，研究方向 ：作物栽培与遗传育种 ；E-mail ：liyr@gxaas.net
发酵床中纤维素降解菌的分离与鉴定
廖青1  江泽普1  邢颖1  韦广泼1  黄东亮2，3  李杨瑞3
（1. 广西农业科学院农业资源与环境研究所，南宁 530007 ；2. 广西农业科学院甘蔗研究所，南宁 530007 ；3. 广西甘蔗遗传改良重点实验室，
南宁 530007）
摘 要 ： 从发酵床垫料中初步分离出 43 株纤维素降解菌。采用刚果红鉴别培养基及滤纸条培养基初筛，得到 5 株透明圈较
大且使滤纸条产生崩解的菌株，通过进一步液体发酵，测定其 CMC 酶活、FPA 酶活和天然纤维素酶活，获得 2 株具有较高纤维素
降解活性菌株，并分别命名为 F7 和 F21。经 16S rRNA 基因序列分子生物学鉴定和系统发育分析表明，这 2 株纤维素降解菌分别
归属为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和链霉菌（Streptomyces sp.）。
关键词 ： 发酵床 纤维素降解菌 筛选 16S rDNA 鉴定
Isolation and Identification of Cellulose-Decomposing Microorganisms
in Deep-litter System
Liao Qing1 Jiang Zhepu1 Xingying1 Wei Guangpo1 Huang Dongliang2，3 Li Yangrui3
（1. Agricultural Resources and Environment Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007 ；2. Sugarcane
Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007 ；3. Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic
Improvement，Nanning 530007）
Abstract:  43 cellulose-decomposing microorganisms were isolated from deep-litter systems. Five of them, with bigger transparent circles
and disintegration effect of filter paper piece were screened using Congo red differential medium and filter paper method. Then 2 strains with
higher capacity of decomposing cellulose were obtained by determinations of CMC enzyme activity, FPA enzyme activity and natural cellulase
activity, and named as F5 and F21, respectively. The 2 strains were identifined as Bacillus subtilis and Streptomyces sp. basing on 16S rDNA
phylogenetic analysis.
Key words:  Deep-litter system Cellulose-decomposing microorganisms Screening 16S rDNA Identification
利用丰富的纤维素资源，开拓纤维素在新技术、新
材料和新能源领域中的应用，成为世界各国科研人
员研究的热点。
纤维素的降解主要有理化降解法和微生物降解
法。理化降解法因生产成本高且对环境造成巨大污
染而较少应用，而利用微生物产生的纤维素酶来分
解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径，对解决
环境污染、食品短缺、能源危机和人类社会的可持
续发展具有重大的现实意义。分离和筛选活力高、
降解周期短的纤维素降解菌，是开发利用纤维素资
源的前提和关键。
2014年第3期 107廖青等 ：发酵床中纤维素降解菌的分离与鉴定
本研究选择 3 年期发酵床垫料作为菌源，一方
面是由于发酵床垫料中含有大量锯末、农作物秸秆、
树枝等纤维素物质，为纤维素降解菌生长提供了适
宜的环境 ；另一方面，这些纤维素降解菌经过多年
自然驯化，其降解性能相对稳定、高效。因此，从
发酵床垫料中分离和筛选具有较高酶活力的纤维素
降解菌具有更高的生产意义，将为纤维素降解和资
源化利用提供菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 F7 和 F21 均分离自广西助农畜牧科技
有限公司 3 年期非接触式鸭发酵床垫料。
1.1.2 主要试剂 试验所用纤维素粉购自 Sigma 公
司， 水 解 酪 素 购 自 Fluka 公 司， 滤 纸 为 Whatman
NO.1 滤纸，其他化学药品均为国内生产的分析纯产
品。
1.1.3 培 养 基 富 集 培 养 基 ：纤 维 素 粉 5 g，
NaNO3 1 g，Na2HPO4·7H2O 0.5 g，KH2PO4 0.9 g，
MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，酵母膏 0.5 g，水解
酪素 0.5 g，H2O 1 000 mL，自然 pH ；
鉴 别 培 养 基 ：CMC-Na 20 g，（NH4）2SO4 2 g，
MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO4 1 g，NaCl 0.5 g，刚果红
0.2 g，琼脂 20 g，H2O 1000 mL，pH 7.2 ；
滤 纸 条 培 养 基 ：KH2PO4 2 g，（NH4）2SO4 1.4
g，MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，FeSO4·7H2O 5
mg，MnSO4 1.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 1.7 mg，蒸
馏水 1 000 mL，pH 7.2。于直径为 1.5 cm、长 15 cm
试管中加入上述溶液 5 mL，加 1 条 Whatman 滤纸（6
cm×1 cm）垂直于试管中，加棉塞灭菌待用［5］；
液体发酵培养基：KH2PO4 2 g，（NH4）2SO4 1.4 g，
MgSO4·7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，FeSO4·7H2O 5 mg，
MnSO4 1.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 1.7 mg，蛋白胨 0.5
g，尿素 0.3 g，碱处理后的秸秆粉 10 g［6］，蒸馏水
1 000 mL，pH 7.2-7.4。秸秆粉的制备方法是 ：将
秸秆剪成 2-3 cm 小段，烘干后粉碎至 60 目，加入
质量浓度为 2% 的 NaOH 至固液重量比为 1∶4，在
85℃水浴处理 1 h，水洗至 pH 为中性，烘干后备用；
细菌、放线菌分离培养基 ：营养琼脂、高氏合
成 I 号培养基（成品）均购自广东环凯微生物科技
有限公司。
以上培养基均在 121℃灭菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 纤维素降解菌的筛选 取 10 g 样品加入 90
mL 已灭菌的富集培养基中，30℃、200 r/min 摇床培
养 4 d。采用梯度稀释法制备 10-2-10-6 的系列稀释液，
取 100 μL 分别涂布到鉴别培养基中，在 30℃下培养
5 d，筛选能产生明显透明圈的菌株。分别挑取这些
菌株于 5 mL 无菌水中制成菌悬液，点接到鉴别培养
基上，在 30℃下培养 7 d，测定水解圈直径与菌落
直径的比值（Hc）；同时分别移取 1 mL 菌悬液到滤
纸条培养基中，于室温放置 15 d，观察滤纸条的溃
烂情况，以“+”的多少表示滤纸崩溃程度，“+”越多，
说明该菌株酶活越强［6］。选取 Hc 值较大且滤纸条
溃烂显著的菌株进行纯化，接种到液体发酵培养基
中培养进行复筛，同时菌株用 40% 甘油于 -80℃保藏。
1.2.2 纤维素降解菌的酶活测定 羧甲基纤维素
（CMC）酶活、滤纸（FPA）酶活、天然纤维素酶活
测定方法及计算方法均参照房兴堂等［7］的方法进行，
并略有改动 ：液体发酵培养时间为 5 d，OD 值设为
540 nm，以不加酶液的试样煮沸 10 min 后作为待测
酶液的空白对照，测定 FPA 酶活时按国际方法规定
使用 Whatman No.1 滤纸。
将纤维素酶每分钟催化底物水解生成 1 μg 葡萄
糖定义为一个酶活单位，用 U/mL 表示。
1.2.3 纤维素降解菌的分子生物学鉴定 用柱式
细菌基因组 DNA 抽提试剂盒（上海生工）提取菌
株 的 基 因 组 DNA， 采 用 16S rRNA 基 因 通 用 引 物
7f（5-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3） 及 1540r（5-
AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3） 进 行 PCR 扩 增，
PCR 扩增产物用胶回收试剂盒（上海生工）进行回
收纯化，连接 pMD18-T 载体并转化，用质粒抽提试
剂盒（上海生工）提取质粒后，在 ABI3730 测序仪
上进行测序。将所得序列与 GenBank 数据库中序列
进行比对，用 MEGA5.0 软件构建系统进化树。
2 结果
2.1 产酶菌株的筛选
本试验采用刚果红鉴别培养基，利用梯度稀释
涂板（图 1），从发酵床垫料样品中分离到 43 株纤
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期108
维素降解菌，其中 Hc 值较大且滤纸条溃烂程度在
“+ +”以上的菌株有 5 株，相关性状如表 1 所示。
表 1 数据表明，F21 的 Hc 最早出现峰值，F7 次之，
F27、F31 和 F40 的 Hc 峰值出现在第 4d 后，F7 和
F21 的 Hc 值并不高，但其滤纸条崩解程度最为彻底，
而 F27、F31 和 F40 虽然 Hc 值较高，其滤纸条崩解
程度不及 F7 和 F21。
2.2 产酶菌株的酶活测定
经过液体发酵培养 5 d，对分离出来的 5 个菌株
的 CMC 酶活、FPA 酶活及天然纤维素酶活进行测定
（表 2）。
表 2 5 个菌株的 CMC 酶活、FPA 酶活和天然纤维素酶活
菌株
CMC 酶活
（U/mL）C
FPA 酶活
（U/mL）
天然纤维素酶活
（U/mL）
F7 95.2733 28.5533 819.2322
F21 72.5000 21.6833 1079.6615
F27 11.9733 4.5933 15.9981
F31 24.1567 8.0283 355.4340
F40 15.1700 7.5133 279.3535
其中，F7 菌株和 F21 菌株的各个酶活均明显高
于其他 3 株菌，因此选取 F7 和 F21 进行下一步的分
子生物学鉴定。
2.3 菌株16S rDNA分析
PCR 扩增出 F7 菌株和 F21 菌株的 16S rDNA（图
4），测序结果表明，F7 菌株和 F21 菌株的 16S rDNA
序列分别为 1 514 bp 和 1 489 bp。
1 2 3
1 ：10-4 ；2 ：10-5 ；3 ：10-6
图 1 梯度稀释平板分离纤维素降解菌
表 1 鉴别培养基和滤纸条培养基初筛菌株的性状
菌株
性状
Hc 滤纸崩解度
1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 15 d
F7 1.83 2.50 3.50 2.93 2.64 + + + +
F21 3.00 4.00 3.74 3.96 3.53 + + + +
F27 2.00 2.93 3.49 4.23 4.13 + + +
F31 2.00 3.18 3.24 3.35 4.22 + +
F40 2.00 3.25 3.50 3.83 4.25 + + +
“+”滤纸不断裂，滤纸有毛边 ；“+ +”滤纸断裂，振摇不成糊状 ；“++ +”
滤纸断裂，振摇成有碎片糊状，“++ ++”滤纸断裂，振摇成完全糊状
初筛时能产生明显透明圈的菌株以及各菌株悬
液降解滤纸条的情况，分别如图 2 和图 3 所示。
1
5
3 2
4
1 ：F7 ；2 ：F21 ；3 ：F27 ；4 ：F31 ；5 ：F40
图 2 分离出来的纤维素降解菌单菌落
1 2 3 4 5 6
1 ：CK ；2 ：F7 ；3 ：F21 ；4 ：F27 ；5 ：F31 ；6 ：F40
图 3 第 15 d 试管中滤纸条的崩解情况
M
1500
bp
1500
bp
F7 M F21
图 4 菌株 16s rDNA 扩增产物
2.4 菌株系统发育分析
序列比对表明，F7 菌株与 Bacillus subtilis 的 16S
2014年第3期 109廖青等 ：发酵床中纤维素降解菌的分离与鉴定
rDNA 序列同源性为 99%，表明 F7 菌株为 Bacillus
subtilis。F21 菌株与 Streptomyces sp. 的 16S rDRNA 序
列同源性为 99%，表明 F21 菌株为 Streptomyces sp.。
采用 MEGA 5.0 软件用 N-J 法构建 F7 菌株和 F21 菌
株的系统发育树（图 5，图 6）。
3 讨论
从自然界筛选纤维素降解菌是构建高效纤维素
分解技术的基础性工作。为了获得酶活较高的野生
纤维素降解菌，国内外科学工作者自 20 世纪 40-50
年代开始，对产纤维素酶微生物进行了大量的分离
Bacillus sp. MH-I6
Bacillus subtilis strain ZWQ-1
Bacillus subtilis strain A32
Bacillus subtilis strain BY-3
Bacillus subtilis strain K21
Bacillus sp. 3-10
Bacillus subtilis strain NB-01
Bacillus subtilis strain PAB1C4
Bacillus subtilis strain ZWQ-2
Bacillus subtilis strain GZD-23
F7
52
31
44
45
0.0002
Streptomyces sp. s8-203
F21
Streptomyces costaricanus strain NA10
Streptomyces misionensis strain S1-SC15
Streptomyces sp. 1A01651
Streptomyces sp. 216303
Streptomyces rajshahiensis strain RUPA-08PR
Streptomyces owasiensis strain NBRC 13832
Streptomyces sp. CA2
Streptomyces misionensis strain PESB 25
Streptomyces sp. ABRIINW 111
37
50
70
55
74
54
0.001
图 5 F7 菌株 16S rDNA 系统发育分析
图 6 F21 菌株 16S rDNA 系统发育分析
筛选工作，逐步建立起较为完善的分离筛选方法。
李宪臻等［8］采用纤维素琼脂平板对土样纤维素降解
菌进行分离，再用划线法进一步纯化，获得一株链
霉菌 Streptomyces sp.LX，该菌能够完全降解纤维素
且不产生还原糖 ；刘永生等［9］用刚果红染色法从
农场陈旧稻草堆、甘蔗渣堆中分离出一株具有降解
天然纤维素稻草粉、甘蔗渣粉活性的细菌 GXN151，
分析表明，该菌为地衣芽孢杆菌，这是国内外有关
能降解天然纤维素的地衣芽孢杆菌首次报道。刚果
红纤维素平板透明圈筛选法中 Hc 值大小可以大致
反映产酶的高低，然而研究发现，一些菌株也会出
现 Hc 值较高但酶活较低［10］或 Hc 值较低但酶活较
高的情况［5］，仅以水解圈大小作为菌株产纤维素酶
活力大小的唯一定量指标并不可靠［11］，因此，用滤
纸条崩解、液体发酵测定酶活进行复筛是必不可少
的。此外，大量的研究表明，纤维素分子被纤维素
酶降解以后会产生大量的终产物葡萄糖，这些葡萄
糖会阻遏酶的进一步合成，即降解物阻遏抑制现象，
被认为是天然菌株纤维素酶产量低的一个主要原因。
因此，除了传统的依据水解圈大小鉴别正向突变株
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期110
的方法外，还可以通过筛选抗阻遏突变株的方法来
获得高产纤维素酶菌株。管斌等［12］以 2-脱氧葡萄
糖作为终产物阻遏物的结构类似物进行抗性筛选，
选育得到 1 株抗终产物阻遏作用的突变株，其酶活
力比出发菌株提高了 3 倍。目前对 Bacillus subtilis 和
Streptomyces sp. 进行全面的 CMC 酶活、FPA 酶活及
天然纤维素酶活研究的文献相对较少，且大多侧重
于 CMC 酶活的测定，如朱军莉等［13］分离的枯草芽
孢杆菌 BSX5 CMC 酶活为 54.5 U/mL，任红梅等［14］
筛选的枯草芽孢杆菌 M7 CMC 酶活优化值也只有
4.335 12 U/mL， 而 本 研 究 中 F7 的 CMC 酶 活 达 到
95.273 3 U/mL，对比可知 F7 具有较高的纤维素降解
活性 ；F21 的 CMC 酶活与徐杰等［15］分离到的 C5，
CMC 酶活 41.37 U/mL 的链霉菌及李路军等［16］筛选
到的 LLJ-03，CMC 酶活 97.0 U/mL 的链霉菌的 CMC
酶活相比，处于较高水平。如果 F7 和 F21 通过优化
培养条件、诱变或基因工程手段，提高其纤维素降
解能力，则具有更广阔的工业应用前景。
应用 16S rDNA 序列分析法能从基因水平明确种
属分类，基因序列分析以核酸为基础，几乎不受外
界环境影响，不依赖人肉眼观察，无个体差异，比
传统菌落形态学观察更为准确，是一种行之有效的
鉴定方法。本研究中，菌株 F7 在刚果红鉴定培养基
平板表面呈现青灰色，可能是与刚果红平板形成反
差的缘故，如果通过表型鉴定，结果会出现较大偏
差，而通过 16S rDNA 序列及系统发育综合分析，F7
最终鉴定是 Bacillus subtilis。
4 结论
从发酵床垫料中分离出 2 株具有较高降解活性
的纤维素降解菌 F7 和 F21，对其进行分子生物学鉴
定，并最终将 F7 和 F21 鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus
subtilis）和链霉菌（Streptomyces sp.）。
参 考 文 献
［1］ 张喜宏 , 刘义波 , 张云航 . 纤维素酶及纤维素酶产生菌选育的
研究进展［J］. 饲料工业 , 2009, 30（22）：14-16.
［2］ 韩鲁佳 , 闫巧娟 , 刘向阳 . 中国农作物秸秆资源及其利用现
状［J］. 农业工程学报 , 2002, 18（3）：87-91.
［3］ 文少白 , 李勤奋 , 侯宪文 , 等 . 微生物降解纤维素的研究概
况［J］. 中国农学通报 , 2010, 26（1）：231-236.
［4］ 刘祥友 , 曾秀玲 , 赵熙贵 , 等 . 农作物秸秆饲料的营养特点与
微生物发酵秸秆类饲料的研究进展［J］. 贵州畜牧兽医 , 2010,
34（1）：11-14.
［5］ 冯健玲 , 姚晓华 , 韦秉兴 , 等 . 稻草秸秆纤维素分解菌的分离筛
选［J］. 基因组学与应用生物学 , 2009, 28（3）：477-480.
［6］ 李日强 , 辛小芸 . 天然纤维素分解菌的分离选育［J］. 上海环
境科学 , 2002, 21（1）：8-11.
［7］ 房兴堂 , 陈宏 , 赵雪锋 , 等 . 秸秆纤维素分解菌的酶活力测
定［J］. 生物技术通讯 , 2007, 18（4）：628-630.
［8］ 李宪臻 , 徐德贵 , 任钢弋 , 等 . 新分离菌 Streptomyces 产小分子
CMC 液化酶的研究［J］. 微生物学通报 , 1996, 23（5）：277-
281.
［9］ 刘永生 , 冯家勋 , 段承杰 , 等 . 能降解天然纤维素的地衣芽孢
杆菌 GXN151 的分离鉴定及其一个纤维素酶基因（cel5A）的
克隆和测序分析［J］. 广西农业生物科学 , 2003, 22（2）：132-
138.
［10］ 王淑军 , 杨从发 , 陈静 . 固态降解农作物秸秆纤维素菌株分离
筛选方法的研究［J］. 淮海工学院学报 , 1999, 3（1）：42-44.
［11］ 李平 , 王焰新 , 刘琨 , 等 . 高效纤维素降解菌系的构建［J］.
中国地质大学学报 , 2009, 34（3）：533-538.
［12］ 管斌 , 孙艳玲 , 谢来苏 , 等 . 抗分解代谢阻遏纤维素酶变异株
的选育［J］. 无锡轻工大学学报 , 2000, 19（3）：244-247.
［13］ 朱军莉 , 韩剑众 , 励建荣 . 纤维素分解菌 BSX5 的分离、鉴定
及产酶条件［J］. 食品与生物技术学报 , 2006, 25（3）：15-
18.
［14］ 任红梅 , 刘左军 , 袁慧君 , 等 . 低温纤维素降解菌的筛选及其
产酶研究［J］. 食品工业科技 , 2013（19）：127-130, 34
［15］ 徐杰 , 杨谦 . 一株高活力纤维素酶产生菌 -链霉菌 C-5 产酶研
究［J］. 太阳能学报 , 2009, 30（5）：682-685.
［16］ 李路军 , 游银伟 , 任鹏飞 , 等 . 一株具有纤维素降解能力的链
霉菌 LLJ-03 的鉴定及初步研究［J］. 西南农业学报 , 2010, 23
（4）：1253-1256.
（责任编辑 狄艳红）