全 文 ：基金项目:2011 年福建省重大科技项目
作者简介:黄杰(1989 －) ，男，福建莆田人，硕士研究生，研究方向:微生物分子生物学。* 通讯作者 收稿日期:2011 － 07 － 20
芒萁内生纤维素降解菌的筛选
黄 杰 林 生 林文雄*
(福建农林大学生命科学学院，福建福州 350002)
摘 要:纤维素作为地球上的可再生资源，在一定条件下可以水解成为糖类重新回到物质循环中。该实验从芒萁中
筛选出了近 20 株有纤维素降解能力的内生细菌，初步证明芒萁中存在相应的纤维素降解菌，为纤维素降解菌的获得
提供了新的思路。
关键词:纤维素降解菌;内生菌;筛选;芒萁
中图分类号 Q946. 5 文献标识码 A 文章编号 1007 － 7731(2011)15 － 69 － 02
Screening of Endophytic Cellulose Degrading Bacteria from Dicranopteris linearis
Huang Jie et al.
(School of Life Sciences，Fujian Agricultural and Forestry University，Fuzhou 350002，China)
Abstract:As a renewable resource on earth，cellulose can be hydrolyzed into sugars back to the material cycle under certain
conditions． This study isolated some strains of endophytic bacteria from the Dicranopteris linearis，and 20 strains were there-
after screened that were capable of utilizing cellulose． This proves that some corresponding cellulose degrading bacteria are
present in the D． linearis，and provides a new way to get cellulose degrading bacteria．
Key words:Cellulose degrading bacteria;Edophytic bacteria;Screening ;Dicranopteris linearis
纤维素作为地球上的可再生资源，在一定条件下可以
水解成为糖类重新回到物质循环中。因此通过对纤维素
的降解能够实现能源和资源的循环利用。目前研究较多
的纤维素原料是棉花、木材(包括针叶材和阔叶材)、禾草
类植物，而在我国分布广，资源丰富的菌草资源却没有得
到应有的重视［1］。菌草具有纤维素含量高，生产成本低，
减少森林资源的消耗等优点，因此寻找能够高效降解菌草
的微生物成为目前研究的重点。而内生菌的起源假说之
一即认为内生菌最初可能是通过对植物细胞纤维素的降
解，破坏植物细胞壁进而进入植物体内的［2 － 4］。因此为了
进一步证明该假说，同时增加纤维素降解菌的来源，本研
究以芒萁为原料筛选分离能够降解纤维素的内生菌，以期
为纤维素分解菌复合体系的构建及其相关研究提供依据。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 样品 样品采自福建农林大学后山野生芒萁、菌
草所生长的芒萁。
1. 1. 2 培养基配制 羧甲基纤维素钠培养基:CMC － Na
20 g，Na2HPO4 2. 5 g，KH2PO4 1. 5 g，蛋白胨 2. 5 g，酵母膏
0. 5 g，琼脂 20 g，水 1000 mL，pH 7. 0 ～ 7. 2。
羧甲基纤维素钠刚果红培养基:CMC － Na 1. 88 g，MgSO4
·7H2O 0. 25 g，KH2PO4 0. 5 g，刚果红 0. 2 g，琼脂 20 g，明
胶 2 g，水 1000 mL，pH 7. 0 ～ 7. 2。
发酵培养基:CMC － Na 10g，蛋白胨 5g，酵母膏 1g，蒸
馏水 1000mL。
1. 1. 3 试剂配制 2. 5%的 NaClO溶液;10%的 NaOH 溶
液。3，5 －二硝基水杨酸(DNS)显色试剂:准确称取分析
纯酒石酸钾钠 182 g，溶于 500 mL的热水(温度小于 50℃)
中，再称取 6. 3 g 分析纯 3，5 －二硝基水杨酸，21g 分析纯
NaOH，5 g结晶酚和 5 g无水亚硫酸钠依次加入其中，待全
部溶解，冷却后移入 1000mL 容量瓶，用蒸馏水定容至
1000mL，充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后
使用。
CMC － Na 缓冲液:取 1g 羧甲基纤维素钠(CMC －
Na) ，加水 100mL，在水浴上加热使其溶解，再加入磷酸二
氢钠 －柠檬酸缓冲液 20mL，蒸馏水 40 mL，混匀，4℃冰箱
中保存。
1. 2 芒萁内生菌的筛选 (1)预处理。将取来的样品洗
净，称取 3. 0g。用 70%的酒精浸泡 1min，迅速用无菌水漂
洗。洗净后用 2. 5%的 NaClO溶液浸泡 150s，迅速用无菌
水漂洗(漂洗后的无菌水留用，做空白涂布) ，研磨后加入
10mL无菌水，静置 15min即得稀释液［5］。
(2)菌株的初筛。采用平板划线法在牛肉膏蛋白胨
培养基上进行细菌的分离纯化，然后将分离得到的菌株接
96安徽农学通报，Anhui Agri. Sci. Bull. 2011，17(15)
DOI:10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2011.15.028
种到 CMC － Na培养基上进行培养，从中进行筛选。选取
在 CMC － Na平板上长势较好的菌株分离纯化，并接种于
刚果红平板上，观察水解圈，选取水解圈较大的菌株进行
CMC酶活力的初步测定，以进行进一步的筛选。
(3)菌株的复筛。测定 CMC酶活力，进行相关菌株酶
活力的比较［6］。
(4)芒萁根部菌株混合发酵初探。将经预处理后的
芒萁根部加入发酵培养基中进行振荡培养，由此进行芒萁
根部的初步混合发酵，测其酶活与单菌株酶活进行比较。
1. 3 酶活力测定
1. 3. 1 葡萄糖标准曲线的绘制 参照张丽青［7］等所报道
的方法，绘制葡萄糖标准曲线。
1. 3. 2 粗酶液的制备 将分离纯化后得到的单菌株接种
到发酵液中振荡培养。测定细菌酶活力时，在超净台取新鲜
发酵液 5 mL，12000 r /min下离心 10 min，上清液即为粗酶液。
1. 3. 3 CMC酶活力测定 参照张丽青［7］等所报道的方
法，进行 CMC 酶活力的测定。酶活的定义:在 pH7. 0，
50℃条件下，每分钟产生相当于 1 μmol 葡萄糖的还原糖
所需的酶量为 1个酶活力单位。
2 结果与分析
2. 1 纤维素降解菌的筛选
2. 1. 1 内生纤维素降解菌的初筛 经过预处理和菌株的
初筛复筛等一系列操作，得到 20 株有降解纤维素能力的
菌株。其中根部 16 株(命名为 MG － 01 ～ 16) ，茎部 4 株
(命名为 MJ － 01 ～ 04) ，叶子 0株。
将分离到的纤维素分解菌进行分离纯化，挑取纯化后
的单菌落至刚果红平板培养，比较不同菌落之间的水解圈
大小差异，得到 8株水解圈较为明显的菌株，如表 1所示。
表 1 细菌在刚果红平板上的水解圈大小比较
菌株
菌落直径
(cm)
水解圈直径
(cm)
水解圈直径 /
菌落直径
MG －01 0. 3 1. 5 5. 0
MG －03 0. 5 2. 3 4. 6
MG －06 0. 5 2. 0 4. 0
MG －07 0. 3 2. 0 6. 7
MG －08 0. 4 2. 1 5. 3
MG －11 0. 3 1. 2 4. 0
MG －15 0. 6 3. 4 5. 7
MJ － 03 0. 5 2. 9 5. 8
2. 1. 2 标准曲线的制作 根据纤维素酶活力的标准曲线
的制作方法，得出如图 1的标准曲线。
图 1 葡萄糖标准曲线
其中，葡萄糖溶液的浓度为 1mg /mL，葡萄糖量由公式
y = 0. 8435x － 0. 0595推出 x =(y + 0. 0595)/0. 8435。X 即
为葡萄糖量(mg)。
2. 1. 3 菌株复筛 将刚果红复筛所得到的 8 株菌株分别
接种于液体发酵培养基中，于 28℃ ，180r /min下培养并测
定 CMC酶活，得到表 2
表 2 不同培养时间菌株酶活测定(U)
时间(h)MG －01 MG － 03 MG － 04 MG － 06 MG － 07 MG － 11 MG － 15 MJ － 03
24 0． 73 0． 16 0． 24 0． 65 0． 52 0． 21 0． 58 1． 62
48 1． 44 0． 47 0． 76 1． 83 1． 67 0． 57 0． 43 1． 78
72 1． 93 0． 87 0． 52 2． 10 2． 43 0． 47 0． 99 1． 92
96 1． 51 1． 19 0． 49 1． 59 1． 98 0． 36 0． 32 2． 29
120 1． 06 0． 65 0． 51 1． 46 1． 02 0． 37 0． 45 1． 68
2. 2 降解纤维素复合菌与单一菌的酶活比较 鉴于单一
菌株的酶活普遍较低和所筛出的菌种多来自芒萁根部，故
将经预处理后的芒萁根部菌液不经分离培养直接加入发
酵培养基中进行振荡培养，由此进行芒萁根部纤维素降解
菌的混合培养，测其酶活与单菌株酶活，比较其纤维素降
解能力。
表 3 不同培养时间下混合菌系发酵与单菌落酶活比较(U)
时间(h) MG －07 混合菌
24 0. 52 5. 34
48 1. 67 2. 13
72 2. 43 1. 24
96 1. 98 0. 86
120 1. 02 0. 84
从表 3 可看出，内生纤维降解菌酶活较低，混合菌系
酶活较高，试验结果表明混合菌分解纤维素能力明显强于
单一菌株。该结果将为下一步的纤维素分解菌复合系的
构建及其相关研究提供依据。
3 结论与讨论
本实验选取农大后山的野生芒萁和菌草所培育的芒
萁作为实验原料，通过预处理等步骤筛选出了近 20 株有
纤维素降解能力的内生细菌，初步证明芒萁中存在相应的
纤维素降解菌，对增加纤维素降解菌的来源有一定的参考
意义。
自然界中实际对纤维素产生降解作用的菌往往是复
合菌系，即是由多菌株协同作用而对纤维素产生降解作用
的。本次实验发现，混合菌系的酶活未经优化就可达到
5. 34U，表明根部的菌株之间混合发酵能在相当程度上提
高酶的降解活性，降解效果远高于单一菌株。这可能是由
于混合菌系共生于芒萁根部，在长期的自然选择中形成了
一定的共生体系，在混合发酵时存在协同作用，因此有助
于酶活的提高。但在本次实验中从振荡培养的第 2d起酶
活就严重下降，实验结束时经测定，该混合发酵液的 pH
值由原先的 7. 0左右下降至 6. 2 左右，表明该混合菌系对
pH的条件要求较为严格，混合发酵的条件尚有待改进。
本次实验中还存在一些需要进一步研究的问题: (1)菌株
的筛选方法有待更新;(2)目前分 (下转 73页)
07 安徽农学通报，Anhui Agri. Sci. Bull. 2011，17(15)
－ RNAs)［12］。仅仅利用 Solexa测序来发现内源性 siRNAs
有着不足的一面，Ghildiyal 等［9］利用免疫沉淀的方法来
捕获和不同 ago蛋白结合的小 RNA，然后结合 Solexa等高
通量测序方法对捕获的小 RNA进行测序及及生物信息学
分析，这样不仅避免了只运用生物信息学分析非编码小
RNA不确定性的弊端，最重要的是通过实验验证，进一步
阐明了 miRNAs以及内源性 siRNAs 产生的机制，因此免
疫沉淀结合高通量测序无疑是目前研究内源性 siRNAs最
有效的方法。
目前对 miRNAs的研究，已经有较为成熟的实验方法
以及生物信息学分析流程。而内源性 siRNAs的研究刚刚
处于起始阶段，研究对象也仅仅局限于小鼠、果蝇等模式
生物，它在日本血吸虫体内的作用机制仍需要深入探索和
研究。目前我国血吸虫病防治形势依然严峻［13］，因此对
内源性 siRNAs的深入研究将为进一步揭示日本血吸虫生
长发育机制以及生物学特性奠定基础，为药物靶位点的预
测以及疫苗的研制提供强有力的支持。
参考文献
［1］李成，张滨丽，李杰 . RNAi技术的研究进展和发展前景［J］. 东
北农业大学学报 ，2005 (03) :365 － 368.
［2］王春梅，李庆章 . 小分子 microRNA及其生物学特征［J］. 东北
农业大学学报 ，2007 (04) :548 － 553.
［3］Kawamura Y，Saito K. Drosophila endogenous small RNAs bind to
Argonaute 2 in somatic cells［J］. Nature ，2008，453(7196) :793 －
797.
［4］Tam OH，Aravin A，Stein P，et al. Pseudogene － derived small in-
terfering RNAs regulate gene expression in mouse oocytes［J］. Na-
ture，2008，453(7194) :534 － 538.
［5］Li R，Li Y. SOAP:short oligonucleotide alignmen program［J］.
Bioinformatics，2008，24(5) :713 － 714.
［6］DeMarco R，Machado AA，Bisson － Filho A W，et al. Identification
of 18 new transcribed retrotransposons in Schistosoma mansoni［J］.
Biochemical and biophysical research communications，2005，333
(1) :230 － 240.
［7］Lander ES，Linton LM，Birren B，et al. Initial sequencing and anal-
ysis of the human genome ［J］. Nature，2001，409(6822) :860
－ 921.
［8］Waterston RH，Lindblad － Toh K，Rogers J ，et al. Initial sequen-
cing and comparative analysis of the mouse genome ［J］. Nature，
2002，420(6915) :520 － 562.
［9］Ghildiyal M，Seitz H，Li C，et al. Endogenous siRNAs derived from
transposons and mRNAs in Drosophila somatic cells［J］. Science ，
2008，320(5879) :1077 － 1081.
［10］Borsani O，Zhu J，Sunkar R，et al. Endogenous siRNAs derived
from a pair of natural cis － antisense transcripts regulate salt tolerance
in Arabidopsis［J］. Cell，2005，123(7) :1279 － 1291.
［11］Wang Z，Xue X，Sun J，et al. An in － depth description of the
small non － coding RNA population of Schistosoma japonicum schisto-
somulum［J］. PLoS neglected tropical diseases，2010，4(2) :596.
［12］Core LJ，Waterfall JJ，Lis JT. Nascent RNA Sequencing Reveals
Widespread Pausing and Divergent Initiation at Human Promoters［J］
. Science，2008，322:1845 – 1848.
［13］Wu ZD，Lu ZY，Yu XB. Development of a vaccine against Schisto-
soma japonicum in China:a review［J］. Acta tropica，2005，96(2 －
3) :106 － 116. (责编:施婷婷)
(上接 65 页)参考文献
［1］丁俊 . 麦田主要杂草的田间分布及取样调查方法［J］. 杂草学
报，1987，1(3) :3.
［2］马小华 . 麦田野燕麦空间分布型及抽样技术的研究［J］. 植物保
护，1988，14(1) :35.
［3］王向阳 . 麦田泽漆空间分布型及抽样技术研究［J］. 安徽农业科
学，1997，25(1) :361 － 362.
［4］丁岩钦 . 昆虫数学生态学［M］. 北京:科学出版社，1994:22
－ 55.
［5］张孝羲，程遐年，耿济国 . 害虫测报原理和方法［M］. 北京:农业
出版社，1979:172.
［6］唐启义，冯明光 . 实用统计分析及其计算机处理平台［M］. 北
京:中国农业出版社，1997:35 － 43.
［7］宋爱颖，杨玉珍 . 萧县麦田杂草种群演变初探［A］. 安徽省植物
保护学会 . 安徽省植物保护学会 . 2010 年学术年会论文集［C］.
2010:98 － 102. (责编:施婷婷)
(上接 70 页)离出的内生菌株并不稳定，菌株在许多条件
下容易退化。
参考文献
［1］胡寅，莫建初 . 国内外纤维素酶研究概况［J］. 学术研究，2005
(6) :18 － 23.
［2］McInmy JA，Kloepper JW［J］. Plant Soil，1995，173:337 － 342.
［3］Quadt － HallmannA，HallmannJ KloepperJW［J］． CanJ Microbiol，
1997，42:1144 － 1154．
［4］Cough C，Gahra C，Vasse J，et a1［J］． J Plant— Microbe Interact，
1997，10:560 － 570．
［5］李文华，李乐，吴云峰 . 择漆内生菌的分离及抗病毒活性筛选
［J］. 西北农业学报，2008，17(2) :285 － 288.
［6］张宇昊，王颉，张伟 . 一种改进的纤维素分解菌鉴别培养基［J］.
纤维素科学与技术，2004，12(1) :33 － 36.
［7］张丽清，吴海龙，姜红霞 . 纤维素降解细菌的筛选及其产酶条件
优化［J］. 环境科学与管理，2007，10:110 － 113.
(责编:施婷婷)
3717 卷 15 期 郝力力等 日本血吸虫内源性 siRNAs的研究