全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-09-21
基金项目 :“973”前期项目（2007CB116306）
作者简介 : 黄小龙 , 男 , 博士 , 研究方向 : 应用微生物资源 ;E-mail:hxl2012@163.com
通讯作者 : 洪葵 , 女 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 应用微生物资源 ;E-mail:k1022@163.net
热带药用植物根际放线菌的分离、鉴定及生物活性分析
黄小龙1,2 陈吉良2 李建平2 林海鹏1 庄令1 李佳3 洪葵1,4
（1中国热带农业科学院热带作物生物技术研究所 农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101 ；2海南大学农学院，儋州 571737 ；
3国家新药筛选中心，上海 201203 ；4武汉大学药学院，武汉 430071）
摘 要 : 从海南热带植物园采集 12 种药用植物的根际土样，采用选择性分离方法，分离得到 400 株根际放线菌。使用 5 种
活性筛选模型对分离菌株进行生物活性评价，154 株放线菌在一个或多个活性筛选模型中显示为阳性，菌株初筛阳性率达 38.5% ；
根据菌株形态特征并结合代谢产物的生物活性，从中挑选出 28 株菌进行 16S rRNA 基因序列分析，发现其分属于链霉菌属、诺卡
氏菌属、小单孢菌属和野野村菌属。
关键词 : 药用植物 根际 放线菌 生物活性
Isolation, Identification and Bioactivity of Rhizosphere
Actinobacteria from Tropical Medicinal Plants
Huang Xiaolong1,2 Chen Jiliang2 Li Jianping2 Lin Haipeng1 Zhuang Ling1 Li Jia3 Hong Kui1,4
（1Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology Ministry of Agriculture Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology，Chinese Academy
of Agricultural Sciences，Haikou 571101 ；2 Agronomy College，Hainan University，Danzhou 571737 ；3National Center for Drug Screening，
Shanghai 201203 ；4School of Pharmaceutical Sciences，Wuhan University, Wuhan 430071）
Abstract: A total of 400 strains belong to rhizosphere actinomycete were isolated from 12 rhizosphere soil samples of medicinal plant
collected from tropical botanical garden in Danzhou city of Hainan province with selective isolation methods. All of the isolates were assessed
using 5 models for their biological activities, and the fermentation broths from 154 strains exhibited activity on at least one screening model, the
positive rate among the isolates is 38.5%. 28 strains among them were selected according to their morphological characteristics and bioactivities
to determine their taxonomic position. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences indicated that the 28 strains belong to small
group of actinobacterial genera including Streptomyces, Micromonospora, Nocardia, and Nonomuraea spp..
Key words: Medicinal plant Rhizosphere Actinomycetes Bioactivity
放线菌是植物根际环境中一类重要的微生物，
在促进植物生长［1,2］、保护植物根系免受病原真菌的
侵袭等过程中发挥重要作用［3］。近年来，根际放线
菌作为生物活性物质筛选的新微生物资源引起了人
们的广泛关注［4-6］。有研究报道，从南洋楹［7］、桃树［8］、
棉花［9］和辣椒［10］等植物根际分离的放线菌对多种
植物病原真菌表现出强烈的拮抗活性。从药用植物
根际分离的放线菌不仅对植物病原真菌显示出强烈
的拮抗活性［11-13］，而且对人体的耐药性病原菌、肿
瘤等多种疾病模型表现出广泛的生物活性［14-16］。这
类研究充分证明植物根际放线菌不仅在生物防治上
表现出良好的应用潜力，在微生物新药筛选方面
也是一个重要的药源。海南岛药用植物资源十分丰
富，但对蕴藏在药用植物根际的放线菌资源却缺乏
系统的认识和研究。本研究从海南热带植物园采集
了 12 种药用植物的根际土样，对其根际的放线菌
进行分离、鉴定以及生物活性评价，旨在为海南药
用植物根际放线菌资源的前期开发提供资源和科学
依据。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期122
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土壤样品来源 于 2006 年 10 月在海南热带
植物园采集 12 种药用植物的根际土壤。具体方法为：
选取同一植株根基周围的 5 个点进行取样，每个点
采集 10-15 cm 深的根际土壤，5 点土壤混合均匀后
即为该种植物分离的土壤样品。植物种类包括见血
封喉（Antiaris toxicaria）、柬埔寨龙血树（Dracaena
cambodiana）、槟榔（Areca catechu）、 三叉苦（Evodia
lepta）、大叶山楝（Aphanamixis grandifolia）、黄花夹
竹桃（Thevetia peruviana）、海南粗榧（Cephalotaxus
hainanensis）、 美 登 木（Maytenus confertiflorus）、 海
南 马 钱 子（Strychnos hainanensis）、 海 南 大 枫 子
（Hydnocarpus hainanensis）、 盾 叶 鸡 蛋 花（Plumera
obtuse）、海芒果（Cerbera manghas）。
1.1.2 生物活性筛选靶标 肝癌 SMMC-7721 细胞，
购自武汉大学中国典型培养物保藏中心 ；金黄色葡
萄球菌 （Staphylococcus aureus ATCC 51650），白色念
珠菌（Candida albicans ATCC10231）购自海南省药
检所。Caspase-3 和蛋白酪氨酸磷酸酶 1B（protein
tyrosine phosphatase，PTP1B）由上海国家新药筛选
中心合成。
1.1.3 分离培养基 ATCC172 培养基 ：葡萄糖 1 g，
淀粉 2 g，酵母浸汁 0.5 g，CaCO3 1.5 g，N-Z-Amine 0.5
g，蒸馏水 100 mL，琼脂 2 g，pH7.2-7.4。
改良高氏（Gauses）2 号培养基 ：葡萄糖 1 g，
蛋白胨 0.5 g，胰胨 0.3 g，NaCl 0.5 g，复合维生素（维
生素 B1、核黄素、烟酸、维生素 B6、泛酸钙、肌醇、
p-氨基苯甲酸各 0.05 mg，生物素 0.025 mg），蒸馏水
100 mL，琼脂 2 g，pH7.2。
葡萄糖 - 天冬氨酸琼脂培养基 ：葡萄糖 0.2 g，
天 门 冬 酰 氨 0.1 g， 磷 酸 氢 二 钾 0.05 g，MgSO4·
7H2O 0.05 g，蒸馏水 100 mL，琼脂 2 g，pH7.2-7.4。
淀粉酪素琼脂培养基 ：可溶性淀粉 1 g，干酪
素 0.03 g，KNO3 0.2 g， NaCl 0.2 g，K2HPO4 0.2 g，
MgSO4·7H2O 0.005 g，CaCO3 0.002 g，FeSO4·7H2O
0.001 g，蒸馏水 100 mL，琼脂 2 g，pH7.2-7.4。
以上培养基均加入抑制剂 ：放线菌酮 50 mg/L、
制霉菌素和重铬酸钾各 50 mg/L、萘啶酮酸 20 mg/L。
1.1.4 发酵培养基（SLM） 可溶性淀粉 2 g，黄豆
粉 1.5 g，酵母粉 5 g，CaCO3 4 g，蛋白胨 2 g，NaCl 4 g，
蒸馏水 1 000 mL，pH7.2-7.4。
1.2 方法
1.2.1 放线菌的分离、保存及初步鉴定 采集每种
药用植物根际的土壤 , 在室温条件下风干 7 d。采用
下列 4 种方法预处理土壤 ：（1）120℃高温处理 1 h，
0.05% SDS+6% 酵母膏溶液 40℃震荡处理 20 min；（2）
1.0% 氯胺 -T 溶液，30℃处理 30 min ；（3）超声波
60℃处理 10 min ；（4）高速匀浆机匀浆处理 1 min ；
采用稀释涂布平板法进行分离，挑取明显分开的单
菌落，在 ISP2 平板上划线纯化后，挑取单菌落于
20% 的甘油中 -20℃保藏。根据菌落形态、显微镜
下菌丝及孢子特征进行初步鉴定。
1.2.2 生物活性测定 挑取放线单菌落接种于装有
20 mL SLM 培养基的 100 mL 三角瓶，放置在 28℃，
转速为 200 r/min 的摇床上，培养 7-10 d。按无菌操
作吸取 1 mL 发酵液，10 000 r/min 离心 10 min，取
上清液无菌过滤后做抗菌活性测定。向剩余的发酵
液中加入 60 mL 甲醇浸提 1-2 周，取 1 mL 甲醇浸
提液加入 96 孔板，60℃真空干燥后得粗提物，加
入 200 μL DMSO 溶解后做抗肿瘤活性、抗 PTP1B 以
及抗 Caspas-3 酶活性测定。按 Hong 等［16］的方法分
别测定菌株的抗金黄色葡萄球菌活性、抗白色念珠
菌活性、抗 PTP1B 及抗 Caspase-3 酶活性 ；按刘颖
等［17］的方法测定菌株抗 SMMC-7721 细胞毒活性。
活性评价标准 ：抑制金黄色葡萄球菌的效果相当于
硫酸卡那霉素 4 μg/mL 以上的计为有抗细菌活性 ；
抑制白色念珠菌的效果相当于氟康唑 4 μg/mL 以上
的，计为有抗真菌活性 ；抗肿瘤活性的效果相当于
丝裂霉素 C 5 μg/mL 以上的计为有抗肿瘤活性 ；菌
株发酵粗提物抑制 PTP1B 和 Caspase-3 酶活性的 IC50
在 20 μg/mL 以下的计为有抗 PTP1B 和 Caspase-3 酶
活性。
1.2.3 28 株代表性菌株 16S rRNA 基因 PCR 扩增及
系统发育分析 按 Hong 等［16］的方法提取放线菌
DNA 和 PCR 扩增 16S rRNA 基因，PCR 产物送上海
生工生物工程技术服务有限公司测序。16S rRNA 基
因测序后 , 利用 EzTaxon 在线比对服务（http://www.
2012年第2期 123黄小龙等 ：热带药用植物根际放线菌的分离、鉴定及生物活性分析
eztaxon.org/）进行相关有效种的相似性搜索 , 确定菌
株的属种 , 并选出相关模式菌株的 16S rRNA 基因序
列，用 Clustal X1.8 软件进行序列比对，用 Mega 4.0
软件构建系统发育树。
2 结果
2.1 药用植物根际土壤放线菌的分离与种群组成
从 12 种药用植物的根际土壤中共分离纯化获
得放线菌 400 株，每种药用植物根际土壤中都分
离到数目不等的放线菌 , 其中从柬埔寨龙血树植
物根际分离的菌株最多，为 115 株，占总分离数
的 28.75% ；其次是海南大枫子和盾叶鸡蛋花，分
别 为 43 株 和 39 株， 占 总 分 离 菌 株 的 10.75% 和
9.75% ；从其他植物根际分离的菌株相对较少。根
据菌落形态、气生菌丝的有无等特征，400 株放
线 菌 中 链 霉 菌 属（Streptomyces） 占 到 了 88% 以
上， 其 他 种 群 为 诺 卡 氏 菌 属（Nocardia）、 小 单
孢 菌 属（Micromonospora）， 以 及 少 量 野 野 村 菌 属
（Nonomuraea）的稀有放线菌。从每种植物根际获
得的放线菌中，链霉菌属均是分离频率最高的类群；
其他属的放线菌不具有广泛分布的特点，其分布有
一定的宿主特异性，而野野村氏菌属仅在盾叶鸡蛋
花植物根际分离得到（表 1）。
植物品种 链霉菌（Streptomyces） 小单孢菌（Micromonospora） 诺卡氏菌（Nocardia） 野野村菌（Nonomurea）
见血封喉 33 1 1
柬埔寨龙血树 110 2 3
槟榔 13 3
三叉苦 14 3 3
大叶山楝 25 1 2
黄花夹竹桃 19 1
海南粗榧 11
美登木 23 1 3
海南马钱子 22 1 8
海南大枫子 41 2
盾叶鸡蛋花 31 3 1 4
海芒果 13 1 1
总计（比例） 355（88.75%） 15（3.75%） 26（6.5%） 4（1%）
表 1 药用植物根际土壤样品中分离到的各类放线菌的菌株数
2.2 放线菌发酵产物的生物活性评价
采用 5 种筛选模型，分别为抗白色念珠菌、抗
金黄色葡萄球菌、抗肿瘤、抗 PTP1B 和抗 Capase-3
活性，对分离的 400 株放线菌进行了生物活性评
价。结果（表 2）显示，菌株发酵产物初筛阳性率
达 38.5%，其中 119 株菌的产物具抗白色念珠菌活
性，占总菌数的 29.75% ；84 株菌的产物具有抗金
黄色葡萄球菌活性，占总菌数的 21% ；12 株菌的产
物具有抗肝癌 SMMC-7721 细胞毒活性，占总菌数的
3% ；11 株菌的产物具有抗 PTP1B 活性，占总菌数
的 2.75% ；7 株菌的产物抗 Capase-3 活性菌株，占
总菌数的 1.75%。由表 2 可以看出，从每种药用植
物根际土壤分离的菌株中，都筛选到具有抗菌活性
的放线菌菌株。从柬埔寨龙血树根际土壤获得抗菌
活性的放线菌数量明显高于其他植物，其中抗白色
念珠菌活性菌株 55 株，抗金黄色葡萄球菌活性菌株
37 株，分别占总抗菌活性菌株的 46.2% 和 44.05%。
此外，62 菌株（占总活性菌数 40.52%）在一个以上
的筛选模型上表现出生物活性 ；分离自柬埔寨龙血
树、海南大枫子、盾叶鸡蛋花根际土壤的放线菌在
5 种筛选模型上都表现出活性。
2.3 代表性菌株16S rRNA基因序列系统发育分析
根据形态特征和生物活性综合分析，选取其
中 28 株代表菌株进行 16S rRNA 基因序列测定。将
所得序列在 EzTaxon 数据库中进行有效种的序列相
似性分析。结果（表 3）显示，28 株代表菌株分别
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期124
植物品种 总菌数 抗金黄色葡萄球菌 抗白色念珠菌 抗肿瘤 抑制 PTP1B 抑制 Caspase-3 活性菌株总计（比例）
见血封喉 35 7 4 0 0 1 8（22.86%）
柬埔寨龙血树 115 37 55 4 2 1 66（57.39%）
槟榔 16 3 5 0 1 0 8（50.00%）
三叉苦 20 1 7 0 1 0 8（40.00%）
大叶山楝 28 8 10 0 1 1 14（50.00%）
黄花夹竹桃 20 1 3 0 0 0 3（15.00%）
海南粗榧 11 6 6 2 0 1 6（54.55%）
美登木 27 3 5 0 1 0 7（25.93%）
海南马钱子 31 2 4 1 3 0 9（20.03%）
海南大枫子 43 5 13 3 1 1 18（41.86%）
盾叶鸡蛋花 39 8 4 2 1 2 10（25.64%）
海芒果 15 3 3 0 0 0 5（33.33%）
总计（比例） 400 84（21%） 119（29.75%） 12（3%） 11（2.75%） 7（1.75%） 154（38.5%）
表 2 药用植物根际土壤放线菌生物活性
表 3 28 株代表性放线菌菌株序列分析结果
编号 植物品种 最相似典型菌株（登录号） 相似性（%） 生物活性
102103 柬埔寨龙血树 Micromonospora aurantiaca DSM 43813T（X92604） 99.497 C
31108 盾叶鸡蛋花 Micromonospora chaiyaphumensis MC5-1T（AB196710） 99.420 None
31106 盾叶鸡蛋花 Micromonospora chaiyaphumensis MC5-1T（AB196710） 99.570 None
10511 大叶山楝 Micromonospora chalcea DSM 43026T（X92594） 99.786 None
31128 盾叶鸡蛋花 Micromonospora eburnea LK2-10T（AB107231） 98.634 None
11009 海南大枫子 Micromonospora tulbaghiae TVU1T（EU196562） 100.00 B, C, E
11118 盾叶鸡蛋花 Nocardia carnea DSM 43397 T（Z36929） 99.359 None
10308 槟榔 Nocardia rhamnosiphila 202GMO T（EF418604） 99.070 A, B
10277 柬埔寨龙血树 Nocardia rhamnosiphila 202GMO T（EF418604） 99.786 None
10914 海南马钱子 Nocardia rhamnosiphila 202GMO T（EF418604） 99.216 D
10913 海南马钱子 Nocardia speluncae N2-11 T（AM422449） 98.992 A, B
30903 海南马钱子 Nocardia thailandica JCM 12356T（AB126874） 100.00 None
30905 海南马钱子 Nocardia thailandica JCM 12356T（AB126874） 99.857 None
51110 盾叶鸡蛋花 Nonomuraea candida HMC10 T（DQ285421） 98.168 A, B
21106 盾叶鸡蛋花 Nonomuraea candida HMC10 T（DQ285421） 97.624 A, B
31132 盾叶鸡蛋花 Nonomuraea candida HMC10 T（DQ285421） 98.720 A
21163 盾叶鸡蛋花 Nonomuraea rubra JCM 3389T（AF277200） 97.267 A, B, C
41169 盾叶鸡蛋花 Streptomyces californicus NBRC 3386T（AB184755） 99.715 B, C
30702 海南粗榧 Streptomyces iranensis HM 35T（FJ472862） 96.802 A, B, E
10251 柬埔寨龙血树 Streptomyces pactum NBRC 13433T（AB184398） 99.717 B, C, E
30507 大叶山楝 Streptomyces pactum NBRC 13433T（AB184398） 99.784 A, B
31102 盾叶鸡蛋花 Streptomyces parvulus NBRC 13193T（AB184326） 99.716 A, B, C
10232 柬埔寨龙血树 Streptomyces rochei NBRC 12908 T （AB184237） 100.00 A, B
10244 柬埔寨龙血树 Streptomyces rubrogriseus LMG 20318 T（AJ781373） 99.929 A, B
10213 柬埔寨龙血树 Streptomyces tendae ATCC 19812T（D63873） 99.644 None
10283 柬埔寨龙血树 Streptomyces tendae ATCC 19812T（D63873） 99.929 A, B
11025 海南大枫子 Streptomyces tendae ATCC 19812T（D63873） 99.716 D
30909 海南马钱子 Streptomyces tendae ATCC 19812T（D63873） 100.00 C, D
None. 无生物活性 ；A. 抗 S. aureus ；B. 抗 C. albicans ；C. 抗肿瘤细胞 ；D. 抗 PTP1B ；E. 抗 Caspase-3
2012年第2期 125黄小龙等 ：热带药用植物根际放线菌的分离、鉴定及生物活性分析
图 1 药用植物根际土壤代表菌株（28 株）16S rRNA 基因序列系统发育树
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期126
隶属于链霉菌属、诺卡氏菌属、小单孢菌属和野野
村菌属，与 18 个有效发表种的 16S rRNA 基因序列
的相似性在 96.8%-100% 之间。其中，菌株 30702
与 Streptomyces violaceusniger clade 中 有 效 发 表 种
Streptomyces iranensis HM 35T（FJ472862） 的 亲 缘 关
系最近，而相似性只有 96.8%，可能是 Streptomyces
violaceusniger clade 中潜在的一个新种。图 1 是根据
16S rRNA 基因序列构建的 N-J 系统发育树。从图 1
可以看出，代表菌株分别与各自相似性最高的有效
发表种聚在一个小的分支上，所有菌株在系统发育
树上形成 4 个大的分支（链霉菌属、诺卡氏菌属、
小单孢菌属和野野村菌属）。在链霉菌属分支上，菌
株 10213、10283、11025 和 30909 分离自不同的植
物根际，与 Streptomyces tendae ATCC 19812T 聚在同
一个分支上，它们具有最高的相似性（99.6%-100%），
然而它们在生物活性上却表现出较大差异（表 3）；
在诺卡氏菌属分支（菌株 10308、10277 和 10914 之
间）中也能发现类似现象。
3 讨论
链霉菌在陆地土壤和其他生态环境中广泛分布，
长期以来一直是抗生素生产的重要来源。近年来尽
管从链霉菌菌株中获得新的有商业用途的抗生素变
得越来越困难，但从特殊生境如沙漠、海洋、植物
组织、根际以及极端环境中分离的链霉菌以及稀有
放线菌却能产生许多新的活性物质［6,18-20］。因此选
择特殊的生态环境分离、筛选新的链霉菌或稀有放
线菌的工作显得尤为重要。近年来基于 rRNA 基因
分析的非培养的分子生物学方法研究表明，根际微
生物的群落结构明显不同于非根际微生物的群落 ；
植物种类相对于其他因素对根际微生物群落的影响
最为明显［21］。可培养的一些研究也显示，根际放线
菌的抗菌比率远高于非根际放线菌 , 从根际分离到
的链霉菌具有广谱抗真菌活性［22］。药用植物既是我
国传统的中药材，也是现代天然药物生产的主要来
源之一，其根际环境不同于其他植物，生长在根际
的放线菌与药用植物长期相互作用形成互惠共生的
关系，放线菌有可能参与药用植物的一些生理代谢
过程而产生药用植物代谢物类似的或新的活性化合
物。海南是我国南药分布的主要区域之一，药用植
物种类繁多，本研究仅对 12 种药理活性明确的药用
植物根际土壤的放线菌进行了选择性分离、种群鉴
定以及生物活性的评价。从获得的 400 株根际放线
菌中筛选到 154 株活性菌株，其中抗菌活性菌株占
较高的比例（78.4%），且不少菌株对多个活性筛选
模型显示为阳性，这与其他药用植物根际放线菌的
抗菌活性评价结果具有一致性［15,16］，从而再次证实
药用植物根际放线菌是抗菌活性物质合成的又一重
要菌源。与其他 3 种筛选模型相比，抑制 PTP1B 和
Capase-3 酶活性的菌株相对较少，可能与这两种筛
选模型是分子水平上的活性筛选有关，这种现象也
出现在前人的报道中［15,16］。12 种药用植物根际放线
菌的活性初筛阳性率呈现出较大的差异，部分来自
不同植物根际的菌株尽管在系统发育树上聚在同一
分支上，具有较高的相似性，但表现出不同的生物
活性，这种结果暗示药用植物根际放线菌生物活性
的差异性可能更多地与植物种类有关，而非由种系
发育的亲缘关系所引起，其具体原因有待深入研究。
4 结论
本研究从 12 种热带药用植物根际选择性分离得
到 400 株放线菌，154 株放线菌在一个或多个活性
筛选模型中显示为阳性，菌株初筛阳性率达 38.5% ；
挑选出 28 株代表性菌株进行 16S rRNA 基因序列分
析，发现其分属于链霉菌属、诺卡氏菌属、小单孢
菌属和野野村菌属。本研究充分显示出海南药用植
物根际放线菌是一类极具潜在开发价值的药用微生
物资源。
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（责任编辑 马鑫）