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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第12期
收稿日期 : 2012-09-29
基金项目 : 内蒙古大学高层次引进人才启动经费（校内批准号 :125107）
作者简介 : 孙鸿举 , 女 , 副教授 , 研究方向 : 植物生化与分子生物学 ; E-mail: sunhj@imu.edu.cn
通讯作者 : 亢燕 , 女 , 博士 , 助理研究员 , 研究方向 : 植物生化与分子生物学 ; E-mail: kangyan105@imu.edu.cn
在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，
25% 的基因编码膜蛋白，其中包括 600 多个类受体
蛋 白 激 酶（receptor-Like protein kinase，RLK）［1］。
BAND7 蛋 白 家 族 包 括 Stomatin、Prohibitin（PHB）、
Flotillin 和 HflK/C 四类蛋白家族，其中 Stomatin 和
Prohibitin 存在于原核和真核生物中，而 Flotillin 和
HflK/C 只存在细菌中［2］。BAND7 蛋白家族最显著
的 特 征 是 具 有 Stomatin/ Prohibitin/ Flotillin/ HflK/C
（SPFH）结构域。该结构域在细菌、古生菌和真核
拟南芥 BAND7 基因序列分析及相关突变体的
生理功能研究
孙鸿举  薛琼  张彦桃  王岩  亢燕  祁智
（内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021）
摘 要 ： BAND7 是具有 SPFH 特征结构域的一类膜蛋白，同其他膜蛋白偶联，调节离子转运和信号转导，广泛分布于不
同的动物细胞中。通过序列比对，在模式植物拟南芥中鉴定到 4 个可能编码 BAND7 蛋白的基因，其基因代码分别是 At1g69840、
At3g01290、At5g62740 和 At5g51570。半定量反转录 PCR 检测发现，它们在拟南芥的叶和根中都有表达，叶中的表达均高于根。
通过 PCR 检测，获得基因 At1g69840 和 At5g51570 的 T-DNA 插入敲除型纯合突变株 SALK_088328 和 SALK_104547。通过对比野
生型植株和基因敲除突变体在不同培养基上的根长和鲜重方面的差异，证明植物 BAND7 基因 At5g51570 参与了植物钙离子的吸收
过程。
关键词 ： BAND7 蛋白 拟南芥 钙 半定量 突变体
Study of Arabidopsis BAND7 Gene Sequence Analysis and Mutant
Physiological Function
Sun Hongju Xue Qiong Zhang Yantao Wang Yan Kang Yan Qi Zhi
（Inner Mongolia University，College of Life Sciences，Hohhot 010021）
Abstract:  BAND7 is one kind of proteins with SPFH structural motif and wildly distributed in various animal cells, which coupled
with other membrane proteins and regulated ion transportation and signaling transduction. By sequencing comparison, four putative BAND7
genes were identified in Arabidopsis, At1g69840, At3g01290, At5g6274 and At5g51570. Semi-quantitative reverse transcript PCR analysis
indicated that they expressed in both the leaf and root with comparable higher expression in the leaf. Through PCR-based detection method,
T-DNA knockout homozygous mutants SALK_088328 and SALK_104547 were identified in the At1g69840 and At5g51570 genes, respectively.
Comparing growth phenotype of the wild type and these mutants revealed a role of At5g51570 in the calcium homeostasis.
Key words:  BAND7 proteins Arabidopsis thaliana Calcium Semi-quantitative Mutants
生物中都被发现，分布广泛且进化保守，这表明该
蛋白家族可能有共同祖先［3］。
在真核生物中，BAND7 蛋白通常是低聚物，主
要参与转录组调控、细胞发育、细胞增殖和维持线
粒体功能等重要的生命活动。例如，Prohibitins 参与
调节 FtsH 膜蛋白酶活性［4］，组装线粒体呼吸复合
物［5］；stomatins 通过与蛋白的直接相互作用来参与
调控动物细胞的离子通道［6］，Flotillins 参与信号转
导和囊泡运输［7］。
2012年第12期 121孙鸿举等 ：拟南芥 BAND7 基因序列分析及相关突变体的生理功能研究
BAND7 蛋白成员富集在脂质筏上［7，8］，即质膜
上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域［9］。目前为止，
拟南芥中 BAND7 蛋白的功能尚未明了，只被推测与
过敏反应相关。在拟南芥中，只有两种 BAND7 蛋白
（At1g69840 和 At3g01290）被鉴定，其氨基酸序列
有 74% 的相似度［1］。研究发现，植物的 BAND7 基
因是过敏诱导反应基因，会在植物发生过敏反应时
大量表达［10］，但是在防御反应中的具体功能有待深
入研究［11］。
作者对 4 个拟南芥 BAND7 基因进行初步研究，
研究其亲缘关系、在拟南芥中的表达情况及相关突
变体的生理特征，为进一步研究其在拟南芥的生理
功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及培养
野 生 型 拟 南 芥 Columbia-0（Col-0），At1g69840
和 At5g51570 的 T-DNA 插入突变株 SALK_088328 和
SALK_104547，购自拟南芥生物资源中心（Arabidopsis
Biological Resource Center，Ohio State University，
USA）。将表面消毒的拟南芥种子置于 1/2MS 培养
基上，4℃避光春化 3 d，然后置于温度为 23-25℃，
湿度为 60%-80%，光照周期为 16 h 光照 /8 h 黑暗，
光照强度为 100-120 μmol/m2·s1 的培养室中培养。
1.2 方法
1.2.1 拟南芥 BAND7 基因的序列分析 将拟南芥
BAND7 蛋白（At1g69840）的氨基酸序列在 http ：//
www.phytozome.net/ 的拟南芥基因组数据库中进行
BLAST 搜索，寻找与 At1g69840 同源性较高的编码
BAND7 蛋白的基因序列。下载同源性较高的 cDNA
序列，用 BioEdit 软件中的 CLUSALW 进行多重比较，
并用 MEGA5 中的最大简约法（Maximum parsimony）
来构建系统发育树。
1.2.2 BAND7 基因表达分析 收集在 1/2MS 培养基
上生长 10 d 的野生型拟南芥幼苗，采用 Trizol 法
分别提取叶和根的总 RNA，用 DNA 酶消化掉可能
的 DNA 残 留， 用 TaKaRa 公 司 的 First Strand cDNA
Synthesis Kit 试剂盒反转录成 cDNA（TaKaRa）。以
合成的 cDNA 为模板，采用 Ex Taq 酶（TaKaRa）进
行半定量 RT-PCR 扩增。
采 用 Primer5 软 件 设 计 引 物， 用 来 扩 增 At1g-
69840 及筛选出的与其同源性较高的 BAND7 基因序
列（At3g01290、At5g51570 和 At5g62740）的保守片
段。选取 ACTIN 为内参。半定量 PCR 反应程序为 ：
95℃预变性 3 min ；95℃ 30 s，50-60℃ 30 s，72℃
30 s，25-30 个循环 ；72℃ 5 min。PCR 产物用 1.0％
琼脂糖凝胶电泳进行分析。
1.2.3 BAND7 基因纯合突变体的 PCR 鉴定 采用
SDS 方法提取拟南芥幼嫩叶子的总 DNA，采用上述
的方法分别提取野生型和突变体幼苗的总 RNA 并反
转录成 cDNA，用 Ex Taq 酶进行 PCR 检测。所用引
物出自 SIAGnAL（http ：//signal.salk.edu/isectprimers.
html），引物分别为 LBb1.3 ：5-ATTTTGCCGATTTC-
GGAAC-3 ；SALK_088328-LP ：5-TTACCTTTACG-
CGGCACATAGG-3 ；SALK_088328-RP ：5-TCAGG-
CTCGATATCCACAATC-3 ；SALK_104547-LP ：5-AA-
AAAGGTGCCTTTTCCCTTC-3 ；SALK_104547-RP ：
5-GCTTGGATCTGCTCTTTAGGG-3。PCR 反 应 程 序
如上。
1.2.4 BAND7 基因纯合突变体的基本生理研究 将
表 面 消 毒 的 野 生 型 和 已 筛 选 的 纯 合 突 变 体
（At1g69840 和 At5g51570）种子置于 4℃黑暗条件下
春化 3 d，然后置于 Ca2+ 浓度分别为 0、100、1000
mol/L 的 1/2MS 培养基上，在上述同样条件的培养室
中培养 10 d 直至幼苗长有四片叶子。分别测量幼苗
主根长、侧根数和鲜重。每个处理重复 3 次，每次
重复随机选取 24 棵幼苗进行测量。
2 结果
2.1 拟南芥中的BAND7基因序列
以 BAND7 At1g69840 氨基酸序列为起始模板，
通过 BLAST 搜索，在拟南芥全基因组数据库中鉴
定到 3 个显著同源序列，对应的基因编码分别是
At3g01290、At5g51570 和 At5g62740。图 1 为这 4 个
基因 cDNA 序列相似度的直观体现，其中 At1g69840
和 At5g62740 亲缘关系最近，自展值高达 98% 。
2.2 BAND7基因的组织特异性表达
为了研究这 4 个 BAND7 基因组织表达特异性，
叶和根的总 RNA 分别提取，进一步合成 cDNA，进
行半定量反转录 RT-PCR。图 2 显示这 4 个基因在叶
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期122
和根中都有表达。At5g62740 在叶中的表达量明显比
根中高。
2.4 BAND7纯合突变体的基本生理研究
在动物细胞中，BAND7 膜蛋白被证明参与其他
离子转运体蛋白功能的调节。在含有不同浓度钙离
子培养基上，SALK_088328 的根长和鲜重同野生型
植物 Col-0 没有显著性区别（图 6）。SALK_104547
突变体在 100 mol/L Ca2+ 条件下，其根长比野生型
植物 Col-0 显著短 45%（图 7-A），鲜重比野生型植
物 Col-0 显 著 少 18%（ 图 7-B）。 表 明 BAND7 基 因
At5g51570 可能参与植物钙营养调节的过程。
3 讨论
拟南芥作为经典的模式植物，被国内外学者广
泛应用于各种基因功能的研究。关于 BAND7 基因
的结构和功能，目前主要以动物和微生物为研究对
象［3， 6， 12］。BAND7 蛋白通常是低聚物，通过调节偶
联的其他膜蛋白来参与相关的生物过程，如参与离
子通道调节、脂质转运或钙离子依赖的囊泡运输等
等［4-7］。
BAND7 基因的结构和功能在拟南芥中研究较
少，到目前为止只有两种 BAND7 蛋白（At1g69840
图 1 拟南芥 BAND7 cDNA 序列最大集约树
AT1G69840
AT5G62740
AT3G01290
At5g51570
98
2.3 BAND7基因T-DNA纯合突变体的鉴定
在拟南芥 T-DNA 突变体库中这 4 个 BAND7 基
因都有相对应的 T-DNA 插入突变体。我们购买了
At1g69840 对应的突变体 SALK_088328 和 At5g51570
对应的突变体 SALK_104547，并且进行了纯合突
变体的鉴定。若植株为野生型植株（AA），因无
T-DNA 插入，用左引物（LP）和右引物（RP）可扩
增出 700-900 bp 的特异 DNA 片段 ；若植株为纯合
体（aa），由于 T-DNA 的插入，左引物和右引物之
间的片段长度远远超过当前 PCR 条件下的 PCR 扩
增长度，无法扩增出 DNA 片段，而用 T-DNA 引物
LBb1.3 与基因右引物进行 PCR 扩增，则能扩增出约
300 bp 的 DNA 片段 ；若植株为杂合体（Aa），用基
因左引物和右引物可扩增出 700-900 bp 的特异 DNA
片段，同时也能用 T-DNA 引物 LBb1.3 与基因右引
物能扩增出约 300 bp DNA 片段。图 3 所示为突变
体 SALK_088328 的 PCR 鉴定结果 ：4 和 8 号植株为
纯合突变体 ；1、3 和 5 号植株为杂合体 ；2 和 6 号
植株为野生型。图 4 所示为 SALK_104547 纯合突变
体鉴定结果，所鉴定的植株全部为纯合体。用左引
物和右引物分别扩增野生型和已鉴定的纯合突变体
的 cDNA，从 RNA 水平证明已鉴定的纯合突变体的
At1g69840 和 At5g51570 已经敲除（图 5）。将最终
筛选出的纯合突变体分别繁种、留种并作相关的表
型分析。
At5g62740
At3g01290
At1g69840
At5g51570
Actin2
ਦ ṩ
图 2 BAND7 基因的组织特异性表达
1 2 3 4 5 6 7 8
LP+RP
LBb1.3+RP
710
bp
300
Aa Aa AaAA AA AA aa
1 2 3 4 5 6 7 8
LP+RP
LBb1.3+RP
710
bp
300
aa aa aaaa aa aa aa aa
At1g69840
Actin
At5g51570
WT SALK_104547 WT SALK_088328
Actin
A B
图 3 BAND7 At1g69840T-DNA 纯合突变体的鉴定
图 4 BAND7 At5g51570T-DNA 纯合突变体的鉴定
A. At1g69840 ；B. At5g51570
图 5 BAND7 基因在突变体和野生型中的 RT-PCR 分析
2012年第12期 123孙鸿举等 ：拟南芥 BAND7 基因序列分析及相关突变体的生理功能研究
和 At3g01290）被鉴定，其氨基酸序列有 74% 的相
似度［1］。本研究对 BAND7 基因的结构和功能进行
初步研究，通过研究发现拟南芥中有同源性较高的
4 种 BAND7 基因，但其基因序列的差异度较大，只
有 At1g69840 和 At5g62740 的亲缘关系较近，在 MP
树上自展值高达 98%（图 1）。上述结果与前人的研
究结果类似，即虽然 BAND7 蛋白的 SPFH 结构域较
为原始，但通过系统发育分析并不能证明其有共同
祖先。
Ca2+ 在植物的生长发育过程中起着重要作用。
据报道 BAND7 蛋白参与调控离子通道蛋白［6］，因
此作者利用 BAND7 纯合突变体进一步研究拟南芥
BAND7 蛋白与植物吸收 Ca2+ 之间的关系。研究发现，
在不同浓度的 Ca2+ 的条件下，BAND7 纯合突变体与
野生型生长情况不同。通过主根长和鲜重两个指标
的对比发现，突变体 SALK_0104547 主根长、鲜重，
在低钙条件下弱于野生型。另外，At5g51570 在叶子
中的表达量明显比根高（图 2），据此推测突变体叶
子的表型可能与野生型不同，但研究发现突变体的
叶子表型与野生型无明显区别（数据未显示）。下一
步作者将进一步研究 BAND7 蛋白如何参与植物钙养
分吸收的分子机制。
4 结论
本研究首次在拟南芥中发现 BAND7 基因，并
0 100 1000
Ca2+µmol
0
1
3
5
6
2
4
ṩ䮯
cm

Col-0
SALK_088328
勌䟽
mg
/ἽṚ

0 100 1000
Ca2+µmol
0
5
10
15
25
35
20
30
A B
图 7 BAND7 SALK_104547 突变体的钙营养生长表型
A. 根长 ；B. 鲜重
A. 根长 ；B. 鲜重
图 6 BAND7 SALK_088328 突变体的钙营养生长表型
ṩ䮯
cm

勌䟽
mg
ἽṚ

4
2
1
3
0
0 100 1000
Ca2+µmol
Col-0
SALK_104547
30
35
25
15
5
40
20
10
0
0 100 1000
Ca2+µmol
A B
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期124
通 过 PCR 检 测， 获 得 BAND7 基 因 At1g69840 和
At5g51570 的 T-DNA 插入敲除型纯合突变体 SALK_
088328 和 SALK_104547。通过进一步比较野生型植
株和纯合突变体在不同培养基上的根长和鲜重方面
的表型差异，证明植物 BAND7 基因 At5g51570 参与
植物钙离子的吸收过程，但关于 BAND7 蛋白如何参
与植物钙养分吸收的分子机制需要进一步深入研究。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）