全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):202-206
氧和铁是生物必需的营养元素，参与代谢时
会产生 O2-、H2O2、·OH 等自由基（Reactive oxygen
species，ROS），造成氧化压力［1］，对 DNA、蛋白
质、膜脂等细胞组分造成氧化损伤［2，3］。Almiron 和
Azam 等［4，5］在长期饥饿培养的大肠杆菌（Escherichia
coli，E. coli） 中 发 现 一 种 消 除 ROS 的 抗 氧 化 蛋
白， 命 名 为 DPS（DNA-binding proteins from starved
cells）。现已证实 DPS 蛋白广泛分布于细菌体内，是
一种重要的抗胁迫蛋白［6］。细菌处于生长静止期或
受胁迫时在体内表达 DPS 蛋白，并与 DNA 结合，
收稿日期 ：2015-02-16
作者简介 ：刘文，女，教授，研究方向 ：分子生物学 ；E-mail ：zblwen@163.com
通讯作者 ：胡巍，男，博士，副教授，研究方向 ：病原微生物分子免疫学 ；E-mail ：sdhuwei@sdut.edu.cn
大肠杆菌 DPS 表达、体外自组装及抗氧化作用研究
刘文  贾义华  方丽  刘长爱  陈浩  路凯敏  胡巍
（山东理工大学生命科学学院，淄博 255049）
摘 要 ： DNA 结合蛋白（DNA- binding proteins from starved cells，DPS）是细菌一类重要的抗逆境保护蛋白。对大肠杆菌
DPS 蛋白进行原核表达和纯化旨为研究其体外自组装和抗氧化活性。构建表达载体 pBVDPSHis，诱导表达并纯化 DPS 单体蛋白，
通过非变性 PAGE 检测 DPS 单体自组装情况，通过质粒在 Fenton 反应时的降解情况检测 DPS 对 DNA 的抗氧化保护作用。结果表明，
PCR 扩增得到 522 bp 的特异性基因片段，成功构建表达载体 pBVDPSHis，诱导表达了分子量为 19.5 kD 的 DPS 单体蛋白，亲和层
析法纯化的单体 DPS 经非变性 PAGE 电泳证实以多聚体蛋白形式存在，Fenton 反应说明 DPS 具有保护质粒 DNA 抗氧化损伤作用。
原核表达的 DPS 在体外可以自组装成多聚体结构具有抗氧化保护 DNA 作用。
关键词 ： 大肠杆菌 ；DPS 蛋白 ；原核表达 ；自组装 ；抗氧化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.026
Expression，Self-assembly and Antioxidation of Escherichia coli DPS
Liu Wen Jia Yihua Fang Li Liu Changai Chen Hao Lu Kaimin Hu Wei
（School of Life Sciences，Shandong University of Technology，Zibo 255049）
Abstract: DNA-binding protein from starved cells（DPS）is a key protective proteins in bacterial growth under stress environment. DPS
was expressed in prokaryotic cells and purified so as to study its self-assembly activity in vitro. The dps gene was amplified by polymerase chain
reaction with specific primers that was inserted by his tag at 3 end and the template was genome from Escherichia coli strain 0111. After digested
together with EcoR I and BamH I restrict enzymes, the dps and pBV220 were linked in order to construct pBVDPSHis expression vector. DPS
expressed in E. coli by temperature induction was purified with affinity chromatography column and its self-assembly in vitro was tested with
natural PAGE on the basis of protein molecular weight. DPS protection for DNA from oxidation was detected with 1.2% agarose electrophoresis.
The results showed that a specific fragment with 522 bp length was acquired and pBVDPSHis vector was constructed correctly using enzyme
digestion and sequencing tests. The DPS with 19.5 kD relative molecular weight on SDS-PAGE was identified with Western blotting, the purified
DPS could self-assembly in vitro into polymers with much larger molecular weight than 19.5 kD in pH7.5 PBS solution and DPS protection DNA
resistance to hydroxyl radicals oxidation could be demonstrated in Fenton reaction system. It was concluded that E.coli DPS expressed genetically
in prokaryotic cells could correctly self-assembly to functional multi-polymers and had a ability of protection DNA from ROS oxidant damage in
vitro.
Key words: Escherichia coli ；DPS protein ；prokaryotic expression ；self-assembly ；antioxidation
2015,31(11) 203刘文等 ：大肠杆菌 DPS 表达、体外自组装及抗氧化作用研究
形成紧密的 DPS-DNA 复合体，保护 DNA 免受氧化
损伤［7］。同时，作为铁蛋白超家族一员，DPS 以
十二聚体结构结合并储存铁，调节铁的供应，防止
铁盐沉淀造成的毒性损伤［8，9］。十二聚体结构作为
DPS 发挥功能的重要结构基础，其自组装过程研究
未见报道。本研究以大肠杆菌基因组为模板，用基
因工程原核表达 DPS，应用纯化的 DPS 观察其在体
外条件下的自组装情况，旨在为研究其自组装和抗
氧化活性提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种、载体、培养基和试剂 菌株为大肠杆
菌 0111 菌株和 DH5α 菌株（本实验室保存）。原核
表达载体是 pBV220 质粒。LB 细菌培养基由 Oxiod
公司胰蛋白胨和酵母提取物配制而成。鼠源抗 HIS
单抗（Anti-His mA）为 Earthox 产品，羊抗鼠辣根
过氧化物酶标二抗购自北京中杉金桥生物技术公司。
亲和层析用 1 mL His Trap FF crude column 柱为 GE
公司产品。其他试剂为国产分析纯。
1.1.2 工具酶和试剂盒 核酸限制内切酶 EcoR I、
BamH I，Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶等均为
Fermentas 公司产品。多功能 DNA 纯化回收试剂盒、
高纯质粒小量制备试剂盒、细菌基因组提取试剂盒
均购自北京博大泰克公司。透析袋（Ф27 mm）为
Union Carbide Corporation 产品。DAB 显色试剂盒购
自北京中杉金桥生物技术公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计、基因扩增和表达载体构建 模板
为提取的 0111 菌株基因组 DNA。特异性上下游引
物为 5-CGGAATTCATGAGTACCGC-3 和 5-GCGGA-
TCCTTAGTGATGATGATGATGATGTTCGATGTTAGAC-
TCG-3，是参考 GenBank 中大肠杆菌 dps 基因序列
设计，其中上游引物引入 EcoR I 酶切位点序列和
ATG，下游引物引入 6×His 序列（斜体部分）、TAA
以及 BamH I 酶切位点序列。引物由上海生物工程技
术服务有限公司合成。
目的基因和提取的 pBV220 质粒分别用 EcoR I、
BamH I 双酶切，T4 连接酶连接，转化 DH5α 感受态
细胞，阳性克隆进行双酶切和测序鉴定。基因测序
送北京华大基因公司完成测序。
1.2.2 蛋 白 表 达 和 纯 化 工 程 菌 在 LB 培 养 基
中 37℃培养至对数期，42℃过夜诱导表达目的蛋
白。沉淀细胞超声破碎后分别取上清和沉淀，用
SDS-PAGE（4% 浓缩胶，12% 分离胶）和 Western-
blotting 检测鉴定目的蛋白。
用 His Trap FF crude column 亲和层析柱纯化目
的蛋白。超声破碎菌体并提取包涵体，用含 6 mol/L
脲的 20 mmol/L 磷酸盐缓冲液（PB）溶解包涵体后
加入到层析柱中，再用含 100-400 mmol/L 咪唑的特
异性洗脱缓冲液洗脱，SDS-PAGE 分析洗脱组分。
1.2.3 DPS 自组装鉴定 将纯化的 DPS 蛋白分别
用含 4、2 和 0.5 mmol/L 脲的 PB 缓冲液，分级逐步
透析去除蛋白溶液中的 6 mmol/L 脲，进行非变性
PAGE 电泳分析，浓缩胶为 4%，分离胶为 10%。
1.2.4 DPS 对 DNA 的抗氧化保护 将等体积 DPS
（1.8 mg/mL）和等体积 pBV220 质粒（40 ng/mL）混
合后，加入等量的 Fenton 试剂（终浓度为 10 mmol/L
H2O2，100 mmol/L FeSO4，50 mmol/L Tris-HCl），
37℃孵育 24 h，1.2% 琼脂糖电泳，检测质粒 DNA
降 解 情 况。 同 时 分 别 用 质 粒、 加 热 变 性 的 DPS、
BSA 蛋白与 Fenton 试剂孵育作为对照体系。
2 结果
2.1 目的基因扩增与表达载体构建
经 PCR 扩增获得了一条特异性 DNA 片段，长
度与 dps 基因 522 bp 相当，重组载体双酶切鉴定也
得到了该片段（图 1）。经 DNA 测序鉴定，重组载
体插入了 3- 末端带有 6×His 标签的 dps 基因序列（测
2000
1000
750
500
250
100
bp
1 2 3M
M ：DL2000 分子量标准 ；1 ：PCR 扩增产物 ；2 ：pBVDPSHis 载体 ；
3 ：重组载体经 EcoR I 和 BamH I 酶切产物
图 1 pBVDPSHis 载体及鉴定
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11204
序结果略）。
2.2 DPS蛋白表达及纯化鉴定
从 SDS-PAGE 结果（图 2-A）可以看出，42℃
诱导的宿主细胞中存在分子量接近 20 kD 的表达蛋
白条带，该蛋白与 DPS 单体蛋白的理论分子量 19.5
kD 相 当。 用 Anti-His mA 单 抗 进 行 Western blotting
检测，结果（图 2-B）表明，工程菌成功表达了带
有 HIS 标签的 DPS 蛋白。另外，表达蛋白主要存在
沉淀中，说明该蛋白是以包涵体形式获得高效表达。
DPS 蛋白。
2.3 DPS体外自组装
纯化的 DPS 蛋白进行 PAGE 分析结果（图 4）
显示，DPS 蛋白在 6 mmol/L 脲的 PB 中出现多条条
带，说明变性蛋白虽能组装成大分子量（十二）聚
体，但仍然有大量的低聚体存在，分子量大多都
超过 66.7 kD。相比而言，脲降低到 0.5 mmol/L 时
蛋白低聚体比例大大降低，大分子量（十二）聚
体蛋白更加稳定。如果在 0.5 mmol/L 脲的蛋白中添
加 NaCl，可以明显促进大分子聚合体的形成，特别
是 50 mmol/L NaCl 浓度时，几乎所有蛋白都自组装
成稳定的十二聚体蛋白，说明 NaCl 能促进自组装
过程。
97.4
kD
1 2 3 4 5 6 7 8M
66.2
43.9
30.0
20.1
A B
M：低分子量标准蛋白；1, 3, 5：未诱导工程菌的细胞蛋白（1：全菌，3：上清，
5 ：沉淀）；2, 4, 6 ：诱导工程菌的细胞蛋白（2 ：全菌 ；4 ：上清，6 ：沉淀）；
7 ：诱导工程菌的全菌蛋白印迹 ；8 ：纯化的 DPS 蛋白印迹
图 2 表达产物的 SDS-PAGE（A）和 Western blotting 分
析（B）
蛋 白 纯 化 后 的 SDS-PAGE 结 果（ 图 3） 显 示，
在特异性洗脱组分中含有目的蛋白（图 3 泳道 6-9），
其中 300 和 400 mmol/L 咪唑洗脱组分中得到较纯的
97.4
kD
1 2 3 4 5 6 7 8 9M
66.2
43.9
30.0
20.1
M ：低分子量标准蛋白 ；1 ：诱导细胞全菌蛋白 ；2 ：沉淀（包涵体）；3，4 ：
穿过峰 ；5 ：非特异性洗脱组分 ；6-9 ：分别用 100、200、300 及 400 mmol/L
咪唑特异性洗脱组分
图 3 DPS 蛋白 SDS-PAGE 结果
kD
1 2 3 4 5 6 7 8
66.7
ॱҼ㚊փ
1 ：1 mg/mL BSA（牛血清白蛋白）；2 ：变性 DPS（6 mmol/L 脲）；3 ：复性
DPS（0.5 mmol/L 脲）；4-8 ：复性 DPS（分别加 50、100、150、200 和 300
mmol/L NaCl）
图 4 纯化的 DPS 蛋白 PAGE 结果
2.4 DPS对DNA的抗氧化保护
结果（图 5）显示，Fenton 反应后，质粒 DNA
在不含 DPS 的反应体系中被完全降解，在含 DPS 的
反应体系中保持不变，在含热变性 DPS 的体系中被
部分降解，而在含 BSA 蛋白的对照组同样被降解。
上述结果说明，Fenton 反应产生的羟基自由基对
DNA 分子造成氧化破坏，而 DPS 对 DNA 分子有抗
氧化保护作用，加热变性后的 DPS 仍有部分保护作
用，而且 DPS 对 DNA 的抗氧化保护是其特异性的
功能，BSA 不具备同样功能。
3 讨论
作为细菌内的抗氧化保护蛋白，DPS 蛋白在菌
体内翻译、自组装成十二聚体结构发挥作用。两个
相邻 DPS 蛋白单体，侧面反向交叉形成一个面，六
个面围城一个近乎球形的六面体，该球形六面体外
径 9 nm，内径 4.5 nm，其中空腔穴带有负电荷，是
2015,31(11) 205刘文等 ：大肠杆菌 DPS 表达、体外自组装及抗氧化作用研究
铁成核及矿化部位［10］。有文献报道，DPS 聚合体是
由 6 个二聚体组合而成，也有说是 4 个三聚体组合
而成［11，12］。本实验中观察到有不同分子量大小的
聚合体，部分支持了这种观点，但也说明还可能存
在其它聚体形式。实验中获得的纯化蛋白经除脲复
性和添加 NaCl 后，可以形成稳定的分子量均一的聚
合，这与文献报道的 DPS 十二聚体的活性结构相吻
合［13］。因此可以确定基因工程表达的 DPS 能够自
组装成十二聚体结构。而 DPS 在 Fenton 反应中对质
粒 DNA 的保护作用的实验结果，证明体外表达纯化
的 DPS 能够发挥抗氧化保护蛋白功能。
DPS 一 方 面 通 过 将 Fe2+ 转 化 成 羟 基 氧 化 铁
（FeOOH）形式防止羟自由基产生［14］，并储存铁元
素，调节铁的利用和储存间平衡 ；另一方面，DPS
能够在逆境环境下与 DNA 分子形成非序列依赖性的
DPS-DNA 复合体结晶，稳定 DNA 分子［15-17］。有些
病原菌甚至利用 DPS 蛋白的活性抵抗药物作用［18］。
因此 DPS 结构及其抗氧化作用都是抗病原菌药物设
计的潜在靶点。另外，DPS 颗粒状结构还是小分子
抗原的展示平台，可用于纳米疫苗的研究。
4 结论
基因工程原核表达的带有 His 标签的 DPS 蛋白，
纯化后能自组装成稳定的十二聚体结构并具有抗氧
化保护质粒 DNA 作用。
参 考 文 献
［1］Lushchak VI. Oxidative stress and mechanisms of protection against
it in bacteria［J］. Biochemistry（Moscow）, 2001, 66（5）：476-
489.
［2］Chiancone E, Ceci P, Ilari A, et al. Iron and proteins for iron storage
and detoxification［J］. Biometals, 2004, 17 ：197-202.
［3］Imlay JA. Cellular defences against superoxide and hydrogen
peroxide［J］. Annu Rev Biochem, 2008, 77 ：755-776.
［4］Almiron, M, Link AJ, Furlong D, et al. A novel DNA-binding protein
with regulatory and protective roles in starved Esherichia coli［J］.
Genes Dev, 1992, 6 ：2646-2654.
［5］Azam AT, Iwata A, Nishimura A, et al. Growth phase-dependent
variation in protein composition of the Esherichia coli nucleoid［J］.
Bacteriol, 1999, 181 ：6361-6370.
［6］Farr SB, Kogoma T. Oxidative stress responses in Esherichia coli and
Salmonella typhimurium［J］. Microbiol Rev, 1991, 55 ：561-585.
［7］Chiancone E. Dps proteins, an effcient detoxification and DNA
protection machinery in the bacterial response to oxidative
stress［J］. Rendiconti Lincei, 2008, 19 ：261-270.
［8］Arosio P, Ingrassia R, Cavadini P. Ferritins ：a family of molecules
for iron storage, antioxidation and more［J］. Biochim Biophys
Acta, 2009, 1790 ：589-599.
［9］Ekman M, Sandh G, Nenninger A, et al. Cellular and functional
specificity among ferritin-like proteins in the multicellular
cyanobacterium Nostoc punctiforme［J］. Environ Microbiol, 2014,
16（3）：829-844.
［10］Le Brun NE, Crow A, Murphy ME, et al. Iron core mineralization
in prokaryotic ferritins［J］. Biochim Biophs Acta, 2010, 1800 ：
732-744.
［11］Roy S, Saraswathi R, Chatterji D, et al. Structural studies on the
second Mycobacterium smegmatis Dps ：Invariant and variable
features of structure, assemble and function［J］. J Mol Biol,
2008, 375 ：948-959.
［12］Ekman M, Sandh G, Nenninger A, et al. Cellular and functional
specificity among ferritin-like proteins in the multicellular
cyanobacterium Nostoc punctiforme［J］. Environ Microbiol, 2014,
16（3）：829-844.
［13］Chiancone E, Ceci P. The multifaceted capacity of Dps proteins
to combat bacterial stress conditions ：Detoxification of iron
and hydrogen peroxide and DNA binding［J］. Biochimica et
Biophysica Acta, 2010, 1800 ：798-805.
［14］Bellapadrona G, Ardini M, Ceci P, et al. Dps proteins prevent
1 2 3 4 5
1 ：质粒 ；2 ：质粒和 Fenton 试剂 ；3 ：质粒、Fenton 试剂和 DPS ；4 ：质粒、
Fenton 试剂和热变性 DPS ；5 ：质粒、Fenton 试剂和 BSA 蛋白
图 5 质粒保护琼脂糖凝胶电泳结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11206
Fenton-mediated oxidative damage by trapping hydroxyl radicals
within the protein shell［J］. Free Radical Biology & Medicine,
2010, 48 ：292-297.
［15］Grove A, Wilkinson SP. Differential DNA binding and protection
by dimeric and dodecameric forms of the ferritin homolog Dps from
Deinococcus radiodurans［J］. J Mol Biol, 2005, 347 ：495-508.
［16］Abbondanzieri EA, Vtyurina N, Meyer A. Nucleoid reorganization
by the stress response protein Dps［J］. Biophysical Journal,
2014, 106（2）（Suppl 1）：79a.
［17］Vtyurina N, Dulin D, Docter M, et al. Chromosome reorganization
by the highly cooperative Dps protein［J］. Biophysical Journal,
2015, 108（2）（Suppl 1）：15a.
［18］赵忠朝 , 张玉秀 , 周正富 , 等 . 耐辐射异常球菌抗氧化保护机
制的研究进展［J］. 生物技术进展 , 2013, 3（2）：109-114.
（责任编辑 狄艳红）