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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):140-145
蓖麻是世界十大油料作物之一，具有极高的经
济价值和广泛的工业用途，是一种十分重要的工业
油料作物。人们对蓖麻产业的重视直接导致蓖麻油
需求量剧增，使得蓖麻原料供求关系极不平衡，而
传统的育种方法又无法有效解决这一矛盾，于是越
来越多的人开始将分子育种技术应用到蓖麻育种工
作中［1］。
早期对蓖麻分子育种的研究主要包括蓖麻再
生体系的构建，自 1998 年 Sujatha Reddy［2］首次报
道了更为稳定的再生体系后，以印度和美国为主的
几家科研机构先后报道了以不同外植体配以不同的
诱导条件构建的再生体系，我国也有很多针对国内
蓖麻品种进行的体外再生研究，这些都为蓖麻实施
分子育种奠定了良好的基础。但对蓖麻的转化体
系研究还处于初级阶段，相关报道较少。2000 年，
Mckeon 等［3］ 曾 申 请 过 蓖 麻 转 化 的 相 关 专 利， 这
是世界上首次成功实施蓖麻转化的报道，转化率
0.42% ；2005 年，Sujatha 等［4］在以胚轴为外植体，
成功构建了以农杆菌介导的蓖麻转化体系，但转化
率极低 ；2008 年，Sailaja 等［5］构建了以萌发后的胚
为外植体的基因枪转化体系，转化效率可达 1.4%，
这也为蓖麻转化提供了新的思路 ；随后 Sujatha 等［6］
收稿日期 ： 2014-09-23
作者简介 ：李伟，男，博士，研究方向 ：植物分子育种 ；E-mail ：skyinmyhear@126.com
通讯作者 ：王昌禄，男，教授，博士生导师，研究方向 ：食品生物技术 ；E-mail ：clw123@tust.edu.cn
农杆菌介导的蓖麻转化体系优化
李伟  翟羽佳  李鹏程  王昌禄
（天津科技大学 食品营养与安全教育部重点实验室，天津 300457）
摘 要 ： 针对影响农杆菌侵染效率的主要因素进行条件优化，确立了以 OD600 为 0.8 的菌液侵染、预培养 5 d 后的外植体为
最佳侵染条件 ；侵染外植体经过 5 d 的共培养并除菌后，转到含有 250 mg/L Kan 的培养基中进行再生诱导，获得了多株具有 Kan
抗性的再生植株 ；通过在共培培养基中添加 20 mg/L AS，124 mg/L Na2S2O3 和 152.4 mg/L DTT，有效地抑制了侵染后外植体的褐化
现象，提高了筛选阶段抗性芽的成活率 ；对具有 Kan 抗性的再生植株进行 PCR 和 Southern blot 验证，共获得 18 株包含外源基因的
阳性转化株。
关键词 ： 蓖麻 ；农杆菌侵染 ；转化体系
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.022
Optimization of Agrobacterium-mediated Transformation in Castor
（Ricinus communis L.）
Li Wei Zhai Yujia Li Pengcheng Wang Changlu
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457）
Abstract: The main factors affecting the efficiency of Agrobacterium infection were optimized, and the optimal infection conditions were
5-day-old pre-cultured explants cultured in bacteria solution with OD600 0. 8. Infected explants after 5 d of co-culture were transferred to medium
with 250 mg/L Kan for bud induction and many strains with Kan resistance ability were obtained. By adding 20 mg/L AS, 124mg/L Na2S2O3
and 152. 4 mg/L DTT in the common culture medium, browning phenomenon was effectively inhibited and survival rate of resistant shoots was
enhanced. Regenerated plants with resistance to Kan were verified by PCR and Southern blot test. Total 18 positive transformants were obtained.
Key words: Castor（Ricinus comunis L.）；Agrobacterium infection ；transformation system
2015,31(5) 141李伟等：农杆菌介导的蓖麻转化体系优化
分别利用农杆菌介导和基因枪的转化方法，均成功
地将 Cry1 基因转入了蓖麻组织中，获得了带有目的
基因的转化株，这也是第一例成功实施蓖麻分子育
种的报道 ；我国的刘鹏等［7］也通过对蓖麻子叶节外
植体实施农杆菌侵染，并成功获得了转化株。
尽管蓖麻分子育种研究取得了一定进展，但依
然存在稳定性差、难以重复等问题。本研究拟在自
主构建的胚尖外植体再生体系基础上，进行农杆菌
介导的蓖麻转化研究，通过对侵染菌种、侵染时机、
侵染强度等影响转化效率的关键因素进行优化，构
建更为稳定的蓖麻转化体系，旨在为高效率进行蓖
麻分子育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 实验用蓖麻品种稼祥 2 号，购于
山东稼祥蓖麻有限公司。侵染农杆菌采用 EHA105
和 GV3101 两株植物转 化 常 用 根 癌 农 杆 菌， 并 以
pBI121 作为侵染质粒，实施农杆菌转化，制备工程
菌种。农杆菌及质粒均由中国农业科学作物科学研
究所抗逆室惠赠。
1.1.2 试剂 实验所用 MS 培养基购于 Phytotech 公
司，6-苄基嘌呤（BA）、吲哚丁酸（IBA）、乙酰丁
香酮（AS）、硫代硫酸钠、二硫基苏糖醇（DTT）、
卡那霉素（Kan）、头孢霉素（Cef）等植物激素及其
他生化制剂均购于天津蓝碧橙生物科技有限公司。
1.1.3 引物合成　试验根据 pBI121 中的 nptII 基因
序列设计了检测引物，委托天津鼎国公司进行合成。
引物序列 ：KanF ：5-TCGTCACCCTTTCTCGGTC-3 ；
KanR ：5-CTGGCGGAGAATCATACGCA-3。
1.2 方法
实验所用基本培养基为 Murashige & Skoog（MS）
培 养 基， 配 以 30 g/L 蔗 糖 和 6.4 g/L 琼 脂 粉，pH
（5.8±0.1）。萌发培养基 ：MS +0.3 mg/L BA ；预培
养培养基 ：MS+0.2 mg/L BA ；共培培养基 ：MS+0.35
mg/L BA+20 mg/L AS+ 124 mg/L Na2S2O3+152.4 mg/L
DTT ；恢 复 培 养 基 ：MS+ 0.35 mg/L BA+350 mg/L
Cef，；筛 选 芽 诱 导 培 养 基 ：MS+0.35 mg/L BA+0.25
mg/L IBA+350 mg/L Cef+250 mg/L Kan，pH（5.8±0.1）；
筛选根诱导培养基 ：1/2MS+0.5 mg/L IBA+350 mg/L
Cef+250 mg/L Kan，pH（5.8±0.1）。以上培养基灭菌
条件为 ：121℃，20 min.
植物组培培养条件为光照强度 2 000 Lx，光照
周期 16/8，28℃培养。
1.2.1 外植体的获取　取完整饱满的蓖麻种子去壳；
用 0.1% 的 KMnO4 浸泡 10 min 消毒 ；用无菌水反复
冲洗 3-4 次 ；将灭菌的种子胚乳拨开，用镊子小心
取出蓖麻胚，接种于萌发培养基中，28℃，暗培养 5 d。
去除萌发胚顶端芽结构，取形态学上端 3-5
mm 的胚尖部位为外植体，接种于预培养培养基中，
28℃，光照培养 3-7 d。
1.2.2 侵染菌种的活化　挑取转入 pBI121 质粒的
农杆菌 EHA105 和 GV3101 单菌落，分别接种于含
有 50 mg/L Kan 和 50 mg/L Rif 的 LB 液体培养基中，
28℃，200 r/min，黑暗培养过夜 ；取培养后的农杆
菌液 1-2 mL，重新接种于有 50 mg/L Kan 和 50 mg/L
Rif 的 LB 液体培养基中，28℃，200 r/min，培养 4-6 h，
进行二次活化 ；将活化好的农杆菌菌液进行 5 000
r/min 离心，收集菌体，用无菌水稀释成特定浓度，
备用。
1.2.3 侵染农杆菌的筛选及侵染强度的优化　将活
化好的农杆菌用无菌水稀释成 OD600 值为 0.6、0.8
和 1.0 三个浓度的侵染液 ；将准备好的外植体用手
术刀轻轻在形态学上端制造数到划痕，置于稀释好
的侵染液中，黑暗条件下，28℃侵染 15 min ；将侵
染后的外植体取出，转移到铺有灭菌滤纸的培养皿
中，吸去多余的菌液，接种于铺有一张滤纸的共培
培养基上，黑暗条件下，28℃进行共培培养 3、5 和
7 d ；共培后的外植体经多次冲洗除菌后，接种于筛
选芽诱导培养基中培养 21 d ；通过统计筛选过程中
诱导出的抗性外植体数目，确定最佳的侵染浓度及
共培时间。根据侵染菌种、侵染浓度以及共培时间
的不同设计实验批次，每组实验 100 个外植体，重
复进行 3 次。
1.2.4 侵染时机的选择　分别选取在含有 0.2 mg/L
BA 的预培养培养基中培养 3、5 和 7 d 后的外植体，
以 OD600 值为 0.6、0.8 和 1.0 三个浓度 EHA105 菌液
实施侵染，经共培 5 d 后，转入筛选培养基观察外
植体生长情况。每组实验 100 个外植体，重复进行
3 次。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5142
1.2.5 共培条件的优化　选取侵染后的外植体，分
别 接 种 于 含 有 0、20、30 和 40 mg/L AS 的 共 培 培
养基中培养，通过统计筛选过程中外植体的抗性芽
数目，确认最佳 AS 浓度，同时对比添加 124 mg/L
Na2S2O3 或 152.4 mg/L DTT 等还原剂对后期外植体生
长状况的影响，确立最佳的共培阶段培养基配方。
1.2.6 植株再生　共培后的外植体，经除菌步骤后，
转接到不含筛选剂的恢复培养基中，28℃，光照培
养 5 d ；选取正常生长的外植体，转入到筛选芽诱导
培养基中，进行芽诱导培养 ；待抗性芽伸长至 3-5
cm 时由基部切下，转入生根培养基中诱导生根 ；将
正常生根的再生植株经炼苗后移入土壤中进行培养。
1.2.7 抗性再生植株的 PCR 验证　取抗性再生植株
的新鲜叶片 200 mg 进行 DNA 提取。采用康维试剂
生产的 PlantGen DNA 试剂盒。以抗性植株 DNA 为
待 测 模 板， 以 KanF、KanR 为 引 物， 进 行 PCR 扩
增，反应条件为 ：95℃预变性 5 min ；95℃变性 30 s，
56℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，循环 30 次 ；72℃延
伸 10 min。PCR 检测以 pBI121 质粒为阳性对照模板，
以野生型蓖麻 DNA 为阴性对照模板。
1.2.8 Southern blot 检测　为进一步验证抗性再生
植株转化成功与否，对 PCR 检测呈阳性的转化植株
进行了 Southern blot 检测。采用 Roche 公司生产的
地高辛标记和检测试剂盒 II。检测样品为待测植物
DNA 的 BamH I 和 Hind III 酶切产物 ；以 pBI121 中
nptII 基因片段合成探针标记 ；具体杂交步骤参照该
试剂盒说明书进行。
2 结果
2.1 菌种的选择与侵染强度
使用两种农杆菌配制不同浓度的侵染菌液进行
了侵染，结果如表 1 所示。从筛选培养 21 d 外植体
的成活数目来看，两种根癌农杆菌的侵染效果相差
不大，以 EHA105 效果较好。侵染菌液浓度对侵染
效果有一定影响，以 OD600 为 0.8 侵染获得的抗性外
植体数较多。相比之下，共培时间对筛选过程中转
化效率影响较大，共培时间过长还会引起较为严重
的外植体褐变现象，这说明共培时期是农杆菌进行
侵染的主要阶段。实验数据显示，共培培养 5 d 时，
抗性外植体的成活率最高。
2.2 侵染时机的选择
实施转化过程中，首先需要将外源基因整合到
表 1 侵染步骤的优化实验
编号 农杆菌 菌液浓度（OD600） 共培时间 /d
成活外植体数 / 个
筛选 7 d 筛选 14 d 筛选 21 d
1 EHA105 0.6 3 38.3±6.3 20.7±8.7 5.0±1.7
2 EHA105 0.6 5 42.7±7.1 25.0±3.6 8.3±3.0
3 EHA105 0.6 7 42.0±4.0 25.3±3.8 7.0±1.7
4 EHA105 0.8 3 47.3±4.5 23.7±4.0 8.0±2.6
5 EHA105 0.8 5 45±5.3 24.0±3.0 10.3±4.1
6 EHA105 0.8 7 34.3±5.7 20.0±3.6 3.7±1.2
7 EHA105 1 3 40.3±2.5 23.3±2.9 4.0±2.7
8 EHA105 1 5 33.0±3.6 22.0±5.3 6.0±2.7
9 EHA105 1 7 35.0±3.0 19.7±3.2 0
10 GV3101 0.6 3 44.7±4.0 18.3±2.1 3.7±1.5
11 GV3101 0.6 5 41.7±3.1 22.3±3.5 6.3±3.1
12 GV3101 0.6 7 37.7±5.9 10.1±4.1 2±2
13 GV3101 0.8 3 38.3±6.3 20.7±8.7 5.0±1.7
14 GV3101 0.8 5 42.7±7.1 25.0±3.6 8.3±3.0
15 GV3101 0.8 7 42.0±4.0 25.3±3.8 7.0±1.7
16 GV3101 1 3 47.3±4.5 23.7±4.0 8.0±2.6
17 GV3101 1 5 45±5.3 24.0±3.0 10.3±4.1
18 GV3101 1 7 34.3±5.7 20.0±3.6 3.7±1.2
2015,31(5) 143李伟等：农杆菌介导的蓖麻转化体系优化
植物细胞中表达，此外，还需要将带有外源基因的
细胞培育成完整的植株。但由于转化针对的外植体
是一个多细胞组织，其中真正具有发育成完整植株
潜力的细胞毕竟只是少数，因此，需要对侵染时间
进行研究，尽量选择胚性细胞开始或已经形成的阶
段实施侵染，以此来提高侵染具有胚性细胞的可能
性。试验选择预培养 3-7 d 后的外植体作为实验材
料进行侵染试验，通过统计不同侵染时间对抗性芽
生成数目的影响，确定最佳侵染时机。结果（表 2）
显示，经过一定时间的预培养后，外植体的成活率
有所提高，外植体的褐化现象也得到一定的抑制，
而侵染菌液浓度影响不大。抗性芽数目统计结果显
表 2 预培养对转化效果的影响
编号 菌液浓度 /OD600 预培养时间 /d 出芽率 /% 筛选 7 d/ 个 筛选 14 d/ 个 筛选 21d/ 个
1 0.6 3 54.8±3.2d 44.0±5.3 30.1±4.2 11.7±3.5
2 0.6 5 56.6±1.8c 47.0±5.3 31.7±7.5 14.0±4.6
3 0.6 7 38.9±2.9g 34.0±4.6 24.3±5.5 3.7±2.1
4 0.8 3 65.1±2.1a 58.0±7.5 37.3±6.5 16.0±6.1
5 0.8 5 52.6±1.9e 37.7±7.5 33.7±7.6 18.3±3.8
6 0.8 7 37.3±3.5h 28.3±6.1 14.0±7.5 1.7±1.5
7 1 3 62.3±1.2b 38.0±7.0 25.0±6.1 10.3±4.9
8 1 5 49.5±0.9f 38.3±3.5 26.0±4.6 7.0±6.2
9 1 7 31.2±3.4i 21.3±3.5 8.3±2.5 1.0±1.0
示，预培养 5 d 后的外植体，在侵染后抗性芽的生
成数目最多。原因可能是由于这个时间胚细胞的活
跃程度与农杆菌的侵染效力最为匹配，使得通过侵
染转入外源基因并且具有再生潜力细胞数目更多。
预培养 7 d 后的外植体生成的抗性芽数目明显减少，
这可能是由于错过了最佳侵染时机所致。最终实验
选择预培养 5 d 后的外植体作为侵染外植体。
2.3 共培培养基的优化
本实验在共培培养基中添加具有强还原作用的
物质，以期缓解和抑制侵染后的褐化现象。通过统
计共培后恢复培养过程中的褐化率和抗性外植体生
长情况（表 3），发现适量的 AS 确实能提高抗性芽
的生成数目，同时添加 Na2S2O3、DTT 也能明显降低
外植体褐化的几率。最后，选择在共培培养基中添
加 20 mg/L AS，124 mg/L Na2S2O3 和 152.4 mg/L DTT
作为最佳共培条件。
2.4 抗性苗的PCR结果
通过 Kan 抗性筛选及再生诱导，实验最终获得
了 29 株再生植株。对转化质粒中的 nptII 基因进行
PCR 检测，在 18 株再生植株中检测到了外源基因，
确定成功整合转化质粒，为转化阳性株。部分转化
株 PCR 检测电泳结果如图 1 所示。阳性对照及阴性
表 3 共培培养基的优化结果
编号
外植体总
数目 / 个
AS/（mg·L-1） Na2S2O DTT
抗性芽数目 / 个
筛选 7 d 筛选 14 d
1 90 0 - - 36 20
2 90 0 + - 36 18
3 90 0 + + 47 40
4 90 20 - - 32 28
5 90 20 + - 45 32
6 90 20 + + 48 45
7 90 30 - - 38 15
8 90 30 + - 36 17
9 90 30 + + 42 39
10 90 40 - - 33 12
11 90 40 + - 34 25
12 90 40 + + 39 28
470
bp
+ M 1 2 3 4 5 6 7
M ：DL2000 DNA marker ；+ ：阳性对照 ；- ：阴性对照 ；1-7 ：不同阳性转化
株的 PCR 产物
图 1 抗性植株 PCR 检测电泳
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5144
对照显示正常，证明检测结果可靠。
2.5 Southern blot检测结果
将 PCR 检测呈阳性的转化株，提取其基因组
DNA，进行 Southern blot 检测。分别提取待测植株
叶 片 组 织 DNA 经 Hind III 和 BamH I 消 化 酶 切 后，
进行 Southern blot 检测实验，杂交结果如图 2 所示。
不同的转化株，其外源基因插入的位点及拷贝数有
一定的差异，但基本都具有外源基因的结合信号，
证明转化载体 pBI121 已经成功的整合到了蓖麻基因
组中，但各转化株中外源基因的拷贝数和插入位点
可能有较大差异。
为 3-5 个月，平均转化率为 0.85%。
3 讨论
农杆菌的侵染是指农杆菌通过感染植物创伤部
位的细胞而改变其表达基因的过程，是对植物细胞
造成损害的过程。侵染强度主要由侵染时间和侵染
菌液浓度两个因素决定。侵染强度过大则可能会使
本就造成创伤的细胞受到更大的损害，导致组织坏
死 ；而侵染强度过小则可能会影响侵染效率。本研
究在实验过程中发现，共培后的外植体即使发芽后
也很容易出现组织褐变坏死的现象，严重影响转化
植株的获得，这可能与侵染强度过大有关。因此，
选择适宜的侵染强度对于防止组织在后续组培过程
中坏死有重要意义，同时也是提高抗性芽诱导效率
的重要因素。
除侵染强度之外，植物细胞的生长状态也是影
响其被侵染后成活效率的因素之一。截取外植体的
过程是对植物细胞进行物理伤害的过程，这些细胞
在被侵染后相当于受到双重伤害，使其更容易产生
严重的褐化反应［10］。将外植体先进行一段时间的预
培养后再实施侵染，可缓解这些植物细胞因物理伤
害对其正常生长的影响，不至于因连续受到损伤坏
死。刚截取的外植体也需要一定时间的诱导才能开
始形成具有胚性的细胞，这也可以最大限度的保证
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1-12 ：不同的转化株的 Southern blot 结果
图 2 Southern blot 检测结果
2.6 农杆菌转化全过程
本实验转化主要步骤如图 3 所示，转化周期约
A B C D
E F G H
A：胚萌发 5 d；B：外植体预培养 3 d；C：共培培养 3-5 d；D：芽诱导培养 5-14 d；E：芽伸长培养 14-28 d；
F ：生根诱导 7-14 d ；G ：移栽前的再生植株 ；H ：移入土壤的植株
图 3 胚尖外植体转化过程
2015,31(5) 145李伟等：农杆菌介导的蓖麻转化体系优化
侵染后的细胞能够发育成完整的植株。最终实验选
择预培养 5 d 后的外植体作为侵染对象，同时优化
了共培培养基成分，提高了获得转化植株的效率。
目前，大多数农作物的转化体系都是由农杆菌
介导，对于蓖麻的转化研究，目前成功获得转化植
株的几篇报道也多是通过农杆菌侵染实现。农杆菌
介导的植物转化法，效果稳定，应用广泛，但也存
在一系列问题。由于基因转入步骤完全依靠农杆菌
本身的侵染能力，很多因素无法控制，如插入位点
的不确定性、转入基因的拷贝数不确定性等［11］，本
实验结果也出现了类似的情况。这说明在农杆菌侵
染的过程中，还有很多值得继续探索的内容，如具
体整合作用基因、插入位点影响因素等，这些工作
虽然基础，但对于其更好的生产应用意义重大，值
得科研工作者们进行深入探讨。
4 结论
本研究通过对影响农杆菌侵染效率的关键因素
进行试验，进一步优化了农杆菌介导的蓖麻转化体
系，确定了以最佳侵染条件为以 OD600 为 0.8 的菌液
侵染经预培养 5 d 后的外植体；最佳共培时间为 5 d；
共培培养基中添加 20 mg/L AS，124 mg/L Na2S2O3，
和 152.4 mg/L DTT 可有效地提高转化效率并缓解外
植体的褐化现象 ；经分子验证确认获得了 18 株阳性
转化株，平均转化率为 0.85%。
参 考 文 献
［1］ 朱保葛 , 李文彬 . 蓖麻生物工程研究进展［J］. 中国生物工程
杂志 , 2007, 27（10）：98-102.
［2］ Sujatha M, Reddy TP. Differential cytokine in effects on the
stimulation of in vitro shoot proliferation from meristematic explants
of castor（Ricinus communis L. ）［J］. Plant Cell Reports, 1998,
17（7）：561-566.
［3］Mckeon TA, Chen GC. Tranformation of Ricinus communis, the
castor plant ：USA, 6620986［P］. 2003.
［4］ Sujatha M, Sailaja M. Stable genetic transformation of castor（Ricinus
communis L.）via Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer
using embryo axes from mature seeds［J］. Plant Cell Reports,
2005, 23（12）：803-810.
［5］Sailaja M, Tarakeswari M, Sujatha M. Stable genetic transformation
of castor（Ricinus communis L. ）via particle gun-mediated gene
transfer using embryo axes from mature seeds［J］. Plant Cell
Reports, 2008, 27（9）：1509-1519.
［6］ Sujatha M, Lakshminarayana M, Tarakeswari PK, et al. Expression
of the cry1EC gene in castor（Ricinus communis L.）confers field
resistance to tobacco caterpillar（Spodoptera litura Fabr.）and
castor semilooper（Achoea janata L.）［J］. Plant Cell Reports,
2009, 28（6）：935-946.
［7］ 刘鹏 , 张立军 , 张春兰 , 等 . 蓖麻子叶节遗传转化研究［J］. 华
北农学报 , 2012, 27（4）：112-117.
［8］ 邓艺 , 曾炳山 , 赵思东 , 等 . 乙酰丁香酮在农杆菌介导的遗传
转化中的作用机制及应用［J］. 安徽农业科学 , 2010, 38（5）：
2229 -2232.
［9］Bro R, Heimdal H. Enzymatic browning of vegetables. Calibration
and analysis of variance by multiway methods［J］. Chemometrics
Intelligent Laboratory Systems, 1996, 34（1）：85-102.
［10］ 张宏平 , 姬爱国 , 和林涛 . 植物组培快繁褐化现象研究进
展［J］. 农业工程 , 2013, 3（5）：128-132.
［11］ Zhao Z, Gu W, Ceil T, et al. High throughput genetic transformation
mediated by Agrobacterium tumefaciens in maize［J］. Molecular
Breeding, 2002, 8（4）：323-333.
（责任编辑 李楠）