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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
目前植物细胞中的叶绿体基因组、线粒体基因
组和核基因组均被植物学家用于系统学研究。每个
基因组的不同基因可能被应用在不同分类等级的类
群。了解不同基因组的特点、不同基因或 DNA 片段
的一般应用分类等级的上下限，以及具体类群的具
体情况，将有助于合理而有效地应用它们去获得系
统发育信息［1］。除此之外，还可以应用同工酶、随
机扩增多态性 DNA（Random Amplified Polymorphic
DNA，RAPD）、简单序列重复（Simple Sequence Re-
收稿日期 ： 2013-04-07
基金项目 ：中央高校基本科研业务费专项资金项目（CUGL110219）, 国家自然科学基金青年科学基金项目（41202013）
作者简介 ：侯新东，男，博士研究生，讲师，研究方向 ：生物化学与分子古生物 ；E-mail ：houxd@cug.edu.cn
基于 ITS 序列探讨 10 种荨麻科植物的系统发育关系
侯新东1，2  尹帅1  盛桂莲1，2  程丹丹1  赖旭龙2
（1. 中国地质大学环境学院，武汉 430074 ；2. 生物地质与环境地质国家重点实验室，武汉 430074）
摘 要 ： 以庐山地区 12 种荨麻科植物为试验材料，开展 ITS 序列研究，探讨该序列作为荨麻科植物系统发育研究的可行性
及传统植物分类与分子系统分类的异同。通过 PCR 扩增和克隆产物测序，获得 10 种荨麻科植物的 ITS 序列。利用 MEGA4.0 软件，
以滇藏荨麻为外类群，采用 NJ 和 MP 法构建系统树结果一致，明显分为 3 个分支，楼梯草族、苎麻族和荨麻族分别构成一支。研
究结果表明用 ITS 序列对荨麻科植物进行系统发育研究是可行的 ；利用分子技术所得到的系统发育结果与传统形态学的分类结果
基本一致。
关键词 ： 核糖体 DNA ITS 荨麻科 PCR 扩增 系统发育分析�
Study on Phylogenetic Relationships of Ten Urticaceae Species
Based on nrDNA ITS Sequences
Hou Xindong1，2 Yin Shuai1 Sheng Guilian1，2 Cheng Dandan1 Lai Xulong2
（1. School of Environmental Studies China University of Geosciences，Wuhan 430074 ；2. State Key Laboratory of Biogeology and
Environmental Geology，Wuhan 430074）
Abstract:  In this study, we collected 12 Urticaceae plants from Lushan mountain area to carry out the study of internal transcribed
spacer（ITS）sequences, and thus further explore the feasibility as a study of the Urticaceae Phylogeny using ITS sequences, as well as the
similarities and differences of traditional plant taxonomy and molecular systematics. We obtained the sequences of nrDNA ITS from 10 species of
Urticaceae by PCR amplification and clone sequencing. For phylogenetic analyses using MEGA 4.0 software, both NJ and MP trees of Urticaceae
were constructed with U.marirei as outgroup. The two methods produced trees with absolutely congruent topology. These phylogenetic trees
showed three separate lineages ：（1）Elatostemeae, （2）Boehmerieae, （3）Urticeae. The results suggested that it is feasible to research the
phylogenetic of Urticaceae plants using ITS sequences. The results were basically consistent about the phylogenetic using molecular techniques
and traditional morphology classification.
Key words:  nrDNA ITS Urticaceae PCR amplication Phylogenetic analysis
peat，SSR）等技术来开展植物系统发育与亲缘关系
研究［2］。分子标记是一种有效的研究植物亲缘关系
的工具［3，4］。RAPD 标记由于快速、操作简单且成
本低，得到了广泛的应用［5，6］。然而 RAPD 是显性
标记，重复性较差，反应条件的任何微小变化都会
引起条带数目和强度的改变［7］。SSR 标记是以 2-5
个核苷酸为基本单位的串联重复序列，广泛存在于
基因组中，并呈均一分布。由于其为共显性遗传，
重复性好，要求简单，已为遗传学家所关注［4，8］。
2013年第8期 69侯新东等 ：基于 ITS 序列探讨 10 种荨麻科植物的系统发育关系
荨麻科植物在中国有 25 属，352 种，26 亚种，
63 变种，在长江流域以南亚热带和热带地区分布最
多，多数种类喜生于阴湿环境。该科植物多为草本，
稀为灌木，无乳状汁，茎皮有较长的纤维［9］。我国
江西省庐山地区气候湿润、降水丰富，适于荨麻科
植物的生长，有 11 属，23 种，3 变种［10］。这些野
生的荨麻科植物都存在着许多未被开发利用的重要
种质资源，而这些种质资源中蕴藏着丰富的优质基
因，可广泛应用于人类的各项生产生活中。因此，
开展荨麻科植物系统发育和亲缘关系研究，对荨麻
科植物的种质资源的收集、保存、遗传育种与栽培
均有一定的理论意义和应用价值。对于荨麻科植物
的系统发育研究多针对苎麻属植物各组间亲缘关系
的探讨［2，11，12］，而对荨麻科植物物种间的分子系统
研究较少。
核 糖 体 DNA 中 的 内 转 录 间 隔 区（internal
transcribed spacer，ITS）序列位于 18S 和 26S rRNA
基因之间，被 5.8S rRNA 基因分为两段，即 ITS1 和
ITS2［13］，是核核糖体（nrDNA）转录单位的一部分，
其所受的选择压力小，与编码区相比，进化速率较
快［14］。与 RAPD、AFLP、SSR 和 SRAP 等技术相比，
采用 ITS 构建系统发育树，具有省时、省工和结果
更加可靠等优点。在被子植物中，ITS 区具有长度
保守性和核苷酸序列的高度变异性，使得这些间隔
区的 DNA 序列在近缘类群间较容易排序，而高度变
异性可广泛应用于植物系统发育与进化研究中。ITS
是最常用作属、种、种下水平遗传分析的片段，截
至 2013 年 3 月在 GenBank 中各种生物的 ITS 序列超
过 908 948 条［15］。该片段已成功应用于杜鹃属［16］、
睡莲属［17］、锦鸡儿属［18］、石竹属［19］、桑属［20］等
植物物种亲缘关系及系统发育研究。本研究测定和
分析 10 种荨麻科植物的核 rDNA 的 ITS 序列，并与
其他近缘种的荨麻科植物的 ITS 序列比较，构建分
子系统树，为荨麻科植物的引种、育种提供必要的
理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验样品为叶片样本，每种均为单株取样。样
品植株采自于江西省九江市庐山牯岭镇的林地，共
采集了 12 种常见的荨麻科植物（表 1）。采样时将
植株装入填充硅胶的密封袋中，-70℃超低温保存，
试验时以叶片为试验材料。
表 1 试验材料来源
种名 属名
苎麻（B.nivea Gaud） 苎麻属（Boehmeria Jacq.）
大叶苎麻（B.grandifolia Wedd） 苎麻属（Boehmeria Jacq.）
序叶苎麻（B. clidemioides var. diffusa Hand） 苎麻属（Boehmeria Jacq.）
悬铃叶苎麻（B.platyphylla Franch） 苎麻属（Boehmeria Jacq.）
冷水花（P. notata C.H.Wright） 冷水花属（Pilea Lindl.）
矮冷水花（P. pepoides Hook） 冷水花属（Pilea Lindl.）
三角叶冷水花（P. swinglei Merr） 冷水花属（Pilea Lindl.）
透茎冷水花（P. mongolica Wedd） 冷水花属（Pilea Lindl.）
粗齿冷水花（P. fasiata Franch） 冷水花属（Pilea Lindl.）
赤车（P. radicans Wedd） 赤车属（Pellionia Gaud.）
庐山楼梯草（E. stewardii Merr） 楼梯草属（Elatostema Gaud.）
糯米团（M. hirta Wedd） 糯米团属（Memoriali Buch.）

1.2 方法
1.2.1 试验材料的前处理 把试验所用的植物叶片
用自来水清洗后，再用灭菌双蒸水进行清洗 1-2 遍，
放到 50℃烘箱中烘干，称取干燥的叶片 20 mg，放
到已灭菌过的研钵中，加入液氮充分研磨。
1.2.2 植物总 DNA 提取 采用改良的 CTAB 法［21］
进行提取植物总 DNA。
1.2.3 ITS 序列的 PCR 扩增 扩增 ITS 序列采用通用
引物［11］进行 PCR 扩增。上下游引物分别为 ITS-4 ：
5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ；ITS-5 ：5-GG-
AAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，由金斯瑞公司（中
国南京）合成。
50 μL PCR 反应体系包括 ：10×PCR 缓冲液 5
μL ；25 mmol/L MgCl2 4 μL ；10 mmol/L dNTPs 1 μL ；
DNA 模板 1.5 μL ；10 μmol/L 引物 ITS-4 和 ITS-5 各
2 μL ；5 U Taq DNA 聚合酶 0.5 μL ；双蒸水（ddH2O）
34.0 μL。PCR 反 应 程 序 ：94℃ 3 min ；94℃ 45s、
52℃ 1 min、72℃ 1 min，35 个 循 环 ；72℃ 10 min。
反应在 Bio-Rad PCR 仪上进行。经 1.5% 琼脂糖凝胶
电泳检测 PCR 产物。
1.2.4 ITS 序列的纯化、克隆及测序 PCR 产物经
1.5% 琼脂糖凝胶电泳后，于紫外灯下切割目的条
带，用凝胶回收试剂盒（QIAGEN 公司，德国）回
收，使用 TaKaRa 公司（日本）生产的连接试剂盒
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期70
（pMD18-T 载体）与纯化得到的 ITS 片段在 16℃连
接过夜，转化大肠杆菌 JM109 感受态细胞之后，涂
布在固体 LB 培养基上，选用氨卞青霉素抗性（Ampr）
在 37℃倒置培养过夜，挑出白色菌斑进行 PCR 检测。
将克隆 PCR 检测得到的阳性克隆制备成菌液，
然后送到南京金斯瑞公司进行测序。测序引物为
M13F/M13R。经过菌落 PCR 鉴定后，挑选阳性克隆的
菌液送金斯瑞公司（南京）进行双向测序并校准。
1.2.5 序列分析与构建系统发育树 将测序得到的
序列导入 BioEdit 软件中，然后通过导入相对应的上
下游引物的信息找出引物在所得到序列中的位置，
删除包含引物在内的两侧序列。用 DNAStar 软件
（DNASTAR，Inc）对所得序列进行剪切、编辑和比
对，并辅以人工校正。使用 MEGA 4.0 软件［22，23］对
10 种荨麻科植物序列进行多态和信息位点的统计分
析与系统发育树的构建。采用最大简约法（MP 法）
和邻近法（NJ 法）构建分子系统树，再应用自展法
（Bootstrap）对所构建的系统树进行检测，自展重复
次数设定为 1 000 次。10 种荨麻科植物的 DNA 多态
性用 DnaSP 5.0 软件［24］进行分析。
2 结果
2.1 ITS序列PCR扩增结果
利 用 引 物 对 试 验 材 料 的 总 DNA 进 行 PCR 扩
增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 1
所示。
麻，648 bp ；（2） 苎 麻，682 bp ；（3） 序 叶 苎 麻，
648 bp ；（4）冷水花，641 bp ；（5）矮冷水花，674
bp ；（6）粗齿冷水花，674 bp ；（7）三角叶冷水花，
669 bp ；（8）赤车，705 bp ；（9）庐山楼梯草，690
bp ；（10）糯米团，636 bp。悬铃叶苎麻与透茎冷水
花经多次克隆试验，未能获得测序结果。对于所测
得的克隆序列，通过 BioEdit 软件找出上下游引物所
在位置，截取引物之间的序列，最后在 GenBank 中
Blast 查询获得的序列，确定这些序列为荨麻科植物
的 ITS 序列。
2.3 ITS序列分析
整个 ITS 序列的变异范围为 636-705 bp，平均
长度约为 667 bp。在 ITS1 区，其长度变异范围为
257-284 bp，平均为 273 bp。5.8S nrDNA 序列，长
度均为 162 bp。在 ITS2 区，其长度变异范围是 238-
303 bp，平均为 266 bp。其 ITS 序列长度和 G+C 含
量 存 在 较 大 差 异，ITS1 序 列 为 257-284 bp，G+C
含 量 变 异 范 围 是 46.5%-64.5% ；ITS2 序 列 为 238-
303 bp，其 G+C 含量变异范围是 43.7%-55.4% 。除
赤车外，其他 9 种荨麻科植物 ITS2 序列比 ITS1 序
列的 G+C 含量低。且荨麻科 10 种植物的 ITS 序列
长度与其 G+C 含量并不成正相关，比如序叶苎麻、
大叶苎麻和糯米团的 ITS 序列长度较短，但是其
G+C 含量在 10 种荨麻科植物中却是较高的。ITS 区
和各分区长度及 G+C 含量变异见表 2。
10 种荨麻科植物 ITS 区序列的多态性，见表
3。将 10 种荨麻科植物整个 ITS 区排序后总长度为
748 bp，其中 ITS1、5.8S 和 ITS2 排序后的长度分别
为 303 bp、162 bp 和 322 bp。将空位作缺失处理时，
整个 ITS 区共有多态位点 240 个，其中 ITS1、5.8S
和 ITS2 的多态位点分别为 142、20 和 105 个。5.8S
rDNA 变异较小，保守位点 142 个，占 87.7%，信息
位点较少，只有 8 个。ITS 区的多态性主要表现在
转录间隔区，其中 ITS1 区的多态性位点要多于 ITS2
区，而信息位点的数量是 ITS2 区多于 ITS1 区。整
个转录间隔区（ITS1+ ITS2）对位排列后总长度为
621 bp，共有 229 个多态位点（包括 78 个转换，80
个颠换），59 个信息位点，10 个单倍型，单倍型的
多样性值为 1.00。
1500
bp
1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13
1000
500
400
300
200
100
1 ：大叶苎麻 ；2 ：序叶苎麻 ；3 ：苎麻 ；4 ：赤车 ；5 ：糯米团 ；6 ：粗齿冷水花 ；
7 ：庐山楼梯草 ；8 ：三角叶冷水花 ；9 ：冷水花 ；10 ：悬铃叶苎麻 ；11 ：透
茎冷水花 ；12 ：矮冷水花 ；13 ：PCR 对照 ；M ：100 bp DNA Ladder
图 1 ITS 引物 PCR 扩增产物电泳检测图谱
2.2 测序结果
有 10 种荨麻科植物获得了序列 ：（1）大叶苎
2013年第8期 71侯新东等 ：基于 ITS 序列探讨 10 种荨麻科植物的系统发育关系
表 3 10 种荨麻科植物 ITS 区序列多态性
序列 保守位点 多态位点 信息位点
ITS1 85/303 142/303 27/303
5.8S rDNA 142/162 20/162 8/162
ITS2 90/322 105/322 37/322
ITS1+ITS2 181/621 229/621 59/621
Total 293/748 240/748 62/748
2.4 系统发育分析
由于 5.8S rDNA 序列较为保守，信息位点较少，
因此不适用作系统发育的分析。在本研究中应用
ITS1 和 ITS2 区的序列进行系统发育的分析。
分 别 采 用 NJ 法 与 UPGMA 法， 以 滇 藏 荨 麻
（U.marirei）为外类群构建系统发育树。11 种植物在
两个系统发育树上的位置完全一致（图 2，图 3）。
系统发育树结果明显分为 3 个分支，楼梯草族（El-
atostemeae）、苎麻族（Boehmerieae）和荨麻族（Urt-
iceae）分别构成一支。楼梯草族为第一大分支，包
括粗齿冷水花、三角叶冷水花、矮冷水花、冷水花、
赤车和庐山楼梯草，自展支持率都为 91%（NJ 和
MP）。其中，冷水花与矮冷水花聚为一组，自展支
持率分别为 74%（NJ）和 76%（MP）；粗齿冷水花
与三角叶冷水花聚为一组，节点支持率分别为 99%
（NJ）和 98%（MP）；赤车和庐山楼梯草组成了一组，
节点支持率为 99%（NJ）和 100%（MP）。苎麻族构
成了第二大分支，包括苎麻、大叶苎麻、序叶苎麻
和糯米团，自展支持率分别为 99%（NJ）和 100%
（MP）。其中，大叶苎麻和序叶苎麻聚为一类，位于
分支内侧，紧接着是苎麻，而糯米团位于该分支的
最外侧，节点支持率都大于 98%（NJ 与 MP）。荨
麻族的滇藏荨麻单独为一支，位于系统发育树的最
外侧。
0.05
99
99
99
99
9991
65
74 P. notata
P. pepoides
P. fasiata
P. swinglei
P. radicans
E. stewardii
M. hirta
B. nivea
B. clidemioides var. diffusa
B. grandifolia
U. mairei
ᾬở㥹᯿
㣾哫᯿
㦘哫᯿
分支上的数字是 1 000 次自展的数据支持率
图 2 基于 ITS1 与 ITS2 序列用 NJ 法构建的系统发育树
76
99
9891
100
100
100
98
P. notata
P. pepoides
P. fasiata
P. swinglei
P. radicans
E. stewardii
M. hirta
B. nivea
B. clidemioides var. diffusa
B. grandifolia
U. mairei
ᾬở㥹᯿
㣾哫᯿
㦘哫᯿
分支上的数字是 1 000 次自展的数据支持率
图 3 基于 ITS1 与 ITS2 序列用 MP 法构建的系统发育树
3 讨论
本试验对于在电泳结果出现两条或两条以上的
DNA 条带，只切取了其中一条长度为 700 bp 左右
表 2 10 种荨麻科植物的 ITS 区序列长度和 G+C 含量
种名
ITS1 5.8S ITS2 ITS（including 5.8S）
Length（bp） G+C（%） Length（bp） G+C （%） Length（bp） G+C（%） Length（bp） G+C（%）
B. nivea 271 61.6 162 56.2 284 53.6 682 57.2
B. clidemioides var. diffusa 268 64.5 162 55.6 253 55.4 648 59.3
B. grandifolia 268 63.8 162 55.6 253 55.4 648 58.9
P. notata 276 55.1 162 54.9 238 51.7 641 53.7
P. pepoides 277 55.7 162 53.7 270 51.1 674 54.0
P. fasiata 278 59.0 162 55.6 268 54.9 674 55.2
P. swinglei 281 57.1 162 56.1 261 54.8 669 56.8
P. radicans 265 46.8 162 53.1 303 47.0 705 47.9
E. stewardii 284 46.5 162 50.6 279 43.7 690 46.1
M. hirta 257 57.4 162 56.2 252 52.1 636 58.9
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期72
的 DNA 条带，因为多数植物的 ITS 基因序列的长度
都在 600-750 bp 之间，所以本试验在切胶时舍弃了
550 bp 及 800 bp 的 DNA 条带，这可能会对试验结
果有一定的影响，在后续的研究中进一步优化 PCR
扩增体系和条件，避免这种非特异性扩增的出现。
ITS 区由于序列短、两端连接高度保守区、拷
贝数多、长度保守、一致进化、进化速率较快等，
适用于被子植物科内，尤其是近缘属间及种间甚至
居群间关系的研究。在本研究中，ITS 序列可以较好
地支持所研究的 10 种荨麻科植物之间属种亲缘关系
的划分。通过这 10 种荨麻科植物 ITS 序列的比对可
以发现，整个序列共有保守位点 293 个，多态位点
240 个，单一信息位点 62 个，信息位点所占的百分
数达到了 8% 以上。从基于 NJ 和 MP 构建的系统发
育树可以看出，每个分支基本上都达到 65% 以上的
分支支持率。由此可见，用 ITS 序列对荨麻科植物
进行系统发育研究是可行的。
由系统发育树可以观察到，荨麻族荨麻属的滇
藏荨麻首先与荨麻科其它族属的植物分开。荨麻属
植物在形态上具有螯毛，而研究的其它属的植物都
不具有螯毛 ；可能由于在形态上有这种差别，结果
荨麻属植物在一级分支中就首先分出。其余的 5 个
属则聚成两大分支。其中，冷水花属、赤车属和楼
梯草属聚为第一大分支，其自展支持率均为 91%
（NJ 和 MP）。这 3 个属植物具有相似的形态学特征 ：
它们都为草本，植物无刺毛，雌花被 3（～5）裂，
与子房离生，柱头画笔头状［10］。冷水花属的 4 种植
物，矮冷水花和冷水花聚在一起 ；三角叶冷水花和
粗齿冷水花聚为一组。矮冷水花和冷水花在形态大
小上有较大差别 ；但它们的相似之处在于茎都为肉
质 ；叶对生 ；叶基部宽楔形或圆形，边缘在基部或
中部以上有浅牙齿，上面密生条形的钟乳体。三角
叶冷水花和粗齿冷水花的叶缘多为牙齿状锯齿［9］。
这一大分支中除了 4 种冷水花之外，还包括赤车属
的赤车和楼梯草属的庐山楼梯草，这两种植物也聚
为一组。第二大分支包括糯米团属和苎麻属，其分
支支持率分别为 99%（NJ）和 100%（MP）。其中，
苎麻属的苎麻、序叶苎麻和大叶苎麻聚在一起成为
一组，并且该组的自展支持率为 99%（NJ）和 98%
（MP），糯米团属的糯米团单独为一小分支。序叶苎
麻和大叶苎麻亲缘关系较近，而二者与苎麻的亲缘
关系相对较远。苎麻为半灌木，而序叶苎麻和大叶
苎麻为草本。糯米团与 3 种苎麻属的植物聚在一个
大分支上，因为这 4 种植物有共同形态学特征，无
刺毛，花单性，雌花被常呈管状，贴生于子房，柱
头舌状至丝形。
从研究结果来看，利用 ITS 序列作为分子系统
学的手段所得到的系统发育结果与传统的形态学的
分类结果基本是一致的，但是在个别物种的分类位
置上存在一定差异。虽然在第一大分支上，包括冷
水花属、赤车属和楼梯草属，但这些属的植物都同
属于楼梯草族。第二大分支的有两个属 4 种植物组
成，它们都属于苎麻族。滇藏荨麻作为外来群，属
于荨麻族。以上这些根据分子系统的分类与形态学
分类是一致的，但是在分支内还是有些差异，第一
大分支内的赤车和庐山楼梯草聚在一起，在形态学
分类上，它们分别属于赤车属和楼梯草属，出现这
种情况的原因是赤车属和楼梯草属的植物采集的样
品个体较少，获得的 ITS 序列较为单一，从而造成
了这种差异。在今后的研究中，需要加强样品采集，
同时结合更多的分子标记序列进行更为深入地系统
发育研究。
4 结论
获得了 10 种荨麻科植物的 ITS 序列，其中楼梯
草族植物 6 种，苎麻族植物 4 种。构建系统树，楼
梯草族、苎麻族和荨麻族分别构成一支。
致谢：对江西省九江市庐山国土资源局地质公
园管理办公室宋江宁主任在样品采集过程中提供的
帮助表示衷心地感谢。
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（责任编辑 李楠）