全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
激发子 PebC1 原核表达蛋白的生物活性分析
张云华 杨秀芬 曾洪梅 袁京京 邱德文
（中国农业科学院植物保护研究所 农业部生物防治重点开放实验室，北京 100081）
摘 要: 将激发子 PebC1 基因在大肠杆菌中进行表达，重组蛋白可以明显促进植物生长，诱导植物产生抗旱性和抗病性。用
不同浓度的重组表达蛋白 PebC1 处理番茄，其幼苗的株高分别增加了 24.56%-48.34% ；同时诱导了番茄对灰霉病的系统抗性，番
茄的病叶率和病情指数均明显下降，诱抗效果达到 34.06%-52.44%。小麦经重组表达蛋白 PebC1 处理后，叶片的抗衰度和幼苗存
活率也明显增加，抗旱综合系数从 15.28 提高到了 64.88。
关键词: 激发子 重组表达蛋白 生物活性
Biological Activity Analysis of a Novel Protein Elicitor PebC1
Expressed in Prokaryote
Zhang Yunhua Yang Xiufen Zeng Hongmei Yuan Jingjing Qiu Dewen
（Key Laboratory for Biological Control of Ministry of Agriculture， Institute of Plant Protection，
Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081）
Abstract: The gene of PebC1， a novel protein elicitor， was expressed in E.coli， and recombinant protein would obviously promote the
growth of plants， inducing the plant resisting the drought and the disease. Treating the tomato by different concentrations of the recombinant
protein PebC1， the height of seedlings increased 24.56%-48.34%， respectively. In the same time， the recombination protein PebC1 also
induced tomato disease resistance to gray mold. The rate of tomatos ill-leaves and disease index declined apparently， the effect of which could
be 34.06%-52.44%. Seedling height and its length of descending axis were also obvious high after the wheat treated by the recombination protein
PebC1. Coefficient of comprehensive wheat drought tolerance also enhanced from 15.28 to 64.88.
Key words: Elicitor The recombinant protein Biological activity
收稿日期 ：2011-05-05
基金项目 ：国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2011AA10A205），公益性行业科研专项（200903052）
作者简介 ：张云华，女，博士，研究方向 ：分子生物学 ；E-mail:zyhzls@163.com
通讯作者 ：邱德文，E-mail:dewenqiu@hotmail.com
激发子作为诱导植物产生抗性的因子能显著提
高植物的广谱抗性，且不会使病原物产生抗药性，
对环境无污染，符合新型生物农药的要求，受到广
泛关注。1992 年美国的 Wei[1] 从梨火疫病菌（Erwinia
amylovora）中分离到 harpinEa 蛋白，该激发子能够
促进植物生长，诱导植物产生抗病性。2001 年，美
国康奈尔大学和 EDEN 生物科技公司将 harpinEa 在
大肠杆菌（Escherichia coli）中表达，开发了新型绿
色生物农药 Messenger，应用于农业生产，抗病增
产效果非常显著，可减少用药 50%-80%，增产达
10%-20%[2，3]。
Lyon 与 Reglinski 等 [4，5] 报道，激发子防治大
田谷类白粉病可达到中等水平的防效。Calonnec
等 [6] 用 激 发 子 诱 导 的 小 麦 抗 性， 可 使 小 麦 白 粉
病 的 发 病 程 度 控 制 在 44%-57%。 合 成 型 激 发 子
CGA245704 是第一代通过激发小麦产生抗性，用
于 防 治 小 麦 白 粉 病 的 植 物 保 护 剂（plant tonic），
在德国已投入市场。
PebC1 是从灰葡萄孢菌 （Botrytis cinerea） 中纯化
出来的一种具有潜在应用价值的蛋白激发子，它能
够提高植物的抗病性和抗旱性 [7]。为了更好地利用
该激发子，本研究构建 PebC1 基因工程菌株，对在
大肠杆菌中表达的重组蛋白进行生物活性研究，以
期为 PebC1 蛋白应用于农业生产提供参考和依据。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期124
1 材料与方法
1.1 材料
小麦品种 CA0045，由中国农业科学院作物科
学研究所提供 ；番茄品种中蔬 6 号，由中国农业科
学院蔬菜花卉研究所提供 ；质粒 pMD19-T/PebC1 由
本实验室保存 ；大肠杆菌（Escherichia coli）Rossetta
（DE3）菌株感受态细胞购自 TransGen Biotech 公司。
1.2 方法
1.2.1 基因遗传操作 质粒的提取和转化、限制性
酶切、凝胶电泳以及 DNA 连接方法参考文献 [8]。
1.2.2 PebC1 基因的表达 在 PebC1 基因的两端分别
引入 EcoR Ⅰ和 Sal Ⅰ的酶切位点，设计引物 PebC1-
EcoR Ⅰ：5-CGGAATTCATGTCGAACCCACGTATTGA
AG-3 和 PebC1 -Sal Ⅰ：5-ACGTCGACCTATATGCTTA
GATCCATGATGGAA-3。以质粒 pMD19-T/ PebC1 为
模板进行 PCR 扩增，扩增程序 ：94℃预变性 3 min ；
94℃变性 30 s，60℃复性 30 s，72℃延伸 1 min，35
个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。扩增产物回收后经
EcoR Ⅰ和 Sal Ⅰ双酶切，连接到表达载体 pET-28a（+）
上，连接产物转化大肠杆菌 DH5α，筛选阳性克隆后
提取重组质粒，验证正确后再转化大肠杆菌 Rossetta
（DE3），得到表达菌株。
表达菌株经1 mmol/L IPTG诱导4 h后，5 000 r/min
离心 10 min 收集菌体，用 20 mmol/L pH7.4 的磷酸
缓冲液溶解菌体。菌体悬浮液经 100℃水浴中加热
处理 20 min，13 000 r/min 离心 10 min，上清液进行
12%SDS-PAGE 电泳检测，考马斯亮兰染色。
1.2.3 重组表达蛋白的纯化 利用 ÄKTA explorer10
蛋白纯化仪进行纯化。选用 Hitrap chelating Column
柱进行亲和层析。先用含 40 mmol/L 咪唑的 20 mmol/L
pH7.4 磷酸缓冲液平衡亲和柱，重组蛋白液离心
后进样，流速为 1 mL/min，淋洗至基线后，用含
500 mol/L 的咪唑的 pH7.4 的 20 mmol/L 磷酸缓冲液
进行梯度洗脱 ；洗脱下来的蛋白进行 SDS-PAGE 电
泳和考马斯亮兰染色检测蛋白的纯度。
1.2.4 重组表达蛋白 PebC1 对番茄幼苗生长的影
响 番茄种子消毒后用 2.5、5、10、20 μg/mL 表达
后的纯化蛋白浸种 36 h，播入营养钵中，以清水作
为对照，每个处理 10 株，重复 3 次，适时补水，8
周后测量幼苗株高。
1.2.5 重组表达蛋白 PebC1 对番茄抗灰霉病的诱导
作用 用表达蛋白 PebC1（浓度分别为 1、5、10、
20 μg/mL）喷雾处理 6-8 叶期的番茄叶片，处理 4 d
后接种灰葡萄孢菌孢子悬液，灰葡萄孢菌孢子悬液
的制备和接种均参考文献 [9]。每个处理 3 株，重复
3 次。用清水作为对照。保湿 24 h，1 周后进行病级
调查，计算诱抗效果。
1.2.6 重 组 表 达 蛋 白 PebC1 对 小 麦 抗 旱 性 的 影
响 取籽粒饱满的小麦种子， 消毒后用 2.5、5、10、
20 μg/mL 的纯化蛋白浸种 8 h，播入营养钵中，以清
水作为对照，每处理 10 粒种子，小麦生长 3 周时停
止补水，进行干旱胁迫，当 70% 植株萎蔫，叶片卷
成针状时，复水，再次干旱胁迫后，再复水，1 周
后统计幼苗存活率和叶片抗衰度。计算幼苗抗旱综
合系数 [10]。各处理均重复 3 次。
2 结果
2.1 PebC1基因表达载体的构建
为方便目的基因与 pET-28a（+）连接，在正向
引物和反向引物的 5 端分别引入 EcoR I 和 Sal I 酶
切位点，设计出一对引物 PebC1-EcoR Ⅰ和 PebC1-
Sal Ⅰ，以质粒 pMD-19/PebC1 为模板，进行 PCR，得
到预期大小的片段，纯化回收后分别用 EcoR Ⅰ /
Sal Ⅰ双酶切，与同样酶切的 pET-28a（+）载体连接，
转化大肠杆菌 DH5α，卡那霉素筛选后，挑取生长
良好的克隆，提取质粒，酶切鉴定正确后（图 1），
将阳性克隆菌液进行测序验证。结果表明，pET-28a
（+）载体中的目的基因与 pMD19-T 载体上的基因序
图 1 pET-28a（+）/PebC1 重组质粒的酶切鉴定电泳图
1,7. EcoR I 和 Sal Ⅰ酶切 ；2-4. pET-28a（+）/PebC1 重组质粒；
5. EcoR I 酶切 ；6. Sal Ⅰ 酶切 ；8.DNA 分子量标准
2011年第12期 125张云华等 ：激发子 PebC1 原核表达蛋白的生物活性分析
列完全相同，阅读框也正确，表明目的基因已成功
构建到表达载体中，将构建成功的原核表达载体命
名为 pET-28a（+）/PebC1。
2.2 重组蛋白的诱导表达
将携带 pET28a（+）/PebC1 重组质粒的 Rossetta
（DE3）和只含 pET-28a（+）的对照菌株 Rossetta（DE3）
接种至 LB 液体培养基中，37℃培养 3 h 后，再经
1 mmol /L IPTG 诱导培养 4 h，离心收集菌体，进行
SDS-PAGE 电泳检测（图 2），从图 2 可以看到，连
有目的片段的载体的全蛋白与空载体相比有一条差
异蛋白带且蛋白含量较高，分子量大小与我们预测
的大小相符。采用 pET-28a（+）表达载体时采用的
酶切位点位 EcoR Ⅰ / Sal Ⅰ时，引入了 36 个氨基酸，
共 3.669 kD，纯化的灰葡萄孢菌蛋白激发子在 SDS-
PAGE 中显示为 36 kD 左右，表达蛋白在 SDS-PAGE
中应为 39 kD 左右。
2.4 重组表达蛋白PebC1对番茄幼苗生长的影响
番茄种子用不同浓度的重组表达蛋白浸种后，
8 周后幼苗株高均极明显地高于对照，增加率分别
达 到 24.56%-48.34%（ 表 1）。 说 明 重 组 表 达 蛋 白
PebC1 对番茄幼苗的生长有明显的促进作用。
图 2 重组质粒 pET-28a（+）/PebC1 在 E.coli DE3
诱导表达的 SDS-PAGE 电泳图
图 3 纯化的表达蛋白 SDS-PAGE 电泳图
表 2 重组表达蛋白 PebC1 对番茄抗灰霉病的影响
表达蛋白浓
度（μg/mL） 病叶率（%） 病情指数 诱抗效果（%）
0 82.18±1.57 A 50.61±0.51 A
1 67.55±1.09 BC 31.82±0.58 B 37.13
5 74.20±0.83 B 30.99±0.48 B 38.76
10 57.33±0.92 C 24.07±0.75 C 52.44
20 65.05±1.20 C 33.37±0.84 B 34.06
2.3 重组表达蛋白的纯化
将加热后的重组表达蛋白进行亲和层析，上样
缓冲液为 pH7.4 的 20 mmol/L 磷酸缓冲液，洗脱缓
冲液是在上样缓冲液中加入 500 mmol/L 的咪唑。以
含 40 mmol/L 咪唑的洗脱缓冲液平衡亲和柱，然后
分别用含 75、200、500 mmol/L 咪唑的洗脱缓冲液
梯度洗脱，收集洗脱液，经 SDS-PAGE 检测（图 3）
发现，用含 500 mmol/L 咪唑的缓冲液洗脱下来的蛋
白纯度较好，考马斯亮蓝染色呈现单一条带，可以
满足后续的生物活性测定。
表达蛋白浓度（µg/mL） 株高（cm） 增加率（%）
0 15.35±0.24 B
2.5 22.77±0.63 A 48.34
5 20.62±0.49 A 34.33
10 19.12±0.32 A 24.56
20 21.91±1.03 A 42.74
表 1 表达蛋白对番茄幼苗生长的影响
同列数据后不同大写字母表示 1% 水平时差异显著，下同
2.5 重组表达蛋白PebC1对番茄抗灰霉病的诱导作用
用不同浓度的重组表达蛋白喷雾处理的番茄幼
苗，病叶率和病情指数均极明显地低于对照，对灰
霉病的诱抗效果达到 34.06%-52.44%，其中以 10μg/
mL 的重组表达蛋白对番茄的诱抗效果最好（表 2）。
说明重组表达蛋白 PebC1 能够诱导番茄对灰霉病的
M. 蛋白分子量标准 ；1. 空载体 ；2. 加 IPTG 诱导培养 8 h ；
3. 加 IPTG 诱导培养 4 h
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期126
抗性。
2.6 重组表达蛋白PebC1对小麦抗旱性的影响
用不同浓度的重组表达蛋白处理小麦种子，在
小麦生长 3 周时进行干旱胁迫，复水后，经重组蛋
白处理的小麦幼苗存活率和抗旱综合系数均明显高
于对照，叶片抗衰度除 20 μg/mL 的处理与对照无显
著差异外，其它处理也均明显高于对照（表 3）。说
明重组表达蛋白 PebC1 能够增强小麦的抗旱性。
表 3 表达蛋白对小麦抗旱性的影响
表达蛋白浓度（μg/mL） 叶片抗衰度（%） 幼苗存活率（%） 抗旱综合系数
0 16.67±8.81 b B 13.89±9.35 b B 15.28±8.90 b B
2.5 66.67±6.67 a A 63.08±4.69 a A 64.88±5.50 a A
5 53.33±3.33 a AB 51.67±3.33 a A 54.17±3.33 a A
10 63.33±3.33 a A 55.08±4.88 a A 59.21±3.96 a A
20 43.33±8.82 ab AB 41.11±4.75 a AB 43.89±6.74 a AB
同列数据后不同大写字母表示 1% 水平下差异极显著，不同小写字母表示 5% 水平下差异显著
3 讨论
诱导抗性的发生在植物和病害种类上都很广
泛，而且大多数都是系统性的，也称为系统获得抗性（
systemic acquired resistance ， SAR）[11] 。植物感受激
发子的刺激后，植物细胞发生一系列的早期反应，
然后诱导植物抗性相关基因转录，蛋白与酶的表
达，表达产物参与对病原物侵染及致病作用的抵抗
活动 [12]。植物中大多数的抗性基因具有高效持久性，
且不易为病原菌所克服。而激发子可通过不同途径
激活这些抗性基因，使植物具有持久抗性与广谱抗
性 [13]。Lyon 和 Reglinski 等 [4,5] 认为用激发子预处理
后所有或大多数植物均具有抗性。本研究结果表明，
重组蛋白 PebC1 可以促进番茄幼苗的生长，既能诱
导单子叶植物小麦的抗旱性，又能诱导双子叶植物
番茄的抗病性，明显提高植物抗胁迫能力，是一种
具有广谱抗性的激发子。重组表达蛋白 PebC1 诱导
番茄和拟南芥对灰霉病的抗性反应并不完全一致，
这可能是由于不同植物对激发子的吸收、激发子对
植物的抗性诱导机理、植物抗性机理的变化或抗性
反应传递的差异而引起的。它作为持久的作物保护
剂应用于农业生产，可以减少化学肥料和农药使用
量，对于降低农产品中的农药残留和农业的可持续
发展均有重要意义。
4 结论
用不同浓度的重组表达蛋白喷雾处理番茄幼
苗，对灰霉病的诱抗效果达到 34.06%-52.44%，其
中以 10 μg/mL 的重组表达蛋白对番茄的诱抗效果最
好。而用同样的方法处理拟南芥幼苗，对灰霉病的
诱抗效果达到 15.6%-71.9%，且随着蛋白浓度的逐
渐升高，诱抗效果增加，其中以 20 μg/mL 的重组表
达蛋白对拟南芥的诱抗效果最好（结果另文发表）。
参 考 文 献
［1］ Wei ZM，Laby RJ，Zumoff CH，et a1．Harpin，elicitor of the
hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia
amylovora．Science，1992，257（5066）：85-88.
［2］ 左斌，邱德文，罗宽．植物激活蛋白对水稻秧苗生长及相关酶
活性的影响．科学技术与工程，2005，5（17）：1260-1262.
［3］ 何丹，刘俊，高学文，等．Harpin Xooc 蛋白在毕赤酵母中的分
泌表达及其生物活性检测．中国生物防治，2008，24（1）：
46-52.
［4］ Lyon GD，Reglinski T，Newton AC．Novel disease control
compounds:the potential to immunize plants against infection．Plant
Pathol，1995，44 ：407-427.
［5］ Reglinski T，Newton AC，Lyon GD．Assessment of the ability of
yeast-derived resistance elicitors to control barley powdery mildew in
the field．Journal of Plant Diseases and Protection，1994，101：1-10.
［6］ Calonnec A，Goyeau H，Vallavieille-Pope C．Effects of induced
resistance on infection efficiency and sporulation of Puccinia
striiformis on seedlings in varietal mixtures and on field epidemics in
pure stands．European J Plant Pathol，1996，102 ：733-741.
（下转第 156 页）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期156
of America，2004，101（23）:8569-8574.
［9］ 李丹，李储君，张汉道 . 超氧化物歧化酶（SOD）的研究与展望 . 中
国医药导刊，2009（4）:615-616.
［10］ 孙虎山，李光友 . 栉孔扇贝血淋巴中超氧化物歧化酶和过氧化
氢酶活性及其性质的研究 . 海洋与湖沼，2000，31（3）:259-264.
［11］ Ni DJ，Song LS，Gao Q，et al. The cDNA cloning and mRNA
expression of cytoplasmic Cu，Zn superoxide dismutase（SOD）
gene in scallop Chlamys farreri. Fish & Shellfish Immunology，
2007，23（5）:1032-1042.
［12］ Bao YB，Li L，Xu F，et al. Intracellular copper/zinc superoxide
dismutase from bay scallop Argopecten irradians: Its gene structure，
mRNA expression and recombinant protein. Fish & Shellfish
Immunology，2009，27（2）:210-220.
［13］ Boutet I，Tanguy A，Moraga D. Response of the Pacific oyster
Crassostrea gigas to hydrocarbon contamination under experimental
conditions. Gene，2004，329:147-157.
［14］ Li CH，Sun HI，Chen AQ，et al. Identification and characteriza
tion of an intracellular Cu，Zn-superoxide dismutase（icCu/Zn-
SOD）gene from clam Venerupis philippinarum. Fish & Shellfish
Immunology，2010，28（3）:499-503.
［15］ Lin YC，Vaseeharan B，Chen JC. Identification of the extracellular
copper-zinc superoxide dismutase（ecCuZnSOD）gene of the
mud crab Scylla serrata and its expression following β-glucan and
peptidoglycan injections. Molecular Immunology，2008，45
（5）:1346-1355.
［16］ 梁群超，郭剑英，唐兆新 . 自由基与细胞凋亡 . 上海畜牧兽医
通讯，2006（4）:41-43.
［17］ 唐兆新，王炫英 . 氧自由基在细胞凋亡中的作用 . 畜牧兽医杂
志，2007，16（3）:52-54.
（责任编辑 马鑫）
［7］ Zhang YH，Yang XF，Liu Q，et al．Purification of novel protein
elicitor from Botrytis cinerea that induces disease resistance and
drought tolerance in plants．Microbiological Research，2010 （165）：
142-151.
［8］ Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T．Molecular cloning [M]. 2nd
ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1992.
［9］ 李丽，邱德文，刘峥，等．植物激活蛋白对番茄抗病性的诱导
作用．中国生物防治，2005，21（4）：265-268.
［10］ 徐锋，杨勇，谢馥交，等．稻瘟菌激活蛋白对植物生长及其
生理活性的影响．华北农学报，2006, 21（5）：1-5.
［11］ 梁元存，刘爱新，商明清．激发子诱导植物抗性的作用机制．
植物生理学通讯，2001，37（5）：442-446.
［12］ 胡向阳．激发子诱导植物防卫反应过程中的信号分子［D］．
北京 ：中国科学院研究生院 , 2003.
［13］ Darvill AG，Albersheim P．Phytoalexins and their elicitors-a
defense against microbial infection in plants．Annu Rev Plant
Physiol，1984，35:243-275.
（责任编辑 李楠）
（上接第 126 页）