全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(8): 1345−1351 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2012AA101504)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 刘峥, E-mail: liuzheng@caas.cn
第一作者联系方式: E-mail: pxcjsw@126.com
Received(收稿日期): 2013-01-15; Accepted(接受日期): 2013-04-22; Published online(网络出版日期): 2013-05-21
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130521.1738.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01345
蛋白激发子 hrip1 基因在拟南芥中表达可提高植株的耐盐耐旱能力
彭学聪 杨秀芬 邱德文 曾洪梅 郭立华 刘 峥*
中国农业科学院植物保护研究所 / 农业部作物有害生物综合治理重点实验室, 北京 100081
摘 要: hrip1是从极细链格孢(Alternaria tenuissima)代谢物中分离的一种蛋白激发子。将蛋白激发子基因 hrip1转化
到拟南芥，对 5 个 T4代转基因拟南芥株系进行分子检测, 证明 hrip1 基因能够在拟南芥中转录和表达。转基因植株
对盐和干旱胁迫的抗性显著增强, 75 mmol L−1 NaCl和 50 mmol L−1甘露醇渗透胁迫 2 d, 转基因植株种子平均相对发
芽率为 32.1%和 77.9%, 分别比野生型的增加 3.72倍和 5.61倍; 150 mmol L−1 NaCl和 50 mmol L−1甘露醇处理拟南芥
幼苗 7 d后, 转基因植株平均相对根长为 81.79%和 93.25%, 分别是野生型的 1.53倍和 1.34倍。3周龄的转基因植株
在 250 mmol L−1 NaCl条件下胁迫 20 d, 平均存活率为 67%, 显著高于野生型(42%)(P<0.05); 干旱胁迫 25 d后, 复水
5 d转基因植株平均存活率为 72%, 而野生型仅为 44%。检测结果显示转基因植株叶片的抗氧化酶活性明显高于野生
型, 用 200 mmol L−1 NaCl和 200 mmol L−1甘露醇处理 24 h后, POD活性分别比野生型植株提高 1.56倍和 1.85倍, CAT
活性分别比野生型植株提高 1.64倍和 1.86倍。说明蛋白激发子 hrip1基因在拟南芥中的表达能够改善和提高植株的
耐盐抗旱能力。
关键词: 蛋白激发子; hrip1; 转基因拟南芥; 干旱胁迫; 盐胁迫
Overexpression of Elicitor Protein Encoding Gene hrip1 Improves Tolerance to
Drought and Salt Stresses in Arabidopsis
PENG Xue-Cong, YANG Xiu-Fen, QIU De-Wen, ZENG Hong-Mei, GUO Li-Hua, and LIU Zheng*
Key Laboratory of Pest Management in Crops, Ministry of Agriculture / Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100081, China
Abstract: hrip1 is a novel hypersensitive response-inducing protein secreted by necrotrophic fungus, Alternaria tenuissima. The
Arabidopsis thaliana transgenic plants overexpressing hrip1 showed increased tolerance to drought and salt stresses. Five trans-
formed lines of Arabidopsis were confirmed by PCR, RT-PCR and Western blot analysis. T4 progenies of transgenic Arabidopsis
lines and the wild-type plants were tested. The results showed the seed germination rate and root length of transgenic plants were
all significantly higher than those of wild type plants (P<0.05) under stress conditions. The average seed relative germination rate
of transgenic Arabidopsis lines was 32.1% and 77.9%, which were 3.72 and 5.61 times higher than those of wild-type plants in the
two days incubation with 50 mmol L−1 NaCl and 75 mmol L−1 mannitol, respectively. The average relative root length in trans-
genic plants was 81.79% and 93.25%, which were 1.53 and 1.34 times of that in wild type plants at 7th day on the medium con-
taining 150 mmol L−1 NaCl and 50 mmol L−1 mannitol, respectively. Stress tolerances were improved in the three-week old
soil-grown seedlings. Survival rate of transgenic plants and wild type plants was 67 % and 42 % under 250 mmol L−1 NaCl stress
for 20 days, respectively and 72 % of the transgenic plants and 44 % of wild-type plants were survived at 5th day re-watering after
dehydration stress for 25 days. Otherwise, POD and CAT activities were increased in transgenic plants compared with three wild
type plants under salt and drought stresses. At 24 h of treatment with 200 mmol L−1 NaCl and 200 mmol L−1 mannitol, the average
POD activity in transgenic seedlings was 1.56 and 1.85 times, CAT activity was 1.64 and 1.86 times higher than those in wild
plants, respectively. These data indicated that the expression of hrip1 gene positively regulates salt and drought tolerance in
transgenic Arabidopsis.
Keywords: Protein elicitor; hrip1; Transgenic Arabidopsis; Drought stress; Salt stress
1346 作 物 学 报 第 39卷

蛋白激发子是一类能够激活植物产生防卫反应
的生物源激发子, 其通过信号识别和转导, 启动植
物防卫反应, 激活植物的免疫系统, 调节植物生长
代谢, 进而提高植物抗逆能力, 促进植物生长[1-2]。
蛋白激发子不但能够提高植物抗病能力, 而且具有
改善植物的抗旱和耐盐的作用。来源于灰葡萄孢菌
中的蛋白激发子不仅有提高植物抗病功能, 同时能
显著提高小麦抗旱性 [3]; 赵明治等 [4]从极细链格孢
菌(Alternaria tenuissima)中分离纯化得到蛋白激发
子 PeaT1, 并用不同浓度的蛋白激发子 PeaT1 处理
水稻, 抗旱检测发现蛋白激发子处理的水稻存活率
明显高于清水和 BSA对照, 表明 PeaT1可以提高水
稻的抗旱性; 不仅体外施用蛋白激发子具有激发植
物防卫反应的功能, 而且将其的编码基因转入植物
后也能够提高植物抗病性。Yang 等[5]以蛋白激发子
MgSM1 转化拟南芥提高拟南芥对病原真菌和细菌
的抗性。作者实验室将 PemG1基因转入水稻提高水
稻对稻瘟病的抗性[6]。
hrip1 是作者实验室从极细链格孢菌(A. tenuis-
sima)中分离到的一种蛋白激发子 , 前期研究证明 ,
hrip1 蛋白渗入烟草叶片后能够引发烟草叶片的钙
离子流入、介质碱化、激活水杨酸途径的蛋白激酶
并且提高植物体内相关防卫基因的表达[7]。为了检
测 hrip1基因在植物中表达所产生的生物学功能, 本
文首次将激活蛋白基因 hrip1导入野生型拟南 芥,
获得了转基因拟南芥植株, 并在干旱和盐胁迫条件
下 , 探索其改善植株对非生物胁迫适应性的作用 ,
以期为培育蛋白激发子转基因作物提供借鉴和依
据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
哥伦比亚生态型(Col-0)野生型拟南芥、农杆菌
菌株 GV3101、植物表达载体 pCAMBIA1301由本实
验室保存。蛋白激发子 hrip1抗体由华大基因制备。
1.2 表达载体构建
以引物 5′-CATGCCATGGGCATGTACTTCTCG
AATATACTCCCGG-3′ (下画线部分为 Nco I酶切位
点 ) 和 5′-GGGTCACCTCAGCACTGAGGCAAGTT
ACAGACC-3′ (下画线部分为 BstE II酶切位点), 以
保存的 hrip1基因为模板扩增蛋白激发子 hrip1基因
的完整开放阅读框(open reading frame, ORF)序列。
选 pCAMBIA1301 载体序列上的 Nco I 和 BstE II
两个酶切位点 , 将该表达载体的 GUS 基因替换
为 hrip1 基因, 构建 35S::Hrip1 植物双元表达载体
(图 1)。
1.3 转 hrip1基因拟南芥株系的获得及筛选
采用花序浸染法获得转 hrip1 基因拟南芥植
株[8]。将 T0代种子表面消毒后均匀铺洒在含有 25 μg
mL−1潮霉素的 1/2 MS培养基上, 4℃均一化处理 3 d
后, 置 22℃光照(光周期为 16 h光照/8 h黑暗)生物
培养箱培养。选取培养 10~15 d 生长较快的幼苗移
栽到培养土中继续生长以收获种子, 筛选 3 代直到
得到纯合的转基因株系。
1.4 转基因拟南芥的分子鉴定
分别提取转 hrip1 拟南芥单株的 DNA 和 RNA,
以 DNA 和 cDNA 为模板, 用引物 5′-ATGTACTTC
TCGAATATACTCCCGG-3′和 5′-TCAGCACTGAGG
CAAGTTACAGACC-3′进行 PCR 扩增, 分别以野生
型拟南芥(WT)和 hrip1 PCR产物(CK)为阴性对照和
阳性对照。
将 T4代转基因拟南芥的叶片加液氮充分研磨后
立即转移到磷酸缓冲液 (0.025 mol L−1 K2HPO4,
0.025 mol L−1 KH2PO4, 2 mmol L−1 EDTA, pH 8.0),
充分混匀后 12 000×g, 4℃离心 10 min。将上清液冰
浴 1 h后 12 000×g, 4℃再离心 10 min。将提取的蛋
白用 12%SDS-PAGE 胶分离后转移到 PVDF 膜, 使
用华大基因公司制备的羊抗兔 hrip1基因的抗体, 参
考 Kobayashi等[9]方法进行免疫杂交。
1.5 转基因拟南芥幼苗抗旱性和耐盐性测定
参照 Dai等[10]方法将 5个转基因株系拟南芥 T4
代纯合种子和野生型拟南芥种子点播在含有 75
mmol L−1 NaCl和 50 mmol L−1甘露醇的 1/2×MS固
体培养基上, 以不含渗透剂的 1/2×MS 固体培养基


图1 植物表达载体pCAMBIA1301-CaMV35S-hrip1-Nos 的结构图
Fig. 1 Structure of plant expression vector pCAMBIA1301-CaMV35S-hrip1-Nos
第 8期 彭学聪等: 蛋白激发子 hrip1基因在拟南芥中表达可提高植株的耐盐耐旱能力 1347


上培养的种子为对照(CK), 每株系处理 60 粒种子,
测定种子发芽率。发芽率测定试验, 重复 3 次。每
株系测量 30株幼苗根长, 重复 3次。种子相对发芽
率(%)=(胁迫条件下发芽率/对照发芽率)×100%, 相
对根长 (%)=(胁迫条件下的根长 /对照条件下根
长)×100%。
1.6 转基因拟南芥成株抗旱性和耐盐性测定
将在 1/2×MS 培养基上培养 7 d 的转基因植株
(L1、L2、L3、L4和 L5)以及野生型幼苗移栽到装有
定量营养土的营养钵中(9.5 cm×9.5 cm), 每钵移植 4
株苗, 培养 3 周后, 在培养盘中分组进行胁迫处理,
每株系处理 3钵, 重复 3次。耐盐试验采用 250 mmol
L−1 NaCl 水溶液从培养盘底部浸透营养土, 每盘使
用 NaCl水溶液 1 L, 温室中继续培养至第 20 d, 统
计植株存活率; 抗旱试验在停止浇水培养 25 d模拟
干旱胁迫(温室控制相对湿度 75%), 然后复水继续
培养 5 d, 统计植株存活率。
1.7 转基因拟南芥相关防御酶活力测定
取干旱和盐胁迫处理 24 h长势一致的拟南芥植
株, 在植株相同部位取 10 片叶, 分别测定正常条件
(CK)和胁迫条件下(200 mmol L−1 NaCl和 200 mmol
L−1 甘露醇)不同转基因植株和野生型植株叶片过氧
化物酶 (peroxidase, POD)和过氧化氢酶 (catalase,
CAT)活性。采用愈创木酚法测定 POD活性, 紫外分
光光度法测定 CAT活性[11]。
1.8 数据统计分析
采用 SAS (Version 9.1)软件统计分析数据。
2 结果与分析
2.1 转 hrip1基因拟南芥的获得及分子检测
以构建好的植物表达载体转化拟南芥后收获 T0
代种子, 用含有 25 μg mL–1潮霉素 1/2MS培养基筛
选, 共获得 5 个阳性 T0代转 hrip1 拟南芥单株。经
Hrip1基因的 DNA和转录水平检测显示, 5个转基因
株系(L1、L2、L3、L4和 L5)有目标基因的扩增片段
(图 2-A), RT-PCR结果显示 Hrip1基因在 5个植株中
均正常转录表达(图 2-B)。对 T4 代转基因植株进行
Western blot分析, 在供试的 5个转基因株系中均检
测到特异的 17.56 kD 杂交带, 而在野生型(Wt)中没
有检测到杂交信号, 表明 hrip1已整合到拟南芥基因
组并正确表达(图 2-C)。
2.2 转 hrip1 基因拟南芥种子在胁迫条件下的相
对发芽率
转 hrip1 基因的拟南芥种子对干旱和盐胁迫耐
性显著提高。图 3和表 1显示, 在 75 mmol L−1 NaCl
和 50 mmol L−1甘露醇胁迫下, 所测试的 5个转基因
株系种子相对发芽率均显著高于野生型(P<0.005),
平均值分别为 32.1%和 77.9%, 是野生型的 3.72倍和
5.61倍, 表明 hrip1基因的转入显著改善了拟南芥种
子对干旱和盐的耐渗透能力。


图2 转Hrip1基因植株的PCR (A)、RT-PCR (B)和Western blot (C)分析
Fig. 2 Analysis of DNA-PCR (A), RT-PCR (B), and Western blot (C) of transgenic Arabidopsis plants
1348 作 物 学 报 第 39卷


图3 NaCl和甘露醇胁迫对转hrip1拟南芥种子和野生型种子发芽率的影响
Fig. 3 Effect of NaCl and mannitol stresses on germination of transgenic Arabidopsis and wild Arabidopsis

表1 NaCl和甘露醇胁迫下转hrip1拟南芥种子和野生型种子相对发芽率
Table 1 Relative germination rate of seeds in transgenic and wild type Arabidopsis under NaCl and mannitol stresses (%)
转基因株系 Transgenic line 处理
Treatment L1 L2 L3 L4 L5 Wt
75 mmol L−1 NaCl 37.89±7.19 a 30.75±6.41 a 29.74±6.59 a 28.41±7.89 a 33.50±12.03 a 8.61±7.07 b
50 mmol L−1 Mannitol 87.27±11.20 a 81.49±13.57 a 70.04±9.17 a 69.63±13.12 a 81.20±16.48 a 13.88±7.02 b
标以不同小写字母者在P<0.05水平上差异显著。Values followed by different letters are significantly different at P<0.05.

2.3 转 hrip1 基因拟南芥在胁迫条件下幼苗的相
对根长
在盐和干旱胁迫下 , 转基因拟南芥比野生型根
长明显增长。表 2 显示, 在胁迫条件下拟南芥植株
根长均显著低于非胁迫条件下的根长, 说明胁迫抑
制了拟南芥幼苗根系的生长。150 mmol L−1 NaCl以
及 75 mmol L−1甘露醇胁迫下, 5个转基因植株的平
均相对根长分别是 81.79%和 93.25%, 为野生型植株
的 1.53 倍和 1.34 倍, 说明导入蛋白激发子 hrip1 基
因显著提高拟南芥在盐和干旱胁迫条件下根的生长
速度。
2.4 转 hrip1基因拟南芥成株抗盐耐旱性
以 250 mmol L−1NaCl处理土壤第 10 d观察, 野
生型幼苗叶片和转基因幼苗叶片均开始变黄, 说明
NaCl 已经对植株生长产生毒害(图 4); 胁迫第 20 d
观察 , 大部分野生型植株死亡 ,植株存活率为
41.67%, 而转基因植株平均存活率为 67%, 不同株
系之间植株存活率差异不显著(P<0.05), 但均显著
高于野生型植株(表 3)。
成株幼苗干旱胁迫 25 d, 转基因植株和野生型
植株均出现萎蔫枯死症状。复水培养 2 d后, 转基因
植株的存活率分别为 72% (L1)、72% (L2)、71% (L3)、
71% (L4)和 72% (L5), 平均存活率为 72%, 显著高
于野生型 44% (P<0.05)(表 3), 说明导入蛋白激发子
Hrip1基因提高了拟南芥的耐旱能力。
2.5 盐、干旱胁迫条件下转基因植株叶片 POD
酶和 CAT酶活力
无论是正常还是胁迫条件(200 mmol L−1 NaCl和
200 mmol L−1 甘露醇)下, 转基因植株叶片 POD、
CAT活性都显著高于野生型植株(P<0.05)(图 5 和图
6), POD平均活性分别是野生型的 2.04、1.56和 1.85
倍, CAT平均活性分别是野生型的 1.76、1.64和 1.86
倍。说明 hrip1基因的转入, 明显提高了拟南芥植株
叶片 POD和 CAT酶活。

表2 NaCl及甘露醇胁迫下转hrip1拟南芥和野生型幼苗的相对根长
Table 2 Relative root length of transgenic and wild type Arabidopsis seedlings under NaCl and mannitol stresses (%)
转基因株系 Transgenic line 处理
Treatment L1 L2 L3 L4 L5 Wt
150 mmol L−1 NaCl 82.84±2.88 a 85.93±0.78 a 79.22±3.27 a 79.85±2.69 a 81.09±5.62 a 53.50±1.19 b
50 mmol L−1 Mannitol 93.19±1.80 a 95.18±1.55 a 92.39±4.10 a 92.71±2.64 a 92.77±3.80 a 69.58±2.50 b
标以不同小写字母者在P<0.05水平上差异显著。Values followed by different letters are significantly different at P<0.05.
第 8期 彭学聪等: 蛋白激发子 hrip1基因在拟南芥中表达可提高植株的耐盐耐旱能力 1349



图4 250 mmol L−1 NaCl胁迫处理转基因拟南芥幼苗的生长状况
Fig. 4 Growth of transgenic and wild type of Arabidopsis seedlings treated with 250 mmol L−1 NaCl

表3 盐胁迫和干旱后拟南芥幼苗的存活率
Table 3 Survival rate of transgenic and wild type Arabidopsis plands under salt and drought stress (%)
转基因株系 Transgenic line 处理
Treatment L1 L2 L3 L4 L5 Wt
200 mmol L−1 NaCl 63.89±9.62 a 66.67±8.33 a 63.89±12.73 a 69.44±12.73 a 69.44±4.81 a 41.67±8.33 b
干旱 Drought 72.22±4.81 a 72.22±4.81 a 70.83±11.02 a 70.83±12.50 a 72.22±12.73 a 44.44±4.81 b
标以不同小写字母者在P<0.05水平上差异显著。Values followed by different letters are significantly different at P<0.05.

图 5显示, 在 200 mmol L−1 NaCl胁迫下, 不同
转基因株系的 POD 活性有差异, 转基因植株 L1 和
L3最高, 分别为 38.84和 37.84活性单位, 显著高于
L4和 L5。200 mmol L−1甘露醇胁迫下, 不同转基因
株系之间叶片 POD活性之间差异不显著, 但均显著
高于野生型植株。图 6显示, 200 mmol L−1 NaCl和
200 mmol L−1甘露醇胁迫下, 转基因植株叶片 CAT
活性平均值分别为 10.12 和 13.66, 均显著高于野生
型拟南芥植株。
3 讨论
蛋白激发子通过植物受体识别来激发或诱导植物
产生免疫防御反应, 包括抗性基因转录激活、防御酶
活性提高以及抗性物质积累等。这些免疫防御反应使
植物对病虫害和逆境产生抗性或耐性, 从而减少植物
损害。研究证明, 来源于灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)
的蛋白激发子 PebC2, 能够显著提高小麦种子的发芽
率, 促进小麦幼苗生长, 增强小麦的抗旱性[12]。转基因
技术能够实现跨物种的基因交流和目标基因的定向转
移, 是培育良好综合性状植物品种的有效途径之一,
将蛋白激发子这一重要基因资源与植物转基因技术相
结合,能够提高植物的抗逆能力[13]。

hrip1 是作者实验室根据真菌与植物互作机制
分离的真菌分泌蛋白, 能够引发烟草叶片的钙离子
流入、介质碱化、激活水杨酸途径的蛋白激酶, 并
且提高植物体内相关防卫基因的表达 [7], 但其转基
因植物的功效尚不明确。本文作者将 hrip1导入拟南
芥后, 能够提高转基因拟南芥植株对灰霉病的抗性,
接种灰霉病菌 4 d后, 野生型植株存活率为 67%, 组
成型表达转基因植株存活率为 97%, 转基因株系抗
病性明显高于野生型植株, 有关研究结果将另文发
表。本研究结果显示, 在 75 mmol L−1 NaCl 和 50
mmol L−1甘露醇胁迫下, 转 hrip1基因植株种子发芽
率和幼苗根长明显高于野生型植株, 成株对盐和干
旱胁迫的耐性也显著增强 , 说明转入蛋白激发子
hrip1基因可以明显改善拟南芥的抗盐、抗旱能力。
干旱胁迫、盐胁迫是影响作物生长发育的主要
逆境因子 , 逆境胁迫使细胞内活性氧自由基增加 ,
遭受氧化危害。POD和 CAT等抗氧化酶是细胞抵御
活性氧伤害的保护酶系统的主要组成部分, 在清除
自由基和阻止自由基形成方面起重要作用。Kong
等[14]发现转激酶基因 ZmMKK4 拟南芥在 4℃以及
200 mmol L−1 NaCl胁迫后, 其 POD以及 CAT活性
均高于野生型。Ali等[15]发现转入海藻糖基因玉米干
1350 作 物 学 报 第 39卷


图5 NaCl和甘露醇胁迫下转hrip1拟南芥和野生型拟南芥植株叶片POD活性
Fig. 5 POD activity in transgenic and wild type Arabidopsis seedlings treated with NaCl and mannitol
标以不同小写字母者在P<0.05水平上差异显著。
Bars superscripted by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.


图6 NaCl和甘露醇胁迫下转hrip1拟南芥和野生型拟南芥植株叶片CAT活性
Fig. 6 CAT activity in transgenic and wild type Arabidopsis seedlings treated with NaCl and mannitol
标以不同小写字母者在P<0.05水平上差异显著。
Bars superscripted by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

旱胁迫后, POD、CAT 活性相对野生型显著提高。
Zhang等[16]将调节基因 SgNCED1导入烟草后, 逆境
胁迫条件下 , 显著提高了转基因烟草的抗氧化酶
POD、CAT活性。本研究显示, 200 mmol L−1 NaCl
和 200 mmol L−1甘露醇分别处理 24 h后, 拟南芥幼
苗叶片中过氧化物酶(POD)活性分别是野生型植株
的 1.56倍和 1.85倍; CAT活性分别是野生型植株的
1.64 倍和 1.86 倍。说明 hrip1 基因的转入明显提高
了拟南芥植株抗氧化酶活性, 从而使植株对盐分、
干旱胁迫表现了一定抗性。
抗旱分子机制研究发现, 一些基因的过量表达,
可以有效防止农作物细胞脱水、维持渗透平衡, 提
高农作物对水分的吸收和运输能力等 , 但植物抗
旱、耐盐机制不是单一基因调控的, 而是由复杂系
统调控的, 通过多个基因串联表达或共转化可能更
为有效。hrip1 基因将成为可利用的抗旱耐盐基因资
源, 但其作用机制有待进一步研究。
4 结论
hrip1 基因能够在转基因拟南芥中表达, 使 其
种子相对发芽率有较大提高, 并促进幼苗生根; 成
株受胁迫后 , 转基因拟南芥植株存活率显著高
于野生型 , 而且叶片的 POD、CAT 活性增加 , 说
明 hrip1 基因可以提高拟南芥对盐和干旱耐受能
力, 可能成为未来抗旱耐盐植物选育的可利用资源
之一。
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