全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(12): 2070−2076　 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2003CB114204); 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A210)
作者简介: 毛建军(1979–), 男, 博士, 主要从事蛋白激发子的纯化及水稻和烟草的遗传转化研究。Tel: 010-68919571-3509;
E-mail: maojianjun0615@126.com
*
通讯作者(Corresponding author): 邱德文, E-mail: dewenqiu@hotmail.com
Received(收稿日期): 2008-04-21; Accepted(接受日期): 2008-07-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.02070
蛋白激发子基因 pemG1转化三生烟及其对 TMV抗性的提高
毛建军 邱德文* 杨秀芬 曾洪梅 袁京京
(中国农业科学院植物保护研究所 / 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100081)
摘 要: 通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法, 将含有稻瘟菌蛋白激发子基因 pemG1 的植物表达
载体 pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs转化三生烟(Nicotiana tobacum cv. Samsun NN), 获得了转基因植株。用 PCR检
测抗卡那霉素烟苗确认阳性转化株, 用 Southern、Northern 和 Western 杂交进一步证实了 pemG1 基因的整合、转录
和表达。对 T2代转基因阳性株进行烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)接种试验。接种 5 d后发现, 与非转基因对照
相比, 表达 pemG1 的烟草叶片枯斑数量减少, 表明稻瘟菌蛋白激发子基因 pemG1 的表达提高了转基因烟草对 TMV
的抗性。
关键词: 蛋白激发子; pemG1; 烟草; 表达; 烟草花叶病毒
Expression of Protein Elicitor-Encoding Gene pemG1 in Tobacco (Nico-
tiana tobacum cv. Samsun NN) Plants and Enhancement of Resistance to
TMV
MAO Jian-Jun, QIU De-Wen*, YANG Xiu-Feng, ZENG Hong-Mei, and YUAN Jing-Jing
(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests / Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Bei-
jing 100081, China)
Abstract: Protein elicitors are important signal molecules that trigger plants disease resistance. Defence responses will be induced
once the elicitors are recognized by acceptors in plants. It is revealed that elicitor protein PemG1 from Magnaporthe grisea is able
to increase hydrogen peroxide content of tobacco suspension cells. To study PemG1’s functions in plants, pemG1 gene was trans-
ferred into tobacco in the study. For this, plant expression vector pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Oc harboring elicitor-encoding
gene pemG1 from Magnaporthe grisea was constructed. The maize ubiquitin promoter/octopine synthase terminator system and
kanamycin-resistant gene nptII (neomycin phosphotransfers II) were used for constitutive expression systems. The vector was
then introduced into Agrobacterium tumefaciens (strain AGL-1) by freeze-thaw method. Tobacco (Nicotiana tobacum cv. Samsun
NN) primary transformants were produced by leaf disc transformation. The kanamycin-resistant regenerated plants were con-
firmed to be electropositive by PCR. Integration and expression of the pemG1 gene were further confirmed by Southern blotting
and Western blotting, respectively. Then, transgenic tobacco plants of T2 generation were inoculated with Tobacco Mosaic Virus
(TMV) at two different virus concentration. In comparison with TMV-infected wild-type SNN plants, PemG1-expressed plants
displayed reduced hypersensitive-response lesions in both treatments. Furthermore, accumulation level of pemG1 steady-state
transcripts was examined at 24 h after inoculation. The results indicated that the reduction of lesions corresponded to the accumu-
lation of pemG1 steady-state transcripts as monitored by Northern blotting analysis. All these indicated that the expression of
pemG1 in tobacco plants improved the resistance to TMV.
Keywords: Protein elicitor; pemG1; Tobacco; Expression; TMV
第 12期 毛建军等: 蛋白激发子基因 pemG1转化三生烟及其对 TMV抗性的提高 2071


植物与病原菌之间的非亲和性互作常引发植物
体一系列的生理生化反应, 进一步诱发植物的抗性,
还能诱发防御反应的某种特定的微生物或植物分子
即称为激发子(elicitor)[1-3]。蛋白激发子是病原菌-植
物相互识别的重要信号分子, 被激发子诱导后, 相
关的植物基因可迅速表达。蛋白激发子与寄主的受
体蛋白结合, 经过一系列反应可诱导程序性细胞死
亡 (PCD)或过敏反应 (HR)和系统获得性抗性
(SAR)[2-4]。目前发现的植物蛋白激发子按照来源与
特性, 分为过敏蛋白 Harpin、激发素 elicitin、无毒
蛋白、病毒蛋白等[5-11]。蛋白激发子在体外不表现杀
菌作用, 仅通过启动植物体内的防御机制, 诱发系
统获得抗性在抗病性中发挥作用。在当前化学防治
造成严重生态恶化、抗病育种无法使抗性稳定的情
况下, 利用蛋白激发子可能成为农业生态系统中病
害控制的新思路[12-15]。有关蛋白激发子对植物抗病
反应的诱导, 已在拟南芥、烟草、黄瓜等多种植物
中得到广泛研究[1-3]。
邱德文等 [14-15]从多种病原真菌如稻瘟菌
(Magnaporthe grisea)、交链孢菌(Alternaria spp.)、纹
枯病菌 (Rhizoctonia solani)、黄曲霉菌 (Aspergillus
spp.)、葡萄孢菌(Botrytis spp.)、青霉菌(Penicillium
spp.)、木霉菌(Trichoderma spp.)等分离到一系列的
蛋白激发子。来源于稻瘟菌的蛋白激发子基因
pemG1编码的 PemG1蛋白激发子可明显提高丝瓜、
番茄等发芽率 , 促进种子萌发和幼苗生长。经
PemG1 处理水稻后, 控制稻瘟菌效果达 50.68%, 抗
旱综合指数也从 55提高到 92, 植物的纤维素酶和醇
脱氢酶活性增强 , 过氧化氢和脯氨酸的含量提
高[16]。
邵敏等[17]将来自水稻白叶枯病菌(Xanthomonas
oryzae pv. oryzae)的 hrfAXoo基因转化粳稻 R109, 转
基因水稻的 T0, T1和 T2代对水稻白叶枯病均有较好
的抗性, 在转基因系中水稻白叶枯病菌的生长明显
受到抑制。孟凡宏等[18]将 hrfAXoo基因转化烟草, 转
基因烟草植株也表现出对烟草花叶病毒(TMV)的抗
性。说明通过蛋白激发子基因的表达来提高作物的
抗病性是可行的, 目前关于其他蛋白激发子的转基
因报道很少。本研究通过根癌农杆菌介导转化法 ,
以稻瘟菌蛋白激发子基因 pemG1 转化三生烟, 用分
子生物学方法验证了外源基因在受体烟草基因组中
的整合、转录和表达。接种 TMV检测了转基因烟草
植株的抗性情况。
1 材料与方法
1.1 植物材料、载体及菌种
用于农杆菌转化的的烟草为三生烟 (Nicotiana
tobacum cv. Samsun NN)。所用的农杆菌菌株 AGL-1
和植物双元表达载体 pCAMBIA2300-Ubi-Ocs 由中
国科学院遗传与发育生物学研究所储成才研究员惠
赠。pCAMBIA2300-Ubi-Ocs 含卡那霉素抗性基因
NptII、启动外源基因表达的 Ubiquitin启动子和来自
章鱼碱合成酶基因的终止信号。目的基因 pemG1由
中国农业科学院植物保护研究所邱德文实验室从
Magnaporthe grisea 克隆得到 (GenBank 登录号 :
EF062504), 其编码蛋白能促进作物生长, 增强抗逆
性 [16]。构建了植物双元表达载体 pCAMBIA2300-
Ubi-pemG1-Ocs(图 1)。

图 1 植物表达载体 pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs的结构图
Fig. 1 Structure of plant expression vector pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs

1.2 酶和主要生化试剂
载体构建所用的内切酶和连接酶购自宝生物工
程有限公司, PCR 试剂购自北京全式金生物技术有
限公司, 用于 Southern blotting 和 Northern blotting
的地高辛试剂盒购自罗氏公司 (Roche), 用于
Western blotting 的二抗购自北京鼎国生物技术有限
责任公司。其他为国产分析纯试剂。
1.3 烟草的遗传转化和转基因植株的再生
先将健康烟草叶片用 0.1%升汞灭菌, 用打孔器打
孔得到叶盘用于转化。按文献[19~23]中的方法, 适当
修改后通过根癌农杆菌介导转化获得再生植株。
1.4 转化株的 DNA检测
用 CTAB 法从转化的烟草 T0、T1和 T2代的幼
嫩叶片中提取 DNA, 进行 PCR 检测。用 primer 1
2072 作 物 学 报 第 34卷

(5′-ACCCTGTTGTTTGGTGTTACTT-3′)和 primer 2
(5′-GGCGTCTCGCATATCTCAT-3′)扩增 pemG1整个
编码区, 产物 1 168 bp。反应体系含 10 μL PCR Mix,
0.5 μmol L−1引物, 1 mg L−1 模板 DNA, 加去离子水
至 20 μL。扩增条件为 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 57.8℃
30 s, 72℃ 1 min; 35个循环; 72℃ 5 min。用 primer 3
(5′-AGTCTAACGGACACCAAC-3′) 和 primer 4
(5′-AAAGATGACCCGACAAAC-3′)扩增 ubiquitin启
动子区, 产物 723 bp。用同样的反应体系, 扩增条件
为 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 53.6℃ 30 s, 72℃ 1 min; 35
个循环; 72℃ 5 min。
对 T0代苗进行 Southern blotting 检测, 提取 20
μg总 DNA, 经 EcoR I充分消化后用 1%琼脂糖凝胶
电泳, 转膜[24-25], 以地高辛标记的 pemG1 片段为探
针进行杂交, 以检测外源基因的整合情况, 操作按
DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter
kitI (Roche)说明书进行。
1.5 Western blotting分析
将 T2代烟草的叶片加液氮充分研磨后立即转移
到磷酸缓冲液(0.025 mol L−1 K2HPO4, 0.025 mol L−1
KH2PO4, 2 mmol L−1 EDTA, pH 8.0), 充分混匀后
13 200×g, 4℃离心 10 min。将上清液冰浴 1 h 后
13 200×g, 4℃再离心 10 min。参考 Amero等[26]方法
制备抗体。将 20 μg 提取的蛋白用 12%SDS-PAGE
胶分离后转移到 PVDF 膜, 再参考 Kobayashi 等[23]
方法进行免疫杂交。
1.6 TMV抗性鉴定和 RNA检测
对 3个经过 Western杂交检测到 pemG1表达的
T2代株系进行 TMV 抗性鉴定。设 2 个接种量处理,
处理 1每叶接种 0.2 mg, 处理 2接种 0.5 mg, 每处理
重复 3 次。每个株系设 4 株作为重复, 每株接种中
部 3 片叶龄一致的叶片, 以野生型三生烟作对照。
烟苗种于温室内, 每天光照 16 h, 保持湿度 85%, 白
天温度 32℃, 夜间温度 25℃, 生长 7周后按 Fischer
等[21]方法, 将病毒溶于 50 mmol L−1、pH 7.5的磷酸
钾缓冲液进行 TMV 接种。接种后烟草于 28℃诱发
过敏反应。接种 5 d 后调查叶片枯斑发生数量, 用
DPS 统计软件统计分析并计算枯斑抑制率。枯斑抑
制率=[(对照平均枯斑数－处理平均枯斑数)/对照平
均枯斑数]×100[27]。
参考 Invitrogen 公司的 TRIZOL 法, TMV 接种
24 h 后从烟叶中提取总 RNA。以地高辛标记的
pemG1片段为探针进行 Northern blotting分析, 参考
Strathmann 等[28]方法并结合 DIG High Prime DNA
Labeling and Detection Starter kitI (Roche)说明书进
行杂交, 每个样取 20 μg总 RNA用于分析。用伯乐
公司(Bio-Rad)的成像仪对杂交带成像, 用 Genesnap
软件(GeneSnap Image Acquisition Software)分析杂
交信号强度[21]。
2 结果与分析
2.1 转基因烟草植株的获得
对 100个叶盘进行愈伤组织诱导 , 大部分叶盘
在 25℃下暗培养 5 d后已开始膨大, 4周开始有浅绿
色半透明的愈伤组织形成(图 2-A), 但也有 12个叶
盘体积和颜色都没有发生变化。将愈伤组织用农杆
菌浸染后转移到共培养基共培养 2 d。再转移到分化
培养基中光照培养一个月, 期间有 71个叶盘逐渐呈
圆拱型, 并分化出抗卡那霉素的小芽, 逐渐分化成
苗, 一个叶盘可分化出一到多个棵小苗(图 2-B)。共
有 93棵小苗被转移到生根培养基 , 每天光照 16 h,
保持 28℃~30℃。小苗逐渐长大并长出根系(图 2-C),
再将苗移栽到土壤。共有 65棵抗卡那霉素的小苗长
出发达的根系并移栽成活(图 2-D)。

图 2 转基因烟草植株再生
Fig. 2 Regeneration of pemG1-transformed plantlets through culture
A: 愈伤组织诱导; B: 抗性苗长出; C: 抗性苗生根; D: 抗性苗移栽成活。
A: callus induction; B: growth of kanamycin-resistant shoots; C: rooting of kanamycin-resistant seedling;
D: kanamycin-resistant seedling transplanted to soil.
第 12期 毛建军等: 蛋白激发子基因 pemG1转化三生烟及其对 TMV抗性的提高 2073


2.2 转基因烟草的分子鉴定
2.2.1 PCR和 Southern blotting 分析 PCR结果
表明, primer 1和 primer 2, primer 3和 primer 4在 51
棵 T0代卡那霉素抗性烟苗中检测到目的条带, 两对
引物的检测结果一致, PCR 阳性率为 78.5%。在 T1
代转基因烟草中, PCR 阳性株和阴性株的比值符合
3 1∶ 的理论比率。随机挑选的 3个 PCR阳性株系用
于 Southern blotting, 均检测到目的基因的整合。其
中两个株系只检测到一个拷贝, 一个株系检测到两
个拷贝, 而在非转基因对照中没有检测到杂交条带,
说明 pemG1已整合进烟草基因组(图 3)。

图 3 转基因烟草植株的 PCR鉴定
Fig. 3 PCR identification of transgenic tobacco plants
A: primer 1和 primer 2的扩增结果; B: primer 3和 primer 4的扩
增结果; M: DL2000分子量标准; 1~4: 转化株;
5: 阳性对照; 6: 非转基因植株; 7: 空白对照。
A: amplification products resulting from primer 1 and primer 2;
B: amplification products resulting from primer 3 and primer 4;
M: DL2000 marker;
1–4: transformed plants; 5: positive control; 6: non-transformed
plants; 7: blank control.

2.2.2 Western blotting分析 在供试 3个转基因株
系中, 均检测到抗原和抗体特异的 40 kD的杂交带,
而在非转基因对照中没有检测到杂交信号。表明
pemG1已整合到烟草基因组并进行表达(图 5)。
2.3 TMV抗性鉴定和 pemG1基因 mRNA检测
在处理 1中, 转基因株系 2、5和 6所形成的枯
斑数均少于非转基因对照(图 6-A), 枯斑抑制率分别
为 37.4%、35.1%和 44.6%(表 1)。在处理 2中, 3个

图 4 转基因烟草的 Southern blotting分析
Fig. 4 Southern blotting of transgenic tobacco plants
CK: 非转基因对照; 2: 转基因株系 2; 5: 转基因株系 5; 6: 转基
因株系 6。
CK: non-transformed plants; 2: transgenic line 2; 5: transgenic line
5; 6: transgenic line 6.

图 5 转基因植株的 Western blotting分析
Fig. 5 Western blotting of transgenic plants
2: 转基因株系 2; 5: 转基因株系 5; 6: 转基因株系 6; CK: 非转
基因对照。
2: transgenic line 2; 5: transgenic line 5; 6: transgenic line 6; CK:
non-transformed plant.

转基因株系所形成的枯斑数也均少于非转基因对照
(图 6-B), 枯斑抑制率分别为 38.5%、38.3%和 46.2%
(表 1)。用 DPS软件对每叶枯斑数进行统计分析, 发
现在两个处理中, 3个转基因株系与非转基因对照的
差异均达到 1%极显著水平。当病毒接种量提高时, 3
个转基因株系的枯斑抑制率都略有提高。
Northern blotting表明, 在 3个转基因烟草株系
中均检测到预期的杂交条带, 而在非转基因对照中
没有检测到 pemG1基因 mRNA的积累(图 6-C)。用
伯乐公司 (Bio -Rad)的成像仪对杂交带成像 , 用

表 1 转基因株系对 TMV接种的反应
Table 1 Response of transgenic lines to TMV inoculation
病斑数量 Average number of lesions 病斑抑制率 Inhibition rate (%) 样本
Sample 处理 1 Treatment 1 处理 2 Treatment 2 处理 1 Treatment 1 处理 2 Treatment 2
非转化株 Non-transformed plants 48.3±6.2 118.6±14.6 0 0
转基因株系 2 Transgenic line 2 30.2±3.6 72.9±9.2 37.4 38.5
转基因株系 5 Transgenic line 5 31.3±4.9 73.2±10.4 35.1 38.3
转基因株系 6 Transgenic line 6 26.7±2.5 63.8±10.2 44.6 46.2
2074 作 物 学 报 第 34卷


图 6 转基因烟草株系对 TMV的抗性
Fig. 6 Resistance to TMV in transgenic lines
A: 处理 1中转基因株系和非转基因对照的症状比较; B: 处理 2
中转基因株系和非转基因对照的症状比较; C: 转基因株系的
Northern blotting分析; 2、5和 6: 转基因烟草株系叶; CK: 野生
型烟草株叶。
A: comparison of TMV-induced hypersensitive response (HR)
lesions obtained after the inoculation of transgenic lines and
wild-type plants (CK) in treatment 1; B: comparison of
TMV-induced hypersensitive response (HR) lesions obtained after
the inoculation of transgenic lines and wild-type plants (CK) in
treatment 2; C: Northern blotting analysis of transgenic lines.
Numbers indicate independent transformants. CK indicates
non-transformed wild-type plants.

Genesnap软件(GeneSnap Image Acquisition Software)
对杂交信号强度进行分析, 发现株系 2、5和 6的杂
交信号强度比约为 1.0 0.7 1.2∶ ∶ 。说明 pemG1基因
mRNA 积累的水平和枯斑抑制率的高低有明显的相
关性, 转基因植株内 pemG1基因 mRNA积累的水平
较高时, 所形成的枯斑数也相对较少, 枯斑抑制率
较高, 对 TMV 的抗性较强。但 pemG1 基因 mRNA
的积累水平和枯斑抑制率的高低并不是呈现严格的
正比例关系。
3 讨论
本研究说明通过蛋白激发子基因的表达来提高
作物的抗病性是可行的。关于通过外源基因的表达
来提高烟草对病毒的抗性, 前人做了较多的研究。如
烟草乙烯应答转录因子基因, 马铃薯 X病毒的 p12蛋
白基因和番茄斑驳病毒外壳蛋白基因等[21-23], 通过
不同的机制来提高对病毒的抗性。乙烯应答转录因
子能够影响乙烯的形成, 提高对病毒抗性的同时并
不激发病程相关蛋白的表达。番茄斑驳病毒外壳蛋
白通过对转基因 mRNA转录后加工的调控来提高抗
性。马铃薯 X 病毒(PVX)的 p12 蛋白的表达能诱发
烟草对 PVX 的专化抗性, 但抗性不是由 RNA 介导
的 , 而且外源基因不能使烟草产生系统获得抗性
(SAR)。在本试验中, pemG1基因 mRNA积累的水平
和对TMV抗性的高低存在明显的相关性, 虽然还没
有证实 PemG1的表达量和对 TMV的抗性也存在相
关性, 但笔者推测, 是 PemG1而不是 mRNA积累提
高了对 TMV的抗性。因为在以前的研究中发现, 经
PemG1 处理后, 作物的纤维素酶和醇脱氢酶活性增
强, 过氧化氢和脯氨酸的含量提高, 而这些酶和活
性物质在抗逆性方面都发挥重要作用。前人研究也
充分证明, 蛋白激发子能诱发非寄主对病原菌产生
防御反应, 原因是它能促进植物产生与防卫反应相
关的物质如乙稀、植物保卫素及诱导病程相关蛋白
(PR proteins)的表达[1-4]。更何况 PemG1是一个真菌
源的激发子, 它不是来自于病毒, 所以推测 PemG1
诱发病程相关蛋白的表达, 促进防卫反应相关物质
的产生, 从而提高了对 TMV抗性。
在 TMV接种试验中 , 当病毒的接种量增大时,
转基因烟草株系的枯斑抑制率更高。我们推测, 接
种量增大时 , 对转基因烟草造成的胁迫也增强 ,
PemG1的表达水平随之提高 , 从而表现出对 TMV
更强的抗性。很可能 PemG1的表达受到病原物侵染
的诱导, 但本研究中所使用的 ubiquitin 启动子是一
个组成型启动子, 要解答这个问题, 或许应该换用
诱导型启动子。
蛋白激发子能诱导非寄主植物发生广泛的防御
反应。稻瘟菌蛋白激发子 PemG1不仅能诱发非寄主
的抗病性, 而且能促进作物的生长, 提高抗逆性。是
否转 pemG1基因的烟草也会产生同样的效应呢？是
否将 pemG1基因转化其他作物也能产生对相关病害
的抗性呢？这些问题还需进一步的研讨。
激发子在植物病虫害生物防治中具有重要应用
前景。有关蛋白激发子对植物抗病反应的诱导, 已
在拟南芥、烟草、西红柿、大麦、小麦、黄瓜等许
多植物中得到广泛研究。1993 年美国 Eden 公司利
第 12期 毛建军等: 蛋白激发子基因 pemG1转化三生烟中及其对 TMV抗性的提高 2075


用 Harpin 基因产物开发出商品化农药 Messenger,
成功用于病虫害防治, 为激发子在农业生产中的应
用提供了成功的范例。本实验室从稻瘟菌
(Magnaporthe grisea)、灰霉菌(Botrytis cineres)、交
链孢菌(Alternaria spp.)等多种病原真菌中分离纯化
得到相似的蛋白激发子。它们不引起过敏反应, 具
有热稳定性, 能诱发非寄主产生防御反应, 促进作
物生长。激发子作为绿色农药, 可能成为农业系统
中病虫害控制的新思路, 并将成为 21世纪农药发展
的重要方向。在深入了解激发子诱导植物抗病性复
杂机制的基础上, 利用化学可诱导型启动子与信号
蛋白基因结合 , 组成融合基因 , 导入植物 , 实现基
因适时表达的人为控制, 培育出遗传稳定、抗多种
病原菌的作物品种, 是今后的研究方向。
4 结论
通过叶盘转化法以稻瘟菌蛋白激发子基因
pemG1 转化烟草, 获得了转基因植株, pemG1 的表
达提高了烟草对 TMV的抗性。以烟草为模式植物验
证了蛋白激发子基因 pemG1诱导植物抗病性的功能,
说明通过蛋白激发子基因的遗传转化来提高作物的
抗病性是可行的。
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