全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
刺五加 Eleutherococcus senticosus（Rupr.et Maxim）
Maxim 是我国传统的珍贵药用植物，具有抗肿瘤、
抗辐射、提高机体免疫力等多种药理作用和生理活
性，皂苷类化合物为其主要活性成分之一［1］。与其
他药用植物相似，刺五加中的皂苷含量普遍较低。
探明三萜类化合物的生物合成途径是利用代谢工程
直接合成或通过基因工程工业化生产三萜类化合物
的关键基础［2］。三萜类化合物的生物合成一般分
收稿日期 ：2013-09-18　
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（30701086），河北省自然科学基金项目（C2009001252），河北省自然科学基金 - 石药集团医药联合研究
基金项目（H2012401006），河北联合大学培育基金项目（GP201306）
作者简介 ：邢朝斌，男，副教授，研究方向 ：分子生药学、药用植物细胞工程 ；E-mail ：xzbheuu@126.com
刺五加细胞色素 P450 基因的克隆与表达分析
邢朝斌  吴鹏  李非非  刘岩  周秘  修乐山
（河北联合大学生命科学学院，唐山 063000）
摘 要 ： 根据已报道的人参、三七等植物的细胞色素 P450（Cytochrome P450，P450）基因的 cDNA 序列设计引物，利用
RT-PCR 法克隆刺五加 P450 基因的 cDNA 全长序列，并分析其在不同生长发育时期和器官中的表达情况。结果显示，克隆了全长
为 1 410 bp 的刺五加 P450 基因的 cDNA 序列，该基因编码 469 个氨基酸残基组成的蛋白质。GenBank 登录号为 KF498590，与人参、
三七的 P450 氨基酸序列一致性分别为 91.5% 和 90.4%。刺五加的 P450 基因在不同生长发育时期和器官中均有表达，但表达量具
有显著差异（P<0.05）。最大表达量出现在盛花期，为最低表达量（萌芽期）的 1.26 倍。各器官中，叶片的表达量最高，是最低量
幼茎的 1.49 倍。
关键词 ： 刺五加 细胞色素 P450 克隆 表达分析
Cloning and Expression Analysis of Cytochrome P450 Gene in
Eleutherococcus senticosus
Xing Zhaobin Wu Peng Li Feifei Liu Yan Zhou Mi Xiu Leshan
（College of Life Science，Hebei United University，Tangshan 063000）
Abstract:  In order to clone cytochrome P450（P450）in Eleutherococcus senticosus, the primers were designed according to cDNA of the
reported Panax ginseng and P. notoginseng. The full length cDNA of the E. senticosus P450 was cloned by RT-PCR, and analyzed the expression
of P450 in different growth periods and organs of E. senticosus. The results showed that the full length of P450 was 1 410 bp, encoded a protein
with 469 amino-acid residues, GenBank accession number KF498590. To compare the amino acid sequence of E.senticosus P450 with P. ginseng
and P. notoginseng, the amino acid homology was 91.5% and 90.4%. P450 expressed in different growth periods and organs of E. senticosus, and
the expression amount differed significantly（P<0.05）. The highest content of the expression showed up when full opening flower stage, which
was 1.26 times as much as that in the lowest at germination stage. The highest content of the expression was in the leaves which was 1.49 times as
much as that of the lowest in young stem.
Key words:  Eleutherococcus senticosus Cytochrome P450 Cloning Expression analysis
为，前体的合成、形成三萜皂苷骨架和后修饰过程
3 个阶段［3］。目前对三萜类合成的分子机理的研究
主要集中在前体合成和形成三萜皂苷骨架阶段，而
对决定三萜皂苷种类起主要作用的三萜碳环的复杂
修饰过程研究较少［4］。细胞色素 P450（cytochrome
P450，P450）是三萜皂苷生物合成后修饰过程中的
一个关键酶，该酶含有血红素配基，是植物中最大
的一个超基因家族，其不同家族成员参与了多种植
2014年第1期 113邢朝斌等 ：刺五加细胞色素 P450 基因的克隆与表达分析
物的次生代谢途径［5］。目前仅见少数几个参与三萜
皂苷生物合成的 P450 基因的报道［4］。因此克隆刺
五加 P450 基因的全长序列，并分析其在不同生长发
育时期、不同器官中的表达规律，对深入研究 P450
基因在刺五加皂苷生物合成中的作用机制和表达调
控具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 供试刺五加采自黑龙江省鸡西市，
经河北联合大学生命科学学院邢朝斌副教授鉴定。
分别以 4-9 月的叶和 8 月的根、茎、叶片和叶柄（编
号为 1-10）为提取总 RNA 的试材。
1.1.2 试剂 RevertAidTM First strand cDNA synthesis
Kit 购自 Thermo 公司。质粒小提试剂盒和琼脂糖凝
胶 DNA 回收试剂盒购自 Biomiga 公司。TOP10 感受
态细胞、PGM-T 克隆试剂盒和植物总 RNA 提取试剂
盒购自天根生化科技（北京）有限公司。Taq DNA
聚 合 酶 和 LA Taq DNA 聚 合 酶 购 自 TaKaRa 公 司。
X-Gal、IPTG、dNTPs、异硫氰酸胍购自北京拜尔迪
生物技术有限公司。引物由生工生物工程（上海）
股份有限公司合成，PAGE 纯化。
1.2 方法
1.2.1 刺 五 加 总 RNA 的 提 取 与 P450 基 因 的 获
得 根据植物总 RNA 提取试剂盒的说明，分别提取
1-10 号刺五加样本的总 RNA，并参照 RevertAidTM
First strand cDNA synthesis Kit 的 说 明， 以 2 μL 的
总 RNA 为模板，将上述样本分别逆转录为 cDNA。
利 用 根 据 GenBank 登 录 的 与 刺 五 加 同 科 的 人 参
（JX036031）、三七（GU997670）的 P450 基因序列
设计的上游引物 P4501S1 ：5- ATGGATCTCTTTATC-
TCATC -3 和下游引物 P4501X1 ：5- ATGGATCTCT-
TTATCTCATC -3， 以 逆 转 录 获 得 的 刺 五 加 叶 片
cDNA 为模板，PCR 扩增刺五加 P450 基因的 cDNA
序列。反应体系 50 μL，其中上下游引物各 1 μL，
10×LA Taq Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，模板
cDNA 2 μL，LA Taq DNA 聚 合 酶 0.6 μL， 补 ddH2O
至 50 μL。反应条件为 ：预变性 95℃、3 min ；变性
94℃、30 s；退火 50℃、30 s；延伸 72℃、1 min 40 s。
35 个循环后 72℃补充延伸 10 min。扩增产物经 1.5%
琼脂糖凝胶电泳、回收、克隆入 PGM-T 质粒载体，
转化大肠杆菌 TOP10 后，送 Invitrogen 公司测序。
1.2.2 刺五加 P450 基因的生物信息学分析 参照
邢 朝 斌 等［6］ 的 方 法， 利 用 MotifScan、ProtParam、
ProtScale、SOPMA 和 TMHMM 2.0 等在线软件进行生
物信息学分析。使用 MEGA 5.21 软件中的 Neighbor-
Joining 法构建系统发育树。
1.2.3 刺五加 P450 基因的表达分析 以逆转录获
得的 1-10 号的刺五加 cDNA 为模板，参照文献［6］
的方法，利用预计扩增 P450 基因长度为 139 bp 的
上游引物 P450RTS ：5- TGGGTATCCAAAGAAGCA-
GG-3，下游引物 P450RTX ：5-CAGCCAAGCCGAG-
TAGAGC -3，和预计扩增刺五加 GAPDH 基因长度
为 134 bp 的引物 RGS 和 RGX［6］，进行表达量分析。
2 结果
2.1 刺五加P450基因的克隆与鉴定
利 用 引 物 P4501S1 和 P4501X1，RT-PCR 扩 增
刺五加的 cDNA，测序获得长 1 410 bp 的片段（图 1），
与预期长度相符。将扩增片段重组入 PGM-T Vector
后，PCR 扩增产物的大小与刺五加总 RNA 的 RT-
PCR 产物大小相等。
M 1 M 2
2 000
1 000
bp
750
500
250
100
1 ：P450 基因 RT-PCR 产物 ；2 ：含 P450 基因质粒的 PCR 验证 ；
M ：DL 2000 marker
图 1 刺五加 P450 基因的克隆
2.2 刺五加P450基因的生物信息学分析
测 序 结 果 表 明， 所 获 得 的 刺 五 加 P450 基 因
cDNA 的长度为 1 410 bp，上游为起始密码子 ATG，
下游为终止密码子 TAA，推测其编码 469 个氨基酸
残基组成的蛋白质，GenBank 登录号为 KF498590。
预测的蛋白质分子质量为 53.083 kD，理论等电点（pI）
为 8.62。
通 过 NCBI 的 BLAST 比 对 发 现， 刺 五 加 P450
蛋白与已知的蛋白质结构功能数据库中其他物种的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期114
P450 具有相似的结构功能域。刺五加 P450 的 409-
418 位的氨基酸［FGGGPRMCPG］为 P450 家族的典
型保守结构域，27-466 位的氨基酸为 P450 的标志
性序列。通过 TMHMM 软件分析得知，刺五加 P450
蛋白的 5-21 和 276-292 位氨基酸处存在跨膜螺旋，
定位于线粒体。运用 SOPMA 软件预测刺五加 P450
蛋白的二级结构的结果表明，该蛋白含有 222 个 α
螺旋，占 47.33% ；61 个延伸链，占 13.01% ；18 个
β 折叠，占 3.84% ；168 个无规则蜷曲，占 35.82%。
2.3 P450的系统进化分析
利用 MEGA 软件，将 GenBank 中登载的 12 个
物种的 P450 蛋白与刺五加的 P450 蛋白进行聚类分
析，构建 P450 蛋白的系统进化树（图 2）。刺五加
与同为五加科的人参、三七和西洋参的亲缘关系最
近，首先聚为一支，可信度达 100%，之后与其他双
子叶植物聚为一个大的分支，单子叶植物和裸子植
物单独聚为一个分支，之后与人类聚在一起。
在较高水平。其中盛花期（6 月 26 日）的表达量最
高，是最低表达量萌芽期的 1.26 倍，但盛花期、果
实快速生长期（7 月 26 日）、果实基本成熟期（8 月
26 日）和叶片衰老期的表达量间差异未达显著水平。
刺五加的 P450 基因在叶片、叶柄、幼茎和根
中均有表达，但表达量具有显著差异（P<0.05）（图
3）。叶片中的表达量最高，叶柄次之，分别为最低
表达量（幼茎）的 1.49 和 1.24 倍，幼茎和根中的表
达量间差异不显著。
100
66
100
100
98
99
89
86
81
100
0.1
Ricinus communis (XP_002528002)
Vitis vinifera (XP_002280969)
Theobroma cacao (EOY26242)
Salvia miltiorrhiza (AGN04219)
Glycine max (XP_003530525)
Eleutherococcus senticosus(KF498591)
Panax notoginseng (AED99872)
Panax ginseng (AFO63031)
Panax quinquefolius (AGC31652)
Picea sitchensis (AAX07436)
Zea mays (DAA62930)
Brachypodium distachyon (XP_003563018)
Homo sapiens (AAQ21380)
图 2 P450 氨基酸序列系统发育树
2.4 刺五加P450基因的表达分析
刺五加 P450 基因在不同生长发育时期和器官
中的表达量变化如图 3 所示。自萌芽后的整个生
长期中，P450 基因均有表达，但表达量差异显著
（P<0.05）。在整个生长期中，P450 的表达呈现先低
后高的变化趋势。萌芽期（4 月 26 日）的表达量最
低，之后显著升高，进入盛花期（6 月 26 日）至叶
片衰老期（9 月 26 日）后，P450 的表达量始终维持
⭏䮯ਁ㛢ᰦᵏ
⴨ሩ
㺘䗮
䟿
ಘᇈ
P450
GAPDH
c
1.5
1.0
0.5
0.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
b a a a a
a
b
c c
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 ：萌芽期 ；2 ：叶片完全展开期 ；3 ：盛花期 ；4 ：果实快速生长期 ；
5 ：果实基本成熟期 ；6 ：叶片衰老期 ；7 ：叶片 ；8 ：叶柄 ；9 ：幼茎 ；
10 ：根 ；不同小写字母代表不同生长发育时期和不同器官间分别进
行比较差异显著（P<0.05）
图 3 刺五加不同生长发育时期及器官中 P450 基因的表达
变化
3 讨论
细胞色素 P450 基因是一个古老的超基因家族，
其编码蛋白为植物中最大的酶蛋白家族，在植物体
内担当着重要的功能［7］。在所有已知结构的 P450
中都存在一个保守的血红素结合域，含有保守的
FxxGxRxCxG 序列，该序列是鉴定 P450 的主要特征，
其中的半胱氨酸（C）是亚铁血红素的第 5 个轴配体，
在所有的 P450 中完全保守［7，8］。本试验所克隆出的
刺五加 P450 基因的编码蛋白 409-418 位的氨基酸
为［FGGGPRMCPG］，与上述特征完全相符。氨基
酸序列比对的结果显示，刺五加 P450 的氨基酸序列
与人参（Panax ginseng）、三七（P. notoginseng）、西
洋参（P. quinquefolius）和丹参（Salvia miltiorrhiza）
的一致性分别达到 91.5%、90.4%、89.3% 和 70.6%，
依 据“2 个 P450 的 氨 基 酸 序 列 一 致 性 如 果 大 于
2014年第1期 115邢朝斌等 ：刺五加细胞色素 P450 基因的克隆与表达分析
55%，则它们属于同一个亚家族”的原则［7］，初步
判定刺五加的 P450 属于 P450 家族中调控三萜皂苷
类化合物形成的 CPY85 亚家族［9-11］。同时，依据
P450 的氨基酸序列进行的系统进化分析结果也与传
统的分类结果相一致。
刺五加 P450 基因在不同生长发育时期和器官
中表达量的分析结果表明，刺五加的 P450 基因在不
同生长发育时期和叶片、叶柄、幼茎和根中均有表达，
其表达量随着生长发育的进行逐渐上升，其中，盛
花期的叶中的表达量最高。这与甘草［12］和蒺藜苜
蓿［13］P450 基因的表达特点相似。所不同的是甘草
和蒺藜苜蓿的 P450 恒定高表达于根器官中，而刺五
加中则为叶片中表达量最高，这与甘草［12］和蒺藜
苜蓿［13］中皂苷类化合物主要存在于根，刺五加则
主要存在于叶片中［1］的特点相符，这预示着 P450
在刺五加三萜皂苷类化合物的次生代谢过程中发挥
着重要的作用。
4 结论
刺五加 P450 基因编码的蛋白与五加科其他植
物 P450 的氨基酸序列一致性最高，并具有 P450 基
因家族的典型特征序列。
刺五加的 P450 基因在不同生长发育时期和器
官中均有表达，但表达量具有显著差异。
参 考 文 献
［1］ 涂正伟 , 周渭渭 , 单淇 , 等 . 刺五加的研究进展［J］. 药物评价
研究 , 2011, 34（3）：213-216.
［2］ 赵云生 , 万德光 , 陈新 , 等 . 五环三萜皂苷生物合成与调控的研
究进展［J］. 中草药 , 2009, 40（2）：327-330.
［3］ 隋春 , 徐洁森 , 赵立子 , 等 . 北柴胡 UGT 基因的克隆及其过量
表达和 RNAi 转基因载体的构建［J］. 中国中药杂志 , 2012（5）：
558-563.
［4］ 徐洁森 , 魏建和 , 赵立子 , 等 . 北柴胡细胞色素 P450 酶基因的
克隆及其植物过量表达载体的构建［J］. 生物技术通讯 , 2012,
23（4）：537-541.
［5］ Brazier M, Cole DJ, Edwards R. O-Glucosyltransferase activities
toward phenolic natural products and xenobiotics in wheat and
herbicide-resistant and herbicide-susceptible black-grass（Alopecurus
myosuroides）［J］. Phytochemistry, 2002, 59（2）：149-156.
［6］ 邢朝斌 , 龙月红 , 何闪 , 等 . 刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克
隆、 生物信息学及表达分析［J］. 中国中药杂志 , 2012, 37（12）：
1725-1730.
［7］ 贺丽虹 , 赵淑娟 , 胡之璧 . 植物细胞色素 P450 基因与功能研究
进展［J］. 药物生物技术 , 2008, 15（2）：142-147.
［8］ Rupasinghe S, Schuler M. Homology modeling of plant cytochrome
P450s［J］. Phytochem Rev, 2006, 5（2-3）：473-505.
［9］ Han JY, Hwang HS, Choi SW, et al. Cytochrome P450 CYP716A53v2
catalyzes the formation of protopanaxatriol from protopanaxadiol
during ginsenoside biosynthesis in Panax ginseng［J］. Plant Cell
Physiol, 2012, 53（9）：1535-1545.
［10］ Luo H, Sun C, Sun Y, et al. Analysis of the transcriptome of Panax
notoginseng root uncovers putative triterpene saponin-biosynthetic
genes and genetic markers［J］. BMC Genomics, 2011, 12（S5）：
1-15.
［11］ Sui C, Zhang J, Wei J, et al. Transcriptome analysis of Bupleurum
chinense focusing on genes involved in the biosynthesis of
saikosaponins［J］. BMC Genomics, 2011, 12 ：539.
［12］ Seki H, Sawai S, Ohyama K, et al. Triterpene functional genomics
in licorice for identification of CYP72A154 involved in the
biosynthesis of glycyrrhizin［J］. Plant Cell, 2011, 23（11）：
4112-4123.
［13］ Carelli M, Biazzi E, Panara F, et al. Medicago truncatula
CYP716A12 is a multifunctional oxidase involved in the
biosynthesis of hemolytic saponins［J］. Plant Cell, 2011, 23（8）：
3070-3081.
（责任编辑 李楠）