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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):109-114
Boyer 等［1］指出环境问题将成为影响作物产量
的一个重要因素。虽然无法精确计算出环境因素对
农作物产量影响的具体数值，但可耕地面积的逐渐
减少势必导致粮食作物产量的持续下滑［2，3］。2007 年，
收稿日期 ：2015-02-28
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31201144，31271746），吉林省发改委项目（JF2012C002-04），吉林农业大学国家大学生创新创业训练
计划项目（201410193036）
作者简介 ：王法微，男，助理研究员，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：fw-1980@163.com
通讯作者 ：李海燕，女，教授，博士生导师，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：hyli99@163.com
山葡萄 CBF 基因表达载体构建及对拟南芥根生长的
影响
王法微1  董金晔2  李晓薇1  刘洋2  吴学彦2  王南1   
董园园1  陈欢2  李海燕1，2
（1. 吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，长春 130118 ；2. 吉林农业大学生命科学学院，长春 130118）
摘 要 ： 为了研究山葡萄 CBF 基因调节植物对盐胁迫的应答机理，分别构建了山葡萄 VaCBF1、VaCBF2 和 VaCBF3 的植物
过表达载体。经酶切及琼脂糖电泳检测证实 3 个基因均插入到 pBASTA 中，表明表达载体构建成功。然后，分别将 3 个植物过表
达载体转入农杆菌 EHA105 中，并通过浸花法浸染拟南芥。利用除草剂筛选获得 3 个基因的拟南芥过表达株系。最后，对野生型
拟南芥与转基因拟南芥进行盐胁迫处理，发现 OE-CBF2 转基因植株的主根伸长长度显著长于其它植株，3 个转基因株系的侧根长
度也明显长于野生型植株。上述结果表明山葡萄 CBF 基因可能在植物盐胁迫中对根部生长发育起到非常重要的调控作用。
关键词 ： 山葡萄 ；CBF 基因 ；表达载体 ；根生长
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.019
The Construction of Expression Vector of Gene CBF from Vitis
amurensis and the Effects of It on the Root Growth of Arabidopsis
WANG Fa-wei1 DONG Jin-ye2 LI Xiao-wei1 LIU Yang2 WU Xue-yan2 WANG Nan1
DONG Yuan-yuan1 CHEN Huan2 LI Hai-yan1，2
（1. Ministry of Education Engineering Research Center of Bioreactor and Pharmaceutical Development，Jilin Agricultural University，
Changchun 130118 ；2. College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118）
Abstract: In order to investigate the response mechanism of CBF gene in the regulation of plant to the salt stress, the plant over-
expression vectors of VaCBF1, VaCBF2 and VaCBF3 from Vitis amurensis were constructed. The results by restriction enzyme digestion and
agarose gel electrophoresis showed that 3 genes were correctly inserted into pBASTA, indicating that the expression vectors were successfully
constructed. Then, 3 over-expressed vectors were transformed into Agrobacterimu tumefaciens EHA105, and Arabidopsis thaliana was leached
using floral dip method. The transgenic plants of A. thaliana with over-expression of 3 genes were screened by herbicide Basta. Furthermore, wild
and transgenic plants were treated with salt stress. The results revealed that the elongation length of primary root of OE-CBF2 transgenic plant
was longer than others, and the lateral roots in 3 genes transgenic plants were longer than wild ones. These results indicate that the CBF genes of V.
amurensis play the critical regulation role in the root development during salt stress.
Key words: Vitis amurensis ；CBF gene ；expression vector ；root growth
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1110
世界粮农组织统计出目前全球只有 3.5% 的土地未受
到环境因素影响［4］。这为人们敲响了警钟，在不久
的将来粮食问题可能又会成为社会亟待解决的主要
问题。为了降低环境因素对粮食产量的影响，选育
抗逆性强的优质作物新品种已经成为农业科研工作
者的主要目标。农作物新品种选育的方法主要为传
统遗传育种与基因工程育种。由于基因工程育种具
有目的性强，育种周期短，可克服远缘杂交不亲和
障碍等优点，该方法已经成为育种的主要手段。而
基因工程育种所需要的表达调控元件以及抗逆基因
的挖掘成为重中之重。
CBF（C-repeat binding factor，CBF） 转 录 因 子
是 AP2/EREBP 转录因子家族的一个亚家族，它是植
物调节逆境胁迫的重要转录因子之一［5］。CBF 能够
与启动子中一个 5 bp 大小的核心片段（CCGAC）相
结合，从而调控该基因的转录水平［6，7］。CBF 基因
的表达能够被多种非生物胁迫以及上游转录因子所
调控［8-10］。目前，多种植物 CBF 转录因子参与逆境
胁迫的分子机制已经被揭示，包括拟南芥［11］、水
稻［12］、玉米［13，14］、小麦［15，16］、大豆［17，18］和葡萄［19］等。
拟南芥 4 个 CBF 基因过表达后均能够激活下游靶基
因的表达，并能够提高植物的抗寒能力［20］。AtCBF2
基因的负调控作用能够对 AtCBF1 及 AtCBF3 起到适
当调节下游基因表达强度，从而适度的调节植物对
低温以及相关胁迫的应答［21］。目前，拟南芥 CBF
基因的信号转导网路已经十分清楚，大麦与番茄等
植物 CBF 基因在耐盐等信号转导中的作用机制也得
到了初步证实［22，23］。这些研究成果均说明 CBF 转
录因子在调节植物耐寒、耐盐等非生物胁迫过程中
起着重要的调控作用。
本研究以野生山葡萄为材料，在已经成功分离
了山葡萄 VaCBF1、VaCBF2 和 VaCBF3 的基础上［24］，
分别将 3 个基因构建到植物过表达载体中，利用浸
花法将目的基因转入拟南芥基因组中，并对野生型
拟南芥与转基因拟南芥进行盐胁迫处理，以探究其
在植物盐胁迫中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
实验所用转基因植物材料为哥伦比亚野生型拟
南 芥（Arabidopsis thaliana col-0）。 山 葡 萄 VaCBF1、
VaCBF2 和 VaCBF3 基 因（GenBank 登 录 号 ：DQ51-
7296、DQ517297 和 DQ517298）由本实验室克隆。农
杆菌 EHA105 和植物表达载体 pBASTA 由本实验室
保存。克隆载体 pMD18-T，限制性内切酶、T4 连接
酶、Ex Taq 聚合酶均购自大连宝生物工程有限公司。
凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自爱思进生物
技术（杭州）有限公司。PCR 引物（表 1）及基因
测序均由北京金唯智生物科技有限公司完成。
表 1 山葡萄 CBF 基因表达载体构建所用引物
引物名称 引物序列（5-3）
VaCBF1-F CGGAATTCATGGACTCGGACCACGAAG
VaCBF1-R GCTCTAGATTAATCATCATTCCACAAAG
VaCBF2-F CGGAATTCATGGACTTGGACCGTGAGT
VaCBF2-R GCTCTAGATTAAGGTAGGAAATCATGAA
VaCBF3-F CGGAATTCATGGAATCGGAGCGTGATC
VaCBF3-R GCTCTAGATTAATCATCATTCCACAA
注 ：加粗部分为保护碱基，下划线部分为酶切位点
1.2 方法
1.2.1 山葡萄 CBF 基因植物表达载体的构建 分别
以 VaCBF1、VaCBF2 和 VaCBF3 的克隆载体质粒为
模板，利用基因特异性引物进行 PCR 扩增。将 3 个
PCR 产物分别与表达载体 pBASTA 同时使用 EcoR I
与 Xba I 进行双酶切，回收目的基因与载体大片段
后，利用 T4 DNA 连接酶进行连接，并将连接产物
转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞。提取阳性菌液质
粒 DNA 并进行酶切鉴定，将阳性重组质粒分别命名
为 pB-CBF1、pB-CBF2 和 pB-CBF3。 将 3 个 重 组 质
粒送交北京金唯智生物科技有限公司进行测序。
1.2.2 表 达 载 体 向 农 杆 菌 中 的 转 化 将 农 杆 菌
EHA105 感受态细胞置于冰上缓慢融化，将重组质
粒 pB-CBF1、pB-CBF2 和 pB-CBF3 分别加入感受态
细胞中，冰浴 30 min。将离心管放置在液氮中冷冻
1 min，然后在 37℃水浴中温育 5 min。温育过后，
每个离心管中分别加入 1 mL 无抗生素的 YEP 培养
基，在 28℃摇床中振荡培养 2-4 h。将菌液离心浓
缩后涂于含有 50 mg/L 卡那霉素和 100 mg/L 利福平
的固体 YEP 培养基上，28℃培养 2-3 d，挑取单菌
落后进行 PCR 鉴定。
1.2.3 农杆菌介导的浸花法转化拟南芥 将野生型
2016,32(1) 111王法微等：山葡萄 CBF基因表达载体构建及对拟南芥根生长的影响
拟南芥播种于培养钵中，待拟南芥长至抽薹初期时
剪掉所有拟南芥的主茎。当周围的茎抽薹后除去已
经开的花准备浸染。同时准备农杆菌菌液，将农杆
菌离心沉淀后使用渗透缓冲液（5% 蔗糖，0.02%
SilwettL-77）将菌液 OD600 调至 0.9-1.0。将拟南芥花
序部分倒置于渗透缓冲液中浸泡 1-3 min，之后使用
保鲜膜密封后黑暗下平放 24 h，最后置于培养室中
正常培养。待种子成熟时收取种子，以备后续鉴定。
1.2.4 转基因拟南芥的筛选与单拷贝株系鉴定 将
4℃春化 2 d 后的 T0 代转基因拟南芥种子播种于培
养钵中，待长至四叶期时喷施 1% Basta，每隔 1 d
喷施 1 次，共计喷施 3 次。观察拟南芥幼苗生长情
况，始终保持绿色的为阳性转基因植株，慢慢枯萎
死亡的为非转基因植株。将阳性转基因植株移栽至
无 Basta 的培养钵中继续培养，并收获 T1 代转基因
拟南芥种子。将 T1 代转基因拟南芥种子播种于含有
1% Basta 的 MS 固体培养基中，每个株系播种约 100
棵。统计各株系死亡率后计算各个转基因株系是否
符合孟德尔遗传规律的分离比，从而鉴定单拷贝株
系。将单拷贝株系移栽后收取 T2 代拟南芥种子，准
备用于根系的生长发育实验。
1.2.5 转基因拟南芥的根系发育分析 将 WT 与
VaCBF1、VaCBF2 和 VaCBF3 的 T2 代转基因拟南芥
种子春化处理 2 d，经 70% 酒精消毒 30 min 后，点
播于 MS 固体培养基中。培养 7 d 后，分别将各个株
系植株移栽至含有 150 mmol/L NaCl 的 MS 固体培养
基中进行盐胁迫处理。处理 7 d 后观察各株系表型
变化，并分别统计主根伸长长度、侧根数以及侧根
长度。每个实验 3 次重复，并利用 SPSS 软件分析各
组数据差异的显著性（P<0.05）。
2 结果
2.1 山葡萄CBF基因植物表达载体的构建
提取表达载体 pB-CBF1、pB-CBF2 和 pB-CBF3
的 质 粒 DNA， 利 用 EcoR I 与 Xba I 进 行 双 酶 切 鉴
定，结果（图 1）显示 3 个质粒各切出一条约 756
bp、762 bp 与 720 bp 的特异条带。这证实山葡萄
VaCBF1、VaCBF2 和 VaCBF1 基因已经成功插入到
表达载体中。将 pB-CBF1、pB-CBF2 和 pB-CBF3 的
质粒 DNA 测序后证实，载体插入片段与目的基因序
M：分子量标准 DL2000；1，2：pB-CBF1 酶切产物；3，4：pB-CBF2 酶切产物；
5，6 ：pB-CBF3 酶切产物
图 1 表达载体酶切验证
M 1 2 3 4 5 6
2000
bp
750
250
列完全一致，未发现有碱基突变。
2.2 表达载体向农杆菌中的转化
分别挑取转化后 YEP 平板上的单菌落，接种于
5 mL 液体 YEP 培养基中摇菌。待菌液生长至 OD600
为 0.8 左右时各取 1 mL 菌液作为模板，利用基因特
异性引物（表 1）进行 PCR 验证阳性菌落。PCR 结
果（图 2）显示，3 种农杆菌中均含有转化的目的基
因，证实 VaCBF1、VaCBF2 和 VaCBF1 基因分别成
功转入农杆菌中。
M 1 2 3
2000
bp
1000
750
500
250
100
M ：分子量标准 DL2000 ；1-3 ：转 VaCBF1、VaCBF2 及 VaCBF3
农杆菌 PCR 产物
图 2 农杆菌转化子的 PCR 鉴定
2.3 转基因拟南芥的筛选及单拷贝株系鉴定
待 T0 代 转 基 因 拟 南 芥 生 长 至 四 叶 期 时 利 用
Basta 筛选阳性转基因植株，喷施 3 次 Basta 后非转
基因植株死亡，而转基因植株仍可以继续生长（图
3-A）。将阳性转基因植株移栽至正常土壤的营养钵
中继续生长，并收取该株系 T1 代种子。将 T1 代转
基因拟南芥进行春化后播种于含有 1% Basta 的 MS
固体培养基中进行再次筛选，并计算转基因植株死
亡率（图 3-B）。OE-CBF1、OE-CBF2 和 OE-CBF3 三
个转基因株系的分离比分别为 3.26∶1、3.51∶1 与
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1112
2.88∶1，基本符合孟德尔遗传定律，证实 3 个转基
因株系为单拷贝株系。
可能是在盐胁迫下 VaCBF2 转录因子基因能够激活
一系列盐应答基因的表达，增强了植物对盐胁迫的
抵抗能力，从而降低了盐胁迫对主根生长的影响。
A ：Basta 筛选转基因植株 ；B ：Basta 筛选单拷贝植株
图 3 转基因拟南芥的筛选（A）及单拷贝株系鉴定（B）
A B
2.4 转基因拟南芥主根生长发育分析
将 WT 与 3 个转基因株系 T2 代种子播种于 MS
固体培养基中生长，待生长至 7 d 时测量各个株系
的主根长度。结果（图 4）显示，WT 与 OE-CBF1
的主根长度相一致，而 OE-CBF2 与 OE-CBF3 的主
根长度要显著短于 WT 及 OE-CBF1。这说明在正常
生长情况下，VaCBF2 及 VaCBF3 的过表达在一定程
度上对拟南芥主根生长造成了抑制。
*
*
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
WT OE-CBF1 OE-CBF2 OE-CBF3
ѫṩ䮯ᓖ/cm
* 表示 P<0.05 ；** 表示 P<0.01，下同
图 4 转基因拟南芥主根生长状态分析
WT OE-CBF1
OE-CBF3OE-CBF2
B
A
**
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
WT OE-CBF1 OE-CBF2 OE-CBF3
ѫṩը䮯䮯ᓖ/cm
A ：WT 与转基因植株在盐胁迫下的表型分析 ；B ：盐胁迫下 WT 与转基因植
株主根伸长长度分析
图 5 盐胁迫下拟南芥表型（A）及主根伸长分析（B）
另外，在盐胁迫后，OE-CBF1 的侧根数量显著
多于其他 3 个株系（图 6-A）。这说明在盐胁迫条
件下 VaCBF1 可能对植物侧根数起着一定的调控作
用。 同 时，OE-CBF1、OE-CBF2 和 OE-CBF3 三 个
株系的侧根长度均显著长于 WT（图 6-B）。这说明
VaCBF1、VaCBF2 和 VaCBF3 在盐胁迫中对植物侧
根的伸长均起着重要调控作用。
3 讨论
植物在长期的进化过程中，逐渐形成了自身对
环境的适应机制，当植物受到外界刺激后能够通过
植物细胞内基因表达变化来实现和调节胁迫应答反
应。1997 年，Stockinger 等［6］在拟南芥中首先发现
2.5 转基因拟南盐胁迫下的根系发育分析
将 WT 与 3 个 转 基 因 株 系 T2 代 种 子 播 种 于
MS 固体培养基中，待生长至 7 d 后移栽至含有 150
mmol/L NaCl 的 MS 固体培养基中进行盐胁迫处理。
胁迫处理 8 d 后观察各个株系根系的生长状态，发
现 OE-CBF2 株系的主根长度显著长于其他 3 个株系
（图 5）。而 OE-CBF2 在正常生长情况下的主根长度
却显著短于 WT 植株（图 4），产生这种现象的原因
2016,32(1) 113王法微等：山葡萄 CBF基因表达载体构建及对拟南芥根生长的影响
拟南芥进行盐胁迫处理，结果发现 OE-CBF2 的主根
伸长长度显著长于其他植株。而番茄属的两个 CBF
基因（SlCBF1 与 ShCBF1）在拟南芥中过表达后，
在盐胁迫条件下转基因植株的根系生长发育明显优
于 WT［23，26］。Duan 等［27］ 报 道， 在 盐 胁 迫 下 植 物
侧根的生长处于停滞状态，直到生长条件恢复正常
后才能开始继续生长发育。而本研究中在盐处理后
OE-CBF1 的侧根数量明显多于 WT，而且 OE-CBF1、
OE-CBF2 和 OE-CBF3 的侧根长度均显著长于 WT，
表明 VaCBF1、VaCBF2 和 VaCBF3 的过表达在一定
程度上缓解了盐胁迫对植物根系生长发育的抑制作
用。说明山葡萄 CBF 基因可能通过调节植物根系发
育来调节植物对盐胁迫的应答。但本研究只局限于
植物根部发育的变化，该基因调控植物根系发育的
分子机制仍不清楚，还有待于进一步的研究来揭示。
4 结论
本 研 究 通 过 构 建 山 葡 萄 VaCBF1、VaCBF2 及
VaCBF3 基因的植物过表达载体，并分别将 3 个表达
载体转入拟南芥中，获得 3 个转基因株系 OE-CBF1、
OE-CBF2 与 OE-CBF3。对野生型拟南芥与转基因拟
南芥进行盐胁迫处理，发现 OE-CBF2 转基因植株的
主根伸长长度显著长于其它植株，3 个转基因株系
的侧根长度也明显长于野生型植株。
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**
****
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
WT OE-CBF1 OE-CBF2 OE-CBF3
חṩ䮯ᓖ/cm
*
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
B
A
WT OE-CBF1 OE-CBF2 OE-CBF3
חṩᮠ䟿/ἥ
A ：盐胁迫下 WT 与转基因植株侧根数量分析 ；B ：盐胁迫下 WT 与转
基因植株侧根长度分析
图 6 盐胁迫下 WT 与转基因拟南芥侧根生长状态分析
一个能够与 C 重复序列相结合的因子，即 CBF 转录
因子，并且命名为 AtCBF1。在正常生长条件下，拟
南芥 3 个 CBF 基因的过表达植株均表现出生长延迟
的现象［11］。将玉米 ZmCBF3 基因转入水稻中进行过
表达，在正常生长条件下也发现转基因植株的生长
情况受到了一定程度的抑制［25］。而本研究结果显示
OE-CBF2 与 OE-CBF3 在正常生长条件下的主根长度
均小于野生型植株。产生此现象的原因可能是由于
转录因子可直接调控多个下游靶基因，从而导致多
个基因的过表达。这种多基因过表达可能会增加植
物内能源消耗，最终导致植物根系生长发育的延迟。
当植物处于非正常生长条件时，植物受到胁迫
刺激后 CBF 基因的过表达就会调节下游相关基因的
表达从而抵御外界环境的刺激［23，26］。CBF 调控的下
游靶基因主要有 COR15A、RD29A 与 KIN2 等与逆境
胁迫密切相关基因，这些靶基因直接调控植物对不
同逆境胁迫的应答。在干旱及低温处理条件下，拟
南芥 CBF 基因过表达植株生存率明显高于野生型对
照［11］。在干旱胁迫下，水稻 ZmCBF3 的过表达株
系也表现出较强的耐旱能力［25］。本研究中将转基因
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1114
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（责任编辑 马鑫）