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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):179-185
N-乙酰转移酶（Mpr1）是能够乙酰化脯氨酸类
似物 2- 羧酸氮杂环丁烷（AZC）的一种胞内酶［1］。
酿 酒 酵 母（Saccharomyces cerevisiae）∑1278b 中 的
Mpr1 可以使 AZC 乙酰化成 N-acetyl AZC，从而防止
AZC 被误认为脯氨酸被生物体利用而产生毒性［2］。
近年的研究发现 Mpr1 酶具有显著的抗活性氧簇
（ROS）氧化胁迫生理功能［2，6］。ROS 是一类包含
O2·、H2O2 和·OH 等的小分子物质，是正常细胞
的新陈代谢的副产物。ROS 化学性质极为活泼，积
累后会给细胞造成极大的危害，导致细胞蛋白质发
生解聚与降解［3］；还能同细胞器膜中不饱和脂肪
酸发生反应，导致细胞器功能受损［4］；严重时还
收稿日期 ：2015-03-05
作者简介 ：朱海峰，男，硕士，研究方向 ：发酵工程 ；E-mail ：zhuhaifeng009@126.com
通讯作者 ：吴丹，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向 ：微生物发酵过程优化与控制 ；E-mail ：bioenwu@aliyun.com
毕赤酵母 GS115 中 N-乙酰转移酶在大肠杆菌中的克隆
表达与性质研究
朱海峰1，2  吴丹1，2  吴敬1，2
（1. 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，无锡 214122 ；2. 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室江南大学，
无锡 214122）
摘 要 ： 为了研究 P. pastoris Mpr1 的生理特性，在 E. coli JM109 胞内中成功表达来源于 P. pastoris GS115 的 Mpr1 酶，并利
用响应面分析法对诱导温度、IPTG 诱导浓度、起始诱导 OD 进行发酵优化，酶活达到（610.3±9.5）mU/mL。酶学性质显示，Mpr1
酶的最适反应 pH 范围为 7.0-7.5，最适反应温度是 30℃。通过分析重组表达 Mpr1 菌株和对照菌株的培养过程，显示重组菌株的
生长能力显著增强，原因是 Mpr1 降低了细胞内的 ROS 水平。
关键词 ： N- 乙酰转移酶 ；大肠杆菌 ；毕赤酵母 GS115 ；响应面分析法 ；发酵优化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.023
Cloning，Expression and Characterization of Enzyme for Mpr1 from
P. pastoris GS115 in Recombinant E.coli
Zhu Haifeng1，2 Wu Dan1，2 Wu Jing1，2
（1. State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122 ；2. School of Biotechnology and Key Laboratory
of Industrial Biotechnology Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract: Due to the nature in P. pastoris methanol metabolism, it suffers much more ROS oxidative stress. There is one Mpr1 enzyme
in P. pastoris. It plays significant physiological roles in ROS oxidative stress resistance ability and related research is still blank. For a detailed
study about the physiological characteristics of P. pastoris Mpr1, Mpr1 from P. pastoris GS115 had been successfully expressed in E.coli JM109.
Fermentation optimization of recombinant cell was studied from induction temperature, IPTG induction concentration, Initial induction OD by
using Response Surface Analysis, activity reached（610.3±9.5）mU/mL. Enzymatic properties showed that the optimal pH of Mpr1 was about
7.0 to 7.5, the optimum temperature of Mpr1 was 30℃. In order to explore the nature of Mpr1, PQE30-E.coli JM109 strain and PQE30-Mpr1-E.
coli JM109 strain were cultured under the same fermentation conditions in this experiment. The results showed that the growth capacity of the
recombinant strain was stronger. The reason is that Mpr1 reduces levels of intracellular ROS.
Key words: N-acetyl transferase ；Escherichia coli JM109 ；P. pastoris GS115 ；response surface analysis ；fermentation optimiza-tion
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11180
能造成 DNA 的断裂，引起细胞死亡［5］。在合成精
氨 酸 途 径 中 Mpr1 可 直 接 将 Δ1- 吡 咯 啉 -5- 羧 酸 酯
（P5C）或其平衡物谷氨酸 -γ-半醛（GSA）乙酰化成 N-
乙酰 GSA，从而减少了通常途径中的多个转化步骤，
有利于精氨酸快速合成［6］，提高细胞抗 ROS 的性
能。目前研究都集中在来源于 S. cerevisiae ∑ 1278b
的 Mpr1 基因上［2］。
毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种应用极为广
泛的真核表达系统，已表达了超过 500 多种异源蛋
白质［7］。由于 P. pastoris 代谢甲醇的生理特性，在
利用甲醇诱导发酵过程中产生大量的 ROS 而受到异
常强烈的氧化胁迫。P. pastoris 中一种 N-乙酰转移酶
（Mpr1）具有抗氧化胁迫功能，相关研究尚为空白。
研究 P. pastoris 中的 Mpr1 抗氧化胁迫机制将有利于
进一步优化 P. pastoris 细胞表达功能。本研究将来源
于 P. pastoris GS115 的 Mpr1 基因在 E. coli JM109 进
行重组表达，并利用响应面分析法对发酵过程中的
诱导培养温度、IPTG 诱导浓度、起始诱导 OD 进行
优化，获得最佳产酶条件 ；另外，对酶学性质进行
初步研究 ；同时分析 Mpr1 对原核细胞的生长影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 P. pastoris GS115、E. coli JM109 均由本
实验室保藏，PQE30 质粒购自北京鼎国昌盛生物技
术有限责任公司
1.1.2 培养基 LB 培养基（g/L）：分子级蛋白胨 5，
酵母粉 5，NaCl 10。
TB 培养基（g/L）：蛋白胨 12，酵母粉 24，甘油
5，K2HPO4·3H2O 16.43，KH2PO4 2.34。
1.1.3 酶及其它试剂 限制性内切酶 BamH I、Sac
I，T4 DNA 连接酶、Taq 酶及其配套产品、胶回收
试剂盒，质粒提取试剂盒，E. coli 感受态细胞制备
试剂盒，酵母基因组提取试剂盒购于大连宝生物公
司。DTNB、酵母无氨基基础氮源培养基购自上海生
工。AZC、乙酰辅酶 A 购自 Sigma。蛋白标准分子量
以及 SDS-PAGE 试剂盒购于碧云天生物技术研究所。
其它常规试剂购自国药集团。
1.2 方法
1.2.1 Mpr1 基 因 的 PCR 扩 增 P. pastoris GS115 基
因组按照上海生工基因组提取试剂盒操作步骤提取。
根据 NCBI 网站 Mpr1 基因序列（登录号 ：GENban
XP_002492064.1）设计引物如下 ：P1（正向引物）
5-GACGGATCCATGAGTTCTACTCTAGATCCTGA
AC-3 ；P2（反向引物）5-AACGAGCTCTTAAGAAA
GGTCCGTATCGCATGT-3，下划线分别表示 BamH
I 和 Sac I 酶 切 位 点， 以 引 物 P1、P2 对 P. pastoris
GS115 基因组 PCR 扩增获得 Mpr1 基因片段。PCR
反应体系 50 μL ：G+C buffer 10 μL，ddH2O 33.5 μL，
PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 0.5 μL， 基 因 组 1
μL，正向引物 0.5 μL，反向引物 0.5 μL，dNTP 4 μL。
PCR 反应条件 ：94℃预变性 4 min ；98℃变性 10 s，
55℃退火 5 s，72℃延伸 90 s，30 个循环 ；72℃延伸
10 min，4℃保温。1% 琼脂糖凝胶电泳检测目的产物。
1.2.2 重组表达载体的构建 使用胶回收试剂盒
回收纯化 PCR 产物，于 16℃与 pMD18-T 载体连接
过夜后，转入 E.coli JM109 的感受态细胞中，挑取
阳性单克隆菌落于液体 LB 培养基 37℃培养 8 h 左
右，抽提质粒，酶切验证后并进行基因测序。测序
正 确 后 将 pMD18-T-Mpr1 经 BamH I、Sac I 双 酶 切
之后，将片段纯化、回收，质粒 PQE30 也以同样
的方法酶切并胶回收。T4 ligase 连接目的基因和载
体，过夜后转入 E.coli JM109 的感受态细胞中，涂
布于含有 100 μg/mL Amp 抗性浓度的 LB 平板，挑取
单菌落于 LB 液体培养基中，37℃培养 8 h 左右，抽
提质粒，酶切验证并测序，得到正确的表达载体命
名为 PQE30-Mpr1，获得重组菌命名为 PQE30-Mpr1-
E.coli JM109。
1.2.3 Mpr1 酶基因的诱导表达 将构建好的重组
菌 PQE30-Mpr1-E.coli JM109 接种到含有 Amp 的 LB
培 养 基 中， 培 养 8 h 后 转 接 到 含 Amp 的 TB 培 养
基，在 37℃ 200 r/min 生长至设定 OD 后加入 IPTG
在不同的温度下诱导表达。发酵后 12 000 r/min 离
心 5 min 收集菌体，用 Tris-HCl 缓冲液（50 mmol/L，
pH7.5）悬浮菌体，超生破碎菌体，12 000 r/min 离
心 5 min 后上清即为重组 Mpr1 酶的粗酶液。
1.2.4 N-乙 酰 转 移 酶 Mpr1 酶 活 测 定［8］ 在 30 ℃
条件下将 1 mL 反应液在 412 nm 下测定光吸收的变
化。其中 TNB 的消光系数为 15 570 M-1·cm-1。一
个 酶 活 力 单 位 定 义 为 在 1 min 内 形 成 1 μmol TNB
2015,31(11) 181朱海峰等 ：毕赤酵母 GS115 中 N-乙酰转移酶在大肠杆菌中的克隆表达与性质研究
的 量， 具 体 成 分 包 括 ：Tris-HCl buffer（pH7.5）50
mmol/L，800 μL ；AZC 5 mmol/L，50 μL ；acetyl-CoA
0.2 mmol/L，50 μL ；DTNB 1 mmol/L，50 μL ；酶 液
50 μL。
反应计算公式 ：A = ε b c
其中，ε=15 570 M-1·cm-1，A 为吸光度，b 为测定
物质浓度 M（mol/L），c 为液层厚度（cm）。
通过测定 1 min 内 A 的变化算出 b 的浓度的生
成量，计算出酶活。
1.2.5 E. coli 细胞内 ROS 含量测定 用配制的磷酸
钠缓冲溶液将离心的发酵液样品稀释为菌液 OD600
约 0.2（细胞浓度 1×107 cells/mL）的悬浮液，取 1
mL 菌液加入 5 μL DCFH-DA 溶液，在 37℃、50 r/min
水浴摇床内避光负载 30 min，然后将样品放在冰上
避光保藏［9］。对照样品加入 5 μL 不含 DCFH-DA 的
DMSO，相同条件下处理 ；用流式细胞技术（Flow
cytometry，FCM）检测细胞内活性氧含量。
1.2.6 响应面优化实验 Box 及其合作者于 20 世
纪 50 年代提出的响应面分析法（Response Surface
Analysis）被广泛应用于食品、化工、农业等多个领
域［10，11］。本研究根据正交实验结果选取 3 个主要因
素进行响应面实验设计，并用 SAS 8.1 软件对实验
数据进行回归分析，通过微分方法预测实验最佳点。
1.2.7 重组 Mpr1 酶最适反应 pH 和 pH 稳定性分析
1.2.7.1 Mpr1 酶最适反应 pH 将纯化获得酶液离
心处理，用不同 pH 值的缓冲液复溶，在 30℃下测
定重组 Mpr1 酶活力，将最高的 Mpr1 酶活为定义为
100%，并计算其它样品的相对活力。
1.2.7.2 Mpr1 酶的 pH 稳定性 将离心处理的酶用
pH 分 别 为 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、
8.5 和 9.0 的 50 mmol/L 缓冲液复溶，于 4℃放置 24 h，
测定其酶活力。
1.2.8 重组 Mpr1 酶最适反应温度和温度稳定性分析
1.2.8.1 Mpr1 酶的最适反应温度 将酶反应体系分
别在 15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、
50℃和 60℃等温度下测定酶活力，将最高酶活定义
为 100%，并计算各样品的相对活力。
1.2.8.2 Mpr1 酶的热稳定性 将酶液分别在 4℃、
10℃、20℃、30℃和 40℃等不同梯度温度条件下水
浴保温，每隔 1 h 取一次样，测定残留酶活。
2 结果
2.1 重组表达载体的的构建
提 取 P. pastoris GS115 基 因 组 DNA，PCR 扩
增 得 到 基 因 Mpr1（ 图 1）， 将 得 到 cDNA 克 隆 到
pMD18-T simple vector。 测 序 结 果 表 明，MPR 基 因
全长 627 bp，编码 208 个氨基酸，与 NCBI 网站报
道的登录号为 GENban XP_002492064.1 的 P. pastoris
GS115 的 Mpr1 编码的蛋白序列完全一致。
2000
bp
M 1 2
1000
750 627
bp
250
100
500
M ：DL2000 DNA Marker ；1，2 ：Mpr1 基因
图 1 PCR 产物电泳图
将 pMD18-T simple vector 和表达载体 PQE30 分
别进行 BamH I、Sac I 双酶切之后，胶回收、连接、
转化 E.coli JM109，挑取单克隆培养过夜后，抽提
质粒，经双酶切得到大小约为 3 460 bp 和 627 bp 的
DNA 片段（图 2），获得的重组质粒 PQE30-Mpr1，
获得重组菌命名为 PQE30-Mpr1-E.coli JM109。
2000
bp
M1 M2 1 2
1000
750 627
250
100
500
3460
bp
M1 ：λ-EcoT14 I digest DNA Marker ；M2 ：DL2000 DNA Marker ；
1，2 ：PQE30-Mpr1 经 BamH I 和 Sac I 双酶切
图 2 重组质粒 PQE30-Mpr1 酶切电泳验证
将 重 组 菌 PQE30-Mpr1-E.coli JM109 接 种 到 含
Amp 的 LB 培养基中，转接 TB 培养基诱导 24 h 后
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11182
破壁胞内上清酶活为 462 mU/mL，携带空载体的对
照菌 PQE30-E.coli JM109 未检测到酶活。SDS-PAGE
（图 3）显示，23 kD 处有可溶性目的蛋白条带。
的结果是显著的。根据 R2=0.983 7 能解释 98.37% 的
发酵酶活变化水平。因此回归方程为重组 E. coli 发
酵产 Mpr1 酶提供了一个适合的模型。计算得到的
RSA（图 4）显示，在 3 种因素中对发酵酶活影响
由大到小分别是诱导温度 >IPTG 浓度 > 起始诱导生
物量，说明温度是影响重组 E. coli 诱导产酶最关键
因素。经 RSA 拟合后可看到拟合模型具有真实的最
大值。
表 3 回归方程的方差分析
方差来源 自由度 DF 平方和 SS Prob>F 值 相关系数（R2）
模型 9 144700 <0.0001 0.9837
A 1 11628.13 <0.0001
B 1 406.13 0.0159
C 1 480.5 0.0115
经过模型计算预测得到最大发酵酶活产量为
611.7，其中 3 个因素的最佳值分别是诱导温度在
30℃，起始诱导生物量 OD 为 4.5，IPTG 浓度控制在
0.4 mmol/mL。 为 了 证 实 预 测 的 结 果， 用 以 上 得
到 的 最 优 配 方 重 复 实 验 3 次， 平 均 发 酵 酶 活 为
（610.3±9.5）mU/mL，与预测值 611.7 良好的拟合性
证实了模型的有效性，回归方程为摇瓶发酵产 Mpr1
酶提供了一个合适的模型。
2.2 响应面分析法优化重组菌株发酵条件
根据 Box-Bchnken 的中心组合设计原理［10］，设
计了三因素三水平的响应面分析实验，共有 15 个试
验点，以发酵温度，IPTG 含量和诱导起始 OD 为自
变量，以发酵液酶活为响应值，实验因素与水平的
选取，见表 1。
表 1 因素与水平取值表
因素
水平
-1 0 1
A ：诱导温度 /℃ 25 30 37
B ：诱导起始（OD） 2.5 3.5 4.5
C ：IPTG 浓度 /（mmol·L-1） 0.2 0.4 0.6
15 个实验点可分为两类 ：一是析因点，自变量
取值在 x1，x2，x3 所构成的三维顶点，共 12 个析因点；
二是零点，为区域的中心点，零点实验重复 3 次，
以估计实验误差，每次实验得到的酶活，见表 2。
以发酵液酶活产量为响应值，运用 SAS 程序
进行回归拟合后，各实验因子对响应值的影响可用
下 列 函 数 表 示 ：Y1=604.67-38.13X1+7.12X2+7.75X3-
2.75X1X2-0.5X1X3+1X2X3-187.96X1
2-3.46X2
2-32.21X3
2。
运用 SAS 程序对回归方程进行方差分析，结果（表
3）显示，所做模型和 3 个因素的“Prob>F”值远小
于 0.05，说明所做的回归方程模型及 3 个影响因素
97.4
kD kD
M 1 2 3 4 5 6
66.2
43
20
14.4
31
23
M ：蛋白 Marker ；1-3 ：intracellular proteins of PQE30-E.coli JM109 ；
4-6 ：intracellular proteins of PQE30-Mpr1-E.coli JM109
图 3 重组菌发酵产 Mpr1 酶 SDS-PAGE 图
表 2 响应面分析实验安排与发酵酶活产量
实验号
因素
实验值
A B C
1 -1 -1 0 440
2 -1 1 0 467
3 1 -1 0 365
4 1 1 0 381
5 0 -1 -1 558
6 0 -1 1 573
7 0 1 -1 563
8 0 1 1 582
9 -1 0 -1 413
10 1 0 -1 342
11 -1 0 1 428
12 1 0 1 354
13 0 0 0 605
14 0 0 0 602
15 0 0 0 607
2015,31(11) 183朱海峰等 ：毕赤酵母 GS115 中 N-乙酰转移酶在大肠杆菌中的克隆表达与性质研究
降，可能是由于高温造成了酶蛋白逐渐变性。将重
组 Mpr1 酶分别在不同温度条件下水浴保温，考察
其热稳定性。结果（图 6-B）显示，重组 Mpr1 酶在
4-20℃之间，保温 3 h Mpr1 酶的表现相对稳定，在
30℃保温 3 h，酶活残留 50% 左右，而在 40℃下保
温 2 h 剩余活性不足 40%，表明重组 Mpr1 酶在低温
条件下具有较好的稳定性。
700
600
500
400ਁ䞥⏢䞦⍫
300
0.6
0.5 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 25
28
31
34
37
A: 䈡ሬ⑙ᓖC: IPTG⎃ᓖ
700
600
500
400ਁ䞥⏢䞦⍫
300
55
50
45
40
35 25
28
31
34
37
A: 䈡ሬ⑙ᓖB: 䈡ሬ䎧࿻⭏⢙䟿
图 4 重组 Mpr1 酶活与诱导温度（A）、起始诱导生物量（B）
和 IPTG 浓度（C）的关系
2.3 重组Mpr1酶酶学性质初步研究
将细胞高压破碎后离心收集上清液，通过硫酸
铵沉淀、透析、DEAE 阴离子交换层析获得纯化的
Mpr1 酶，进行了酶学性质初步研究。
2.3.1 重组 Mpr1 酶的最适反应 pH 和 pH 稳定性
重组 Mpr1 酶反应的最适 pH 的研究结果（图 5-A）
显示，pH 在 7-7.5 酶活性最高。考察重组 Mpr1 酶
的 pH 稳定性，将其置于 pH3.0-9.0 的缓冲体系中 4℃
保温 24 h 后，测定残留酶活。结果（图 5-B）显示，
重组 Mpr1 酶的 pH 稳定范围为 6.5-8.0，在此范围内
保温 24 h，重组 Mpr1 酶活约保持在 90% 以上，在
pH4.0-6.5 范围内保温 24 h，酶活可保持在 50% 以
上，而当 pH>8.0 和 pH<4.0 时，Mpr1 酶稳定性很差。
2.3.2 重组 Mpr1 酶的最适反应温度和温度稳定性
在不同温度条件下进行酶促反应，测定 Mpr1 酶酶活
力。结果（图 6-A）显示，重组 Mpr1 酶在 30℃时酶
活最高，而当温度继续上升后，Mpr1 酶活力逐渐下
5 6 7 8 9 10
0
20
40
60
80
100
120⴨ሩ䞦⍫/%
pH
2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
20
40
60
80
100
120⴨ሩ䞦⍫/%
pH
A
B
图 5 Mpr1 酶反应的最适 pH（A）和 pH 稳定性（B）
2.4 表达Mpr1对E.coli JM109生长影响的初步研究
Momura 等［12］ 在 研 究 来 源 于 S. cerevisiae 细 胞
∑1278b 和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pom-
be）的 N-乙酰转移酶时，发现将上述来源的 N-乙酰
转移酶在重组 E. coli 中实现异源表达后，重组 E.
coli 同时还具有了抗 AZC 的活性。在利用重组 E.
coli 胞内表达 P. pastoris 来源 Mpr1 时发现重组菌的
生长状况要好于对照菌（图 7），在发酵 24 h 后重
组菌的细胞 OD 达到 14 左右，而对照菌 OD 仅为 9。
基于 Mpr1 具有显著的抗氧化胁迫的功能，又测定了
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11184
E. coli 胞内 ROS 水平，结果（表 4）发现重组菌胞
内 ROS 含量显著低于对照菌。这可能是重组 E. coli
表达 Mpr1 时，Mpr1 酶使其抗氧化胁迫能力得到增
强，从而改善细胞生长环境，因而生长速度明显高
于对照组。
表 4 PQE30-E.coli JM109 菌株和 PQE30-Mpr1-E.coli
JM109 菌株细胞内 ROS 含量分析
取样时间 /h
菌株
PQE30-E.coli JM109 PQE30-Mpr1-E.coli JM109
0 0.12 0.14
8 0.52 0.37
12 0.95 0.53
16 1.43 0.77
24 1.96 0.85
3 讨论
目 前 国 外 研 究 报 道 均 集 中 于 S. cerevisiae 的
Mpr1。P. pastoris 应用广泛，但是其在诱导的过程中
受到的氧化胁迫严重影响其外源蛋白的表达性能，
有关 P. pastoris MPR1 基因的研究目前尚属空白。由
于 MPR1 基因较为广泛的分布于生物细胞中［13］，
而所有的生物细胞都会受到 ROS 的影响，因此研
究 MPR1 的表达调控也是抗氧化胁迫机制的共性问
题之一。但是，毕赤酵母 Mpr1 在酵母内表达量很
低，无法满足研究的需求，需要通过基因工程手段
提高 Mpr1 酶的表达量。本实验在 E.coli JM109 中成
功实现胞内表达来源于 P. pastoris GS115 的 Mpr1 酶。
通过研究酶学性质，P. pastoris Mpr1 和 S. cerevisiae
Mpr1 相比较具有较大区别。Michiyo 等［12］研究同样
在 E. coli 中表达的 S. cerevisiae 细胞∑ 1278b 中 Mpr1
酶时，发现其最适反应 pH 范围在 8.5-9.0。可见来
源于 P. pastoris 的 Mpr1 酶更适合于在偏中性的环境
下发挥酶功能。Iinoya 等［8］发现 S. cerevisiae Mpr1 酶
在 50℃条件下半衰期为 8.2 min，相比之下本研究中
P. pastoris Mpr1 在 40℃下半衰期为 1 h 左右，可见 P.
pastoris 来源 Mpr1 较 S. cerevisiae 来源的 Mpr1 更加稳
定。经 NCBI 网站 blast 比对分析发现，两种同工酶
的同源性仅为 47%。鉴于 P. pastoris 具有极强的抗氧
化胁迫能力，其 Mpr1 酶可能在抗氧化胁功能上存在
特殊性，或者还存在有不同的生理功能，需要进一
步实验来明确 P. pastoris 中 Mpr1 的生理功能。
为了获得 Mpr1 酶的最佳发酵条件，采用 RSA
方 法 分 别 从 诱 导 温 度、IPTG 诱 导 浓 度、 起 始 诱
导 OD 进行发酵优化，最终酶活达到（610.3±9.5）
0 10 20 30 40 50 60 70
0
20
40
60
80
100
120⴨ሩ䞦⍫/% ⑙ᓖ/ć
0 2 4 6
0
20
40
60
80
100
120⴨ሩ䞦⍫/% ᰦ䰤/h
4ć
10ć
20ć 30ć40ć
A
B
图 6 Mpr1 酶的最适反应温度（A）和热稳定性（B）
0 5 10 15 20 25 30
0
2
4
6
8
10
12
14
16
O
D ᰦ䰤/hPQE30-E. coli JM109PQE30-Mpr1-E. coli JM109
图 7 PQE30-E.coli JM109 菌株和 PQE30-Mpr1-E.coli
JM109 菌株细胞生长情况比较
2015,31(11) 185朱海峰等 ：毕赤酵母 GS115 中 N-乙酰转移酶在大肠杆菌中的克隆表达与性质研究
mU/mL。优化发现发酵温度对发酵水平的影响最大，
其次是 IPTG 浓度和起始诱导 OD。由于在利用 E.
coli 异源表达时温度越高，蛋白表达越容易形成包涵
体，因而发酵温度是影响蛋白表达的重要因素。较
低发酵温度有利于细胞控制自身的合成蛋白质的速
率，从而表达更多具有正常生理功能的蛋白质。另
外，本研究中还发现 PQE30-Mpr1-E.coli JM109 菌株
的生长情况显著好于 PQE30-E.coli JM109 菌株，经
分析各自胞内 ROS 水平，认为是重组菌中所表达的
Mpr1 使其获得更高的抗氧化胁迫能力，从而具有更
强的生长能力。鉴于 P. pastoris 的生理特殊性，后续
研究可通过构建酵母 Mpr1 缺失突变体和过表达突变
体，研究 Mpr1 在 P. pastoris 中的抗氧化胁迫调控规
律，在分子水平阐明其抗 ROS 氧化胁迫的调控机制。
4 结论
构建了重组菌 PQE30-Mpr1-E.coli JM109，采用
RSA 方法从诱导温度、IPTG 诱导浓度、起始诱导
OD 分别对其进行发酵优化，获得最佳诱导发酵条件
为 ：30 ℃， 起 始 诱 导 OD=4.5，0.4 mmol IPTG 诱 导
24 h 后，Mpr1 酶 活 达 到（610.3±9.5）mU/mL。 酶
学性质初步研究结果表明，Mpr1 酶的最适反应 pH
范围为 7.0-7.5，最适反应温度是 30℃。此外，对比
重组菌和对照菌在同样条件下培养，重组菌生物量
显著高于对照菌，胞内 ROS 含量较低，说明将 Mpr1
酶在 E.coli JM109 中表达之后，提高了其抗 ROS 胁
迫能力，促进了细胞的生长。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）