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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-06-20
基金项目 : 贵州省科技工业攻关项目（黔科合 GY 字（2006）3011）, 贵州大学引进人才项目基金项目
作者简介 : 叶胜蓝 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 农药学 ; E-mail:yeshenglan0327@163.com
通讯作者 : 黄剑 , 男 , 教授 , 研究方向 : 农药毒理学和天然产物 ; E-mail:jhuang66@163.com
土壤放线菌 P3-2 的分类鉴定及抗菌活性研究
叶胜蓝 汪江峰 黄剑
（贵州大学精细化工研究开发中心 教育部绿色农药与农业工程重点实验室，贵阳 550025）
摘 要： 对从贵州土壤微生物中筛选到的放线菌菌株 P3-2 进行了分类学和抗菌活性的研究。采用多相分类法，对该菌株
的形态特征、培养特征、生理生化特性以及 16S rDNA 基因序列进行了研究。结果表明 , 放线菌 P3-2 菌株属于链霉菌属 ；16S
rDNA 序列长度为 1 456 bp，序列分析和系统进化树分析表明其序列与 Streptomyces recifenis ST100 的同源性最高，为 99.4%。但
与 S. recifenis ST100 相比较，P3-2 菌株的培养特征和生理生化特性中多项指标都存在着不同，初步确定菌株 P3-2 为链霉菌属中 S.
recifenis ST100 的一个亚种，暂定名为 Streptomyces sp. P3-2。P3-2 菌株的 10 倍稀释发酵液对油菜菌核病菌、黄瓜灰霉病菌、小麦赤
霉病菌、水稻纹枯病菌及半夏立枯病菌的抑制率高达 99%，对烟灰霉病菌、玉米小斑病菌等 9 种病原真菌均有不同程度的抑制作用，
对金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑制作用。
关键词： 放线菌 P3-2 链霉菌 菌株鉴定 抗菌活性
Identification and Antibacterial Activity of Actinomycetes P3-2 in Soil
Ye Shenglan Wang Jiangfeng Huang Jian
（Research and Development Center of Fine Chemicals，Guizhou University，Key Laboratory of Green Pesticide and Bioengineering，
Ministry of Education，Guiyang 550025）
Abstract: Actinomycete strain P3-2 obtained and screened from soil in Guizhou province was studied for its taxonomy and antimicrobial
activity. Polyphasic taxonomy was adopted to study its morphological characteristics, cultural characteristics, physiological and biochemical
properties as well as 16S rDNA gene sequence. The morphological and cultural studies showed that strain P3-2 belonged to the streptomyces and
designated as Streptomyces sp. P3-2; 16S rDNA sequence is 1 456 bp in length. Its sequence and phylogenetic tree analysis showed that it shared
highest homology with S.recifenis ST 100 sequence. The fermention products of this strain was diluted 10 times and had an inhibition of 99%
against Sclerotinia sclerotiorum, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Thanatephorus cucumeris, Rhizoctonia solani, and had a comprehensive
inhibition effects against Alternaria alternata, Bipolaris maydis. Also, there was a certain inhibition against Staphylococcus aureus, Bacillus cereus
and Bacillus subtilis, but no effect against Escherichia coil.
Key words: Actinomycete P3-2 Streptomyces Identification Antibacterial activity
土壤中的放线菌是拥有巨大应用价值的一类微
生物类群，能产生多种有益代谢产物且具有很高经
济价值，80% 的抗生素来源于放线菌，特别是链霉
菌属［1］。到目前为止，从放线菌中发现的具有生物
活性的物质大约有 12 000 种，大约占整个天然生物
活性物质的 50％，其中仅仅从链霉菌一个属就发
现近万种［2］。因此，放线菌的研究具有十分重要的
科学价值和实用价值［3, 4］。拮抗性放线菌的筛选与
分离是新农药和新医药开发的基础。在对贵州省多
个地区土壤进行拮抗放线菌的筛选过程中，发现并
分离得到一株具有较高农用抗菌活性的放线菌菌株
P3-2，该菌株发酵产物中抗菌物质对温度、光照不
敏感，对酸稳定，仅碱性条件下稳定性稍差［5］，对
多种植物病原真菌均有较强的抑制作用。本文旨在
对该菌株的形态特征、培养特征、生理生化特性以
及 16S rDNA 序列进行研究，以确定其分类地位，并
2012年第1期 157叶胜蓝等 ：土壤放线菌 P3-2 的分类鉴定及抗菌活性研究
对活性成分的抗菌谱进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种 放线菌菌株 P3-2 系本实验室研究
人员从贵州省山区 10-20 cm 深度土层中分离纯化得
到，接种于高氏一号培养基，4℃保存。
1.1.2 供试病原菌 供试植物病原真菌 14 种和供试
细菌 4 种，由贵州大学教育部绿色农药与生物工程
重点实验室提供。
1.1.3 培养基 形态特征、培养特征以及生理生化
特性试验所用培养基均采用放线菌培养、分类鉴定
常规培养基［6,7］。抑菌活性培养基根据《微生物学实
验手册》配制［8］。
1.1.4 试剂 PCR 反应试剂、DNA Marker(DL2000)、
琼脂糖和 DNA 回收试剂盒均购自宝生物工程（大连）
有限公司 ；菌株 16S rDNA 的扩增采用通用引物［9］
Primer fD1:5-agagtttgatcctggctcag-3; PrimerrP2:5-
aaggaggtgatccagccgca-3，由北京三博远志生物技术有
限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 菌株的初步鉴定 ①形态特征 ：采用插片法，
将菌株用高氏一号培养基培养，28℃培养 7 d，观察
并记录菌落特征。取插片用 OlympusBH-2 光学显微
镜高倍镜观察菌丝体形态，并用电子显微镜扫描样
品。②培养特征 ：按国际链霉菌计划（ISP）所推荐
培养基，将菌株接种于高氏一号等 7 种培养基上，
28℃恒温培养，分别在 7 d、14 d、21 d 观察气生菌丝、
基内菌丝、可溶性色素的颜色及表观特征 ；③生理
生化特性 ：参考文献［10］所推荐的培养基和方法。
④ 16S rDNA 序列分析 ：采用酶解法［7］提取放线菌
基因组总 DNA，并对其 16S rDNA 序列进行 PCR 扩增，
扩增反应条件：94℃预变性 5 min，然后 94℃使 DNA
变性 1 min，56℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共
35 个循环，循环结束后 72℃延伸 5 min［11］。扩增反
应经 1% 琼脂糖凝胶电泳得到一条 1.5 kb 左右的条
带。扩增片段用 DNA 回收试剂盒进行回收。回收的
DNA 片段送北京三博远志生物技术有限公司测序。
采用 ClustalX2.0 软件对所测得的 16S rDNA 序列进
行人工严格校对。将校对后的 16S rDNA 序列提交到
NCBI 的 GenBank 数据库进行 BLAST 比较，调出同
源性大于 97 %以上的相关种属的序列信息，将其与
GenBank 中的参考菌株的 16S rDNA 序列进行比较分
析。采用 ClustalX2.0 软件进行多序列匹配排列，通
过 MEGA4.0 软件进行系统进化树的构建。
1.2.2 生物活性测定 选择多种植物病原真菌和细
菌作为供试菌，将菌株 P3-2 的发酵液稀释 10 倍，
分别用抑制生长速率法和管碟法进行抗菌谱［12］的
测定。
2 结果
2.1 形态及培养特征观察
在高氏一号培养基上，放线菌 P3-2 菌株的气生
菌丝生长较好，孢子丝成螺旋型，基内菌丝生长较
好，无横断 ( 图 1)。其生长形态呈现典型的链霉菌
形态特征。生长周期相对较短，28℃时培养 1-2 d 时，
气生菌丝非常少；3 d 时菌落呈白色，基内菌丝无色；
培养 5 d 时菌落呈浅灰色，基内菌丝黄色 ；培养到 7
d 时，气生菌丝生长繁茂，菌落呈灰色，基内菌丝
呈红褐色，无可溶性色素产生。电镜扫描结果（图 2）
显示，P3-2 菌株孢子丝较长，孢子成指骨形，表面
不光滑，有皱褶。
A. 孢子丝 ;B. 菌丝
A. 孢子
图 1 菌株 P3-2 的形态特征 (400×)
图 2 菌株 P3-2 的孢子结构 (10 000×)
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期158
在国际链霉菌计划 (ISP) 推荐的 7 种培养基上，
放线菌菌株 P3-2 经 28℃培养 5-7 d，其培养特征结
果见表 1。并将其与模式菌株 S. recifensis ST100［13］
进行对比。
培养基 放线菌株 P3-2 S. recifensis
无机盐可溶性淀粉培养基 生长差，气生菌丝白色，基内菌丝浅黄色，无可溶性色素产生 生长好，气生菌丝灰色，基内菌丝无鉴别色素
高氏一号培养基 生长繁茂，气生菌丝灰色，基内菌丝红褐色，无可溶性色素产生 NR
麦芽片培养基 生长繁茂，气生菌丝浅灰色，基内菌丝浅黄色，无可溶性色素产生 生长好，气生菌丝灰色，基内菌丝无鉴别色素
察氏培养基 生长繁茂，气生菌丝浅灰色，基内菌丝浅黄褐色，无可溶性色素产生 NR
酵母膏蛋白胨培养基 生长良好，气生菌丝浅灰色，基内菌丝浅黄色，无可溶性色素产生 生长好，气生菌丝灰色，基内菌丝无鉴别色素
马铃薯葡萄糖琼脂 生长繁茂，气生菌丝灰色，基内菌丝红褐色，痕量可溶性色素产生 NR
营养琼脂 生长差，气生菌丝浅灰色，基内菌丝浅黄色，无可溶性色素产生 NR
表 1 菌株 P3-2 和 S. recifensis 在不同培养基上的培养特征
“NR”表示未见报道
2.2 菌株生理生化特性
2.2.1 碳源的利用 测定了菌株 P3-2 对多种供试碳
源的利用情况，结果见表 2。结果表明菌株 P3-2 能
利用 D- 葡萄糖、蔗糖、D- 甘露糖、肌醇和甘露醇，
微弱利用 L- 阿拉伯糖、D- 果糖，不能利用 D- 木
糖、棉籽糖。通过菌株 P3-2 与 S. recifensis 碳源利
用的情况比较发现，两者在能否利用 D- 木糖、肌醇、
棉籽糖上有着明显的不同，除此以外其它指标是一
致的。
表 2 放线菌 P3-2 和 S. recifensis 菌株碳源利用
“＋”表示利用 ；“＋－”表示微弱利用 ；“－”表示不利用 ；“NR”表示
未见报道
碳源 放线菌 P3-2 S. recifensis
D-葡萄糖 ＋ ＋
蔗糖 ＋ ＋
D-木糖 － ＋
D-甘露糖 ＋ NR
肌醇 ＋ －
L-阿拉伯糖 ＋－ ＋
棉籽糖 － ＋
甘露醇 ＋ ＋
D-果糖 ＋－ ＋
2.2.2 酶学特性 菌株 P3-2 能使明胶液化、牛奶凝
固与胨化、淀粉水解、产生硫化氢 ；但不能利用纤
维素。而对照菌株 S. recifensis 不产生硫化氢。结果
见表 3。
表 3 放线菌 P3-2 菌株和 S. recifensis 的酶学特性
“＋”表示阳性反应 ；“－”表示阴性反应 ；“NR”表示未见报道
生理指标 放线菌 P3-2 S. recifensis
明胶液化 ＋ NR
牛奶凝固与胨化 ＋ NR
淀粉水解 ＋ NR
纤维素利用 － NR
硫化氢产生 ＋ －
2.3 16S rDNA序列分析
序列测定结果表明，菌株 P3-2 的 16S rDNA 核苷酸
序列由 1 456 bp 组成，将此序列提交到 NCBI，在数
据库 GenBank 登录号为 HM002750。用 BLAST 软件
从 GenBank 等数据库中进行序列相似性搜索，发现
P3-2 菌株与 S. recifensis ST100 菌系统发育关系最密
切，两株菌的 16S rDNA 序列同源性非常高，达到
99.4%。P3-2 菌株构建系统发育树所用的链霉菌参
考菌株 16S rDNA 序列注册号见表 4。17 株链霉菌菌
株 16S rDNA 序列构建的系统发育进化树（图 3）。
2.4 抗菌谱的测定
用放线菌 P3-2 菌株发酵液的 10 倍稀释液分别
对供试 14 种植物病原真菌和 4 种细菌进行了抑菌活
性测定，结果分别见表 5、表 6。结果表明，该菌株
所产生的抗生素对供试的病原真菌具有广谱抑菌活
性。其中对油菜菌核病菌、黄瓜灰霉病菌、水稻纹
枯病菌、半夏立枯病菌的抑制率高达 99% 以上，对
小麦赤霉病菌和苹果腐烂病菌抑制率为 90% 以上，
2012年第1期 159叶胜蓝等 ：土壤放线菌 P3-2 的分类鉴定及抗菌活性研究
对烟灰霉病菌、玉米小斑病菌等 8 种病原真菌均有
不同程度的抑制作用，对革兰氏阳性的金黄色葡萄
球菌、蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑制
作用，尤其对蜡状芽孢杆菌的抑制效果较好，对革
兰氏阴性的大肠杆菌无效。
图 3 基于 16S rDNA 核苷酸序列构建的菌株 P3-2 系统发育树分析
表 4 菌株 P3-2 构建系统发育树所用链霉菌属 16S rDNA 序列注册号
种名 注册号 菌株编号 同源性（%）
Streptomyces lanatus AJ399469 ISP 5090 98
Streptomyces lanatus AB184845 NBRC 12787 98
Streptomyces miharaensis AB184482 NBRC 13791 97
Streptomyces diastatochromogenes subsp. luteus AB184503 NBRC 13814 98
Streptomyces roseochromogenus subsp. albocyclini AB184512 NBRC 13828 97
Streptomyces misawanensis AB184533 NBRC 13855 98
Streptomyces triostinicus EU635725 CKM7 99
Streptomyces recifensis EU216596 ST100 99
Streptomyces rameus AB184798 NBRC 3782 98
Streptomyces hawaiiensis EU624140 NRRL 15010 98
Streptomyces chrestomyceticus AY999795 NRRLB-3310 98
Streptomyces corchorusii AB184267 NBRC 13032 98
Streptomyces fimbriatus AB184444 NBRC 13549 98
Streptomyces spinichromogenes AB184534 NBRC 13856 98
Streptomyces capoamus AB184385 NBRC 13411 98
Streptomyces galbus AB184201 NBRC 12864 98
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期160
3 讨论
与 16 株链霉菌属菌株的 16S rDNA 进行序列比
对发现，菌株 P3-2 与 S. recifensis ST100 的序列同
源性高达 99.4%。但是在对菌株 P3-2 的培养特征和
生理生化特性的研究中发现，与 S. recifensis ST100
相比，各项指标都存在着许多的不同 ：在国际链霉
菌计划推荐的几种培养基上，模式菌株 S. recifensis
ST100 基内菌丝无可鉴别色素，而菌株 P3-2 基内
菌丝呈现红色到红褐色 ；生化特性中，在碳源利用
上，菌株 P3-2 与模式菌株 S. recifensis ST100 相比，
对能否利用 D- 木糖、肌醇、棉籽糖上有着明显的
不同 ；在酶学特性上，菌株 P3-2 对硫化氢产生呈
阳性反应，而模式菌株 S. recifensis ST100 对硫化氢
产生呈阴性反应。综合形态学特征、培养特征、生
理生化特性等多相分类结果，暂将菌株 P3-2 初步
鉴定属于链霉菌属 S. recifensis ST100 的亚种，命名
为 Streptomyces sp. P3-2。菌株 P3-2 确切的分类学
地位还有待于与 S. recifensis ST100 之间 DNA-DNA
杂交的数据进行分析比较。
每种拮抗菌都有自己的抗菌谱。抗菌谱的测定
可以为拮抗菌的使用范围提供实验依据。选用黄瓜
灰霉菌等 14 种植物病原真菌和金黄色葡萄球菌等
4 种细菌作为供试菌，对 P3-2 菌株发酵液的抗菌活
性进行测定，结果表明 P3-2 菌株的发酵液的抗真
菌谱较广，对油菜菌核病菌、黄瓜灰霉病菌、小麦
赤霉病菌、水稻纹枯病菌、苹果腐烂病菌和半夏立
枯病菌具有较强抑制作用，抑制率都达 90% 以上，
对辣椒枯萎病菌等也呈现出不同程度的抑制作用。
选定的 4 种细菌中，对革兰氏阳性细菌如蜡状芽孢
杆菌作用较好，有较强的抑制作用，对金黄色葡萄
球菌和枯草芽孢杆菌也有不同程度的抑制作用，但
对革兰氏阴性的大肠杆菌无作用。
微生物源农药具有高效、低毒、低残留、环境
友好等优点，近几十年一直备受人们的关注。而放
线菌的次生代谢产物是微生物源农药的重要来源，
通过对其天然产物活性物质的筛选，所获得的新型
药物可以引导许多医用和农用药物的开发［15,16］。链
霉菌又是放线菌中产活性物质最多的一个属，作者
分离得到的 Streptomyces sp.P3-2 菌株抑菌谱之广，
可进一步对其发酵液中活性组分进行分离，有望开
发成杀菌谱广的农用或医用的抗生素。
4 结论
从贵州高原土壤中分离得到的、具有抑菌活性
的放线菌 P3-2 菌株进行了分类鉴定和抗菌活性的
研究。发现菌株 P3-2 的形态特征、培养特征以及
生理生化特征表现出链霉菌属的典型特征，属于烬
灰类群。
参 考 文 献
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表 5 菌株 P3-2 发酵液抗菌图谱测定结果
供试病原菌 抑制率 (%)
油菜菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum) 99.6±0.2
黄瓜灰霉病菌 (Botrytis cinerea) 99.8±0.1
小麦赤霉病菌 (Fusarium graminearum) 94.7±0.4
水稻纹枯病菌 (Thanatephoris cucumeris) 99.3±0.2
烟灰霉病菌 (Botrytis cinerea) 85.4±0.5
玉米小斑病菌 (Bipolaris maydis) 84.7±0.3
马铃薯晚疫病菌 (Phytophthora infestans) 53.6±0.3
苹果腐烂病菌 (Cytospora mandshurica) 91.9±0.2
辣椒枯萎病菌 (Fusarium oxysporum) 89.1±0.2
半夏立枯病菌 (Rhizoctonia solani) 99.7±0.1
莴苣黑斑病菌 (Stemphylium chisha) 35.8±0.4
烟草赤星病菌 (Alternaria alternate) 55.9±0.2
玉米大斑病菌 (Exserohilum turcicum) 63.8±0.3
甘薯黑疤病菌 (Ceratocystis fimbriata) 79.1±0.1
供试细菌名称 P3-2 氨苄青霉素 (30 μg/mL) 革兰氏染色
金黄色葡萄球菌 + + + + 阳性
大肠杆菌 － － 阴性
枯草芽孢杆菌 + + + + 阳性
蜡状芽孢杆菌 + + + + + 阳性
供试样品浓度为发酵液稀释 10 倍，数据为 3 次重复的平均值
表 6 菌株 P3-2 的发酵液对细菌的抑菌活性
“+ + +”表示抑菌圈非常清晰，“+ +”表示抑菌圈清晰，“+”表示可看到
抑菌圈，“－”表示无抑菌圈
2012年第1期 161叶胜蓝等 ：土壤放线菌 P3-2 的分类鉴定及抗菌活性研究
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（责任编辑 李楠）