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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(2):111-115
海州香薷（Elsholtzia haichowensis Sun）是一年
生草本植物，属唇形科，广泛分布于长江中下游铜
矿区和铜污染的土壤中，是一种铜矿指示植物，俗
称“铜草”［1，2］。海州香薷在非铜矿区也有发现［3］。
铜矿区的海州香薷由于长期生活在高浓度 Cu 污染的
环境胁迫条件下，可能已经发生了与 Cu 污染相适
应的抗性进化，形成了与非矿区种群不同的抗性生
态型［4］，通常来自矿区种群的海州香薷对 Cu 具有
较高的吸收富积能力和耐受能力［5］。海州香薷是植
物重金属抗性机理研究领域的理想植物材料，从抗
性相关基因表达角度能够更深入地理解海州香薷的
铜抗性机理，对于基因表达量的研究通常需要稳定
的内参基因作为标准来衡量，选择合适的内参基因
至关重要。植物肌动蛋白（Actin）在植物细胞形成
收稿日期 ：2014-07-17
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30870365，31270432）
作者简介 ：蔡深文，男，博士，讲师，研究方向 ：环境生物学 ；E-mail ：caishenwen@163.com
海州香薷 Actin 基因片段克隆及表达分析
蔡深文1  熊治廷2  刘晨2  徐仲瑞2  邓松强2
（1. 遵义师范学院资源与环境学院，遵义 563002 ；2. 武汉大学资源与环境科学学院，武汉 430079）
摘 要 ： 通过克隆海州香薷 Actin 基因片段并分析其组织表达，为研究海州香薷重金属抗性相关基因的表达调控奠定基础。
根据 GenBank 中其他植物 Actin 基因保守序列设计兼并引物，以海州香薷根总 RNA 为模板，利用 RT-PCR 技术分离得到 Actin 基
因片段。序列分析结果表明，海州香薷 Actin 基因片段长 576 bp，编码 192 个氨基酸，与其他植物同源基因的氨基酸序列相似性为
84%-97%，所克隆的序列为 Actin 基因的同源片段，将其命名为 EhACT，在 GenBank 中提交序列，获得登录号 AGT37260。半定量
RT-PCR 分析结果表明，EhACT 在海州香薷的根、茎和叶中表达相对稳定，初步表明其可作为研究海州香薷基因表达的内参基因。
关键词 ： 海州香薷 ；Actin 基因 ；克隆 ；表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.016
Cloning and Expression Analysis of Actin Gene Gragment from
Elsholtzia haichowensis
Cai Shenwen1 Xiong Zhiting2 Liu Chen2 Xu Zhongrui2 Deng Songqiang2
（1. School of Resource and Environment，Zunyi Normal College，Zunyi 563002 ；2. School of Resource and Environmental Sciences，
Wuhan University，Wuhan 430079）
Abstract ： Cloning and expression analysis of Actin gene fragment from Elsholtzia haichowensis would provide foundation for the study
of gene expression and regulation of heavy metal resistance related genes. Degenerate primers were designed based on the conserved sequences
of the Actin genes from other plants. Total RNA was extracted from the root of E. haichowensis. An Actin gene fragment was separated by reverse
transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）. The sequence analysis results revealed that Actin gene fragment from E. haichowensi
contains 576 bp, encoding a protein of 192 amino acids. Homology comparison with other plants Actin gene sequences in the GenBank showed
that it shared 84%-97% amino acid sequence homology with other plants. The cloned sequence was Actin gene fragment. It was named as EhACT
and was registered into GenBank（accession number ：AGT37260）. Semi-quantitative PCR assays indicated that the expression of EhACT in
root, stem and leaf of E. haichowensis was relatively stable, suggesting that EhACT can be used as the reference to analyze the gene expression in E.
haichowensis.
Key words ： Elsholtzia haichowensis ；Actin gene ；cloning ；expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.2112
和物质运输方面起着重要作用［6］，是组成型表达蛋
白，高度保守，在基因表达调控中被广泛作为内参
基因［7］。而关于海州香薷 Actin 基因的研究还未见
报道。因此，本研究通过同源克隆方法分离海州香
薷 Actin 基因片段并进行表达分析，以此基因为内参
标准，旨在为其他功能基因在海州香薷中的表达调
控研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 海州香薷（E. haichowensis）种子
采自湖北大冶铜绿山古铜矿遗址（114 53’E，30
05’N，MP）。海州香薷种子用 0.3% NaClO 溶液浸泡
消毒 20 min，去离子水冲洗 5 遍后用去离子水浸泡
过夜，使种子充分吸收水分。第 2 天，将种子转移
至底部铺有滤纸的塑料碗中，加去离子水，水面浸
没种子的一半左右，置于 HSR025 型人工气候箱中
黑暗萌发，温度设定为 25℃，湿度 75%。约 96 h 后
种子基本全部萌发。随后采用水培方法培养海州香
薷幼苗，待长至 4 对真叶时剪取新鲜的根尖（约 2
cm）用于 RNA 提取。
1.1.2 试剂 RNA 提取使用的 Trizol 试剂购自 Invit-
rogen 公司 ；PCR 反应所用的 Ex Taq，dNTPmixture，
pMD18-T 载体和 RNase Inhibitor，均购自 TaKaRa 公
司 ；反转录酶 M-MLV RT 购自 Promega 公司 ；DNA
凝 胶 回 收 试 剂 盒 为 Axygen 公 司 产 品 ；大 肠 杆 菌
TOP10 感受态细胞购自天根生化科技有限公司 ；其
他生化试剂购自丁香园生物技术有限公司，引物由
上海博道生物技术公司合成，序列测定由华大基因
完成。
1.2 方法
1.2.1 海州香薷总 RNA 提取 采用 Trizol 法提取总
RNA，结果用 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分光
光度计测定总 RNA 浓度及纯度，-80℃超低温冰箱
保存备用。
1.2.2 RT-PCR 扩增 首先以海州香薷根部总 RNA
为模板，反转录酶与引物 Oligo（dT）18 引导 cDNA
第一链的合成。0.2 mL 离心管中依次加入 12.5 μL
总 RNA，3 μL Oligo（dT）18，11 μL DEPC 处 理 的
水，70℃温浴 5 min，迅速置于冰上冷却，微离心
收集溶液至离心管底部，再依次加入 5×M-MLV RT
Buffer 10 μL，RNase Inhibitor 1.5 μL，dNTP Mixture
（2.5 mmol/L each） 10 μL，M-MLV RT 2 μL，用移液
枪吸打混匀，于 PCR 仪上 42℃反应 60 min，70℃温
浴 10 min 失活反转录酶，冰上分装后 -20℃保存备
用。根据其他物种 Actin 基因序列，设计其上游引物
PrimerF 5-TGTGGTCCTTTTGTGTCATT-3 和 下 游 引
物 PrimerR ：5-CTCCTTGCTCATCCTGTCAGC-3，以
反转录所得的 cDNA 为模板，进行 PCR 反应，反应
体系为 20 μL ：10× Ex Taq Buffer（Mg2+ plus） 2 μL，
dNTP Mixture（2.5 mmol/L each） 1 μL，PrimerF 1 μL，
PrimerR 1 μL，cDNA 1 μL，Ex Taq 0.2 μL，ddH2O
13.8 μL。PCR 反应程序为 ：94℃预变性 3 min ；94℃
变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，32 个循环；
72℃延伸 5 min。PCR 产物用 1.2% 琼脂糖凝胶电泳
检测。
1.2.3 阳 性 克 隆 鉴 定 目 的 片 段 按 照 DNA 凝 胶
回收试剂盒操作说明进行切胶回收纯化，连接至
pMD18-T 载体，转化 TOP10 感受态细胞，扩大培养
后提取质粒 DNA，进行 PCR 检测，选取带有目的片
段的重组质粒测序。
1.2.4 序列分析 使用 NCBI 网站的 BLAST 在线软
件（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast） 进 行 海 州 香
薷 Actin 基因片段的同源性比对分析与相似性搜索。
使用 ClustalX 软件将海州香薷和其他物种 Actin 基因
的氨基酸序列进行比对［8］。
1.2.5 半定量 RT-PCR 分析 Actin 基因表达 根据已
获得的 Actin 基因片段序列，设计特异性引物 Actin-
-F（5-TTCTTTGGCAGGTATTGTTCTCG-3）和 ActinR
（5-TTC-CCGCTCGGCTGTAGTTGT-3） 用 于 半 定 量
RT-PCR 反应。分别提取海州香薷的根、茎和叶的总
RNA，并反转录生成 cDNA，以该 cDNA 为模板进
行 PCR 反应，反应体系为 20 μL ：10×Ex Taq Buffer
（Mg2+ plus） 2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）
1 μL，PrimerF 1 μL，PrimerR 1 μL，cDNA 1 μL，Ex
Taq 0.2 μL，ddH2O 13.8 μL。PCR 反应程序为 ：94℃
预变性 3 min ；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃
延伸 30 s，28 个循环 ；72℃延伸 5 min。PCR 产物
用 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测。
2015,31(2) 113蔡深文等：海州香薷 Actin基因片段克隆及表达分析
2 结果
2.1 总RNA提取
海州香薷根中的总 RNA 经 1.2% 琼脂糖凝胶电
泳检测（图 1）显示，呈现 3 条清晰的条带，其中
28S rRNA 的 亮 度 约 为 18S rRNA 的 两 倍，5S rRNA
亮度较低，无明显降解，紫外分光光度计测定 RNA
样品 OD260/OD280 的平均值为 1.91，表明所提取的总
RNA 质量较好，可用于反转录反应。
Blast 结果表明，海州香薷与其他植物 Actin 基因的
核苷酸序列相似性为 78%-91%，氨基酸序列相似
性 为 84%-97%， 其 中 与 唇 形 科 植 物 丹 参（Salvia
miltiorrhiza）（GenBank ：ADK11998）的相似性最高，
达 97%。将 EhACT 与其他 8 种植物 Actin 基因的氨
基酸序列进行多重比对（图 4），EhACT 具有 153 个
保守氨基酸，非保守氨基酸为 38 个，表明所克隆的
序列片段为 Actin 基因片段，将其命名为 EhACT，在
GenBank 中提交序列，获得登录号 AGT37260。
28S
18S
5S
图 1 海州香薷根部总 RNA 提取
2.2 RT-PCR扩增和克隆
以 第 一 链 cDNA 为 模 板， 用 引 物 PrimerF 和
PrimerR 进行 PCR 扩增，获得一条约 550 bp 的条带，
与预期大小相似，将目的条带进行凝胶回收，随后
连接至 pMD18-T 载体上，转化大肠杆菌 TOP10。从
转化平板上随机挑取 5 个白斑进行菌液 PCR 检测，
结果（图 2）表明 5 个均为阳性克隆。
2000
bp
M54321
1000
500
250
100
750
1-5 ：不同克隆 ；M ：DL2000 marker
图 2 阳性克隆的 PCR 鉴定
2.3 测序结果与序列分析
将 5 个克隆进行测序，其测序结果完全一致，
得 到 576 bp 的 序 列， 编 码 192 个 氨 基 酸（ 图 3）。
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
60
240
300
360
420
480
540
120
180
576
图 3 海州香薷 Actin 基因片段的核苷酸序列及推导的氨基
酸序列
2.4 Actin基因的组织表达分析
通过特异性引物 ActinF 和 ActinR 克隆海州香薷
不同组织中的 Actin 基因片段，将目的片段进行测序
验证，结果显示其长度为 184 bp，属于 EhACT 基因
序列。半定量 RT-PCR 分析结果（图 5）显示，海州
香薷 Actin 基因在根、茎和叶组织中的表达相对稳定，
不具有组织表达特异性。
3 讨论
本研究通过同源克隆方法分离得到海州香薷的
Actin 基因片段序列，序列分析结果表明 EhACT 与其
他植物 Actin 基因的序列相似性较高，氨基酸序列高
度保守，表明所克隆的序列为 Actin 基因片段序列。
大量研究表明，Actin 基因在核苷酸和氨基酸水平都
具有高度的保守性和同源性［9-11］，这种高度保守性
是由于植物肌动蛋白起源于一个共同祖先，在进化
过程中通过复制和变异而被保留下来［12，13］。因此，
Actin 基因在植物生命活动过程中起着十分重要的作
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.2114
用，克隆海州香薷的 Actin 基因对于认识海州香薷在
铜胁迫环境下的进化过程也具有重要意义。Actin 基
因的重要性不仅表现在生命活动过程中，且由于该
基因的表达属于组成型表达，在研究其他基因的表
达调控过程中也起着重要作用。
植物基因表达分析研究中比较常用的内参对照
基因即管家基因主要有肌动蛋白基因（ACT）、甘
油醛 -3-磷酸脱氢酶基因（G3PDH/GAPDH）、18S 和
28S 核糖体 RNA 基因（18S rRNA、28S rRNA）及肽
链延伸因子（ef1-α）基因等［14-16］。其中肌动蛋白
是真核细胞中主要的胞质微丝骨架组分之一，是植
物基因表达研究中广泛使用的内参基因［17-19］。虽
然上述管家基因一直被作为内参基因来标准化目的
基因，但最近许多研究表明，不同管家基因在不同
细胞类型和不同生理状态下的表达并不是恒定不变
的，如 Xu 等［20］分析了 GAPDH、ACT、TUA、TUB、
18SrRNA、RPII、EF-1b 和 TEF2 基因在萝卜不同组
织、品种和发育时期的表达稳定性，其中只有 ACT、
RPII 和 TEF2 基因的表达相对稳定，可作为内参基
因。Podevin 等［21］通过实时荧光定量 PCR 分析了芭
蕉（Musa）GAPDH 等 9 个基因的表达，结果表明
只有 EF1、TUB 和 ACT 可以在不同组织稳定表达。
因此，在基因表达研究中需选择合适的管家基因作
为内参基因，本试验克隆了一条 576 bp 长的海州香
薷 Actin 基因片段，并通过半定量 RT-PCR 分析发现
EhACT CGP-----------FVSFYFWLLHLYIYSCL----IGSLAGIVLDSGDGVSHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDNL 65
SmACT -NPKANREKMTQIMFETFNAPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVSHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDHL 79
SlACT ---------MTQIMFETFNVPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVSHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDNL 71
NtACT LNPKANREKMTQIMFETFNVPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVSHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDNL 80
BnACT LNPKANREKMTQIMFETFNVPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVSHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDSL 80
TaACT LNPKANREKMTQIMFETFNVPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVSHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDCL 80
CsACT LNPKANREKMTQIMFETFNTPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVSHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDAL 80
PtACT LNPKANREKMTQIMFETFNTPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVSHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDAL 80
EjACT LNPKANREKMTQIMFETFNAPAMYVAIQAVLSLYASGRTTGIVLDSGDGVSHTVPIYEGYALPHAILRLDLAGRDLTDAL 80
Clustal Co * :* ::: * : * * :************************************** *
EhACT MKILTERGYSFTTTAEREIVRDIKEKLAYIALDYEQELETAKTSSAVEKNYELPDGQVITIGAERFRCPEVLFQPSMIGM 145
SmACT MKILTERGYSFTTTAEREIVRDIKEKLAYIALDYEQELETAKTSSAVEKNYELPDGQVITIGAERFRCPEVLFQPSMIGM 159
SlACT MKILTERGYMFTTTAEREIVRDMKEKLAYVALDYEQEIETARSSSSIEKNYELPDGQVITIGAERFRCPEVLFQPSMIGM 151
NtACT MKILTERGYMFTTTAEREIVRDMKEELAYVALDYEQELDTAKSSSSVEKNYELPDGQVITIGAERFRCPEVLFQPSMIGM 160
BnACT MKILTERGYMFTTTAEREIVRDIKEKLAYVALDFEQELETAKSSSSVEKNYELPDGQVITIGAERFRCPEVLFQPSLIGM 160
TaACT MKILTERGYSFTTTAEREIVRDIKEKLAYVALDYEQELENAKSSSSVEKSYELPDGQVITIGAERFRCPEVLFQPSFIGM 160
CsACT MKILTERGYSFTTTAEREIVRDMKEKLAYIALDYEQELETSKTSSSVEKSYELPDGQVITIGAERFRCPEVLFQPSMIGM 160
PtACT MKILTERGYSFTTTAEREIVRDMKEKLAYIALDYEQELETAKTSSSVEKSYELPDGQVITIGAERFRCPEVLFQPSMIGM 160
EjACT MKILTERGYSFTTTAEREIVRDMKEKLAYIALDYEQELETAKTSSSVEKSYELPDGQVITIGAERFRCPEVLFQPSMIGM 160
Clustal Co ********* ************:**:***:***:***::.:::**::**.**************************:*** 127
EhACT EAAGIHETTYNSIMECDVDIRKDLYGNIVLSGGSTMFPGIADRMSK 191
SmACT EAAGIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYGNIVLSGGSTMFPGIADRMSK 205
SlACT EAAGIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYGNIVLSGGSTMFPGIADRMSK 197
NtACT EAAGIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYGNIVLSGGSTMFPGIADRMSK 206
BnACT EAPGIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYGNIVLSGGSTMFPGIADRMSK 206
TaACT EAAGIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYGNIVLSGGSTMFPGIADRMSK 206
CsACT EAAGIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYGNIVLSGGSTMFPGIADRMSK 206
PtACT EAAGIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYGNIVLSGGSTMFPGIADRMSK 206
EjACT EAAGIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYGNIVLSGGSTMFPGIADRMSK 206
Clustal Co **.***********:******************************* 172
Actin 基因来源及其 GenBank 登录号 ：EhACT（海州香薷，AGT37260）；SmACT（丹参，ADK11998）；SlACT（番茄，ACL78791）；
NtACT（烟草，P93376）；BnACT（油菜，ACU27921）；TaACT（小麦，ACU27919）；CsACT（黄瓜，AAZ74664）；PtACT（毛白杨，
AFZ78523）；EjACT（枇杷，BAM48917）。“ ：”和“. ”：序列部分一致 ；“*”：序列完全一致
图 4 海州香薷 Actin 基因氨基酸序列片段与其他植物 Actin 基因的氨基酸序列多重比对
1 ：根 ；2 ：茎 ；3 ：叶
图 5 海州香薷 Actin 基因的组织表达
321
Actin
RNA
2015,31(2) 115蔡深文等：海州香薷 Actin基因片段克隆及表达分析
其在不同组织部位的表达相对稳定，初步表明其可
作为内参基因，为研究其他基因特别是重金属抗性
相关基因在海州香薷体内的表达和调控奠定了基础。
本试验仅研究了 EhACT 基因的组织表达特异性，其
他管家基因在不同条件下是否能够稳定表达，以及
与 EhACT 基因相比是否更加稳定，还有待进一步研
究证实。
4 结论
本研究通过同源克隆得到海州香薷 Actin 基因片
段（EhACT，GenBank 登 录 号 AGT37260）， 片 段 长
576 bp，编码 192 个氨基酸，与其他植物同源基因
的氨基酸序列相似性为 84%-97%。半定量 RT-PCR
分析结果表明 EhACT 在海州香薷的根、茎和叶中表
达相对稳定，可作为研究海州香薷基因表达的内参
基因。
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（责任编辑 李楠）