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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
2-芳基丙酸如布洛芬（ibuprofen）、酮基布洛芬
（ketoprofen）、萘普生（naproxen）等是目前使用非常
广泛的非甾体抗炎药，具有良好的解热、镇痛、消
炎等作用［1，2］。2-苯基丙酸是布洛芬合成过程中一
种重要的医药中间体，其在工业、医药领域应用十
分广泛，且价格昂贵。目前，其制备主要以化学法
为主［3］。Li 等［4］利用苯乙烯为原料在温度为 368K-
388K 时以 Pd（pyca）（PPh3）（OTs）/PPh3/TsOH/LiCl
为催化剂在通 CO 的基础上催化合成 2-苯基丙酸。
以 2-芳 基 丙 醇 为 原 料，Giacomini［5］ 以 TEMPO、
NaClO、NaClO2 混合物为催化剂 ；而 Noyori
［6］则以
KMnO4 为催化剂合成 2-芳基丙酸。化学合成步骤多、
反应条件剧烈、副产物较多、产生大量有毒物质。
利用生物法合成 2-苯基丙酸则因为具有选择性高、
反应条件温和及底物专一性、环境友好等一系列优
收稿日期 ： 2013-06-17
作者简介 ：左可，男，硕士研究生，研究方向 ：生物催化 ；E-mail ：zuoke2006@126.com
通讯作者 ： 李志敏，女，教授，硕士生导师，研究方向 ：生物化工，发酵工程，代谢工程，微生物生理等 ；E-mail ：lizm@ecust.edu.cn
红球菌 Rhodococcus. sp G14 生物转化合成 2-苯基丙酸
左可  李志敏  叶勤
（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）
摘 要 ： 2-苯基丙酸作为布洛芬合成过程中的一种重要的医药中间体，目前对其的生产及应用正在逐年增加，但价格十分
昂贵。对野生红球菌 Rhodococcus sp. G14 生物催化异丙苯合成 2-苯基丙酸的条件进行探索。利用响应面优化方法，得到菌体生长
最适培养基，分批培养 OD600 可达到 19.82。单因素试验优化菌体反应时间、反应温度、反应菌浓、底物浓度、渗透处理，获得最
佳催化条件下 2-苯基丙酸产量为 14.30 mg/L，为后续优化提高打下了基础。
关键词 ： 生物催化 异丙苯 2-苯基丙酸 优化
Production of 2-phenylpropionic Acid by Rhodococcus sp. G14
Zuo Ke Li Zhimin Ye Qin
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）
Abstract:  As a kind of important medicine intermediate in ibuprofen synthesis, the demand and application of 2- phenylpropionic acid
（2-PPA）is increased year by year. In this study, the reaction conditions for the biotransformation of cumune to 2-PPA by wild type Rhodococcus
sp. G14 was investigated. Using response surface optimization, the best medium condition for growth which could result 19.82 of OD600 in
batch cultivation was obtained. After single factor experiment on reaction time, reaction temperature, OD600, concentration of substrate, osmotic
treatment, 14.30 mg/L of 2-PPA was obtained, which would benefit the subsequent optimization.
Key words:  Biotransformation Cumene 2-phenylpropionic acid Optimization
点而更具有发展前景，但生物法合成 2-苯基丙酸国
内外研究报道尚少［7-11］，因此，从自然界中发现能
生产 2-苯基丙酸的菌株对生物法生产 2-苯基丙酸至
关重要。Rhodococcus sp. 可以在各种污染的环境中生
长，具有降解多种有机污染物质的能力，可利用底
物包括烷烃、芳香烃等大多数有机物［12］。本研究从
实验室前期筛选获得的烷烃降解菌出发，以异丙苯
为底物，初步验证其中一株可以转化异丙苯为 2-苯
基丙酸，进一步优化该菌株的培养基和催化反应条
件，以期为优化后续工作奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 红球菌 Rhodococcus sp. G2，Rhodococ-
cus sp. G9，Rhodococcus sp. G14 是本实验室从天津临
港工业区受石油污染严重的土壤中筛选所得［13］。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期174
1.1.2 培养基 （1）斜面保存培养基：10.0 g 葡萄糖，
10.0 g 蛋白胨，0.5 g 磷酸二氢钾，0.5 g 氯化钠，0.5 g
七水硫酸镁，20.0 g 琼脂，溶解于 1.0L 蒸馏水中，调
pH 为 7.0，121℃高压灭菌 20 min。（2）种子培养基：
5.0 g 酵母抽提物，10.0 g 蛋白胨，10.0 g 氯化钠溶解
于 1.0 L 蒸馏水中，121℃高压灭菌 20 min。（3）发
酵培养基 ：2.0 g 硫酸铵，10.0 g 氯化钠，2.0 g 磷酸
二氢钾，0.7 g 磷酸氢二钾，0.5 g 七水硫酸镁，痕量
氯化钙溶解于 1.0 L 蒸馏水中，加入 5 μL 微量元素
溶液［13］于 30 mL 发酵培养基中，再加入试验时所
需的碳源。
1.1.3 试验仪器 安捷伦 Agilent 1200 液相色谱仪
（HPLC），安捷伦气质联用仪（GC-MS），上海欣茂
有限公司紫外可见光分光光度计，上海智城摇床厂
恒温摇床，Eppendorf 高速冷冻离心机。
1.2 方法
1.2.1 菌种活化 将在斜面培养基上保存的菌种用
接种环挑取一环接到含有 30 mL 种子培养基的三角
瓶中，30℃、220 r/min 培养 24 h。
1.2.2 细胞培养和催化 将活化后的菌液 1 mL 转接
至 30 mL 以正十二烷为主要碳源的发酵培养基中，
30℃，220 r/min 培养 20 h ；5 000 r/min，4℃，离心
10 min，去上清，菌体用 Tris-HCl pH7.5 溶液洗涤两
遍后，再用上述溶液悬浮，加入反应所需其他物质
进行反应［10，11］。
1.2.3 渗透处理 收集以正十二烷为碳源的培养基
中生长的菌体，加入各种不同渗透剂后，在 25℃，
220 r/min，渗透处理 10 min ；5 000 r/min，4℃离心
10 min，取菌体细胞进行催化反应。
1.2.4 菌体浓度测定 取一定量细胞发酵液，按一
定比例稀释后，用紫外可见分光光度计于 600 nm 处
测菌体的吸光度值，以 OD600 表示。
1.2.5 GC-MS 检测 2-苯基 丙 酸 反 应 液 用 6 mol/L
HCl 溶液终止反应，取上述反应液 30 mL，加入 15
mL 乙酸乙酯，充分振荡萃取，静置分层后，将乙酸
乙酯置于烧杯中，重复两次，将得到的 30 mL 乙酸乙
酯萃取液混匀后，吸取 1 mL，加入少许无水硫酸钠
除去乙酸乙酯中的水，用 0.22 μm 膜过滤后 GC-MS 检
测。GC 检测条件 ：进样器和检测器温度都为 250℃，
柱温为程序升温，初始温度为 85℃维持 2 min，升温
速率为 15℃ /min，最高温度为 260℃，维持 5 min ；
MS 检测条件 ：MS 型号是 HP5973A，电子反应离子
源为 70 eV，温度为 230℃，四级温度是 150℃。
1.2.6 HPLC 检 测 2-苯 基 丙 酸 反 应 液 用 6 mol/L
HCl 溶液终止反应，用 0.22 μm 膜过滤后上清液用
HPLC 检 测 产 物 的 含 量。 检 测 条 件 ：Agilent 1200
serious 高效液相色谱，色谱柱为 Zorbax Eclipse XDB-
C18 column（150 mm×4.6 mm，5 μm）， 流 动 相 为
KH2PO4（0.3 mol/L，pH4.0）溶液和甲醇按 1∶1（V/V）
混合，流动相流速为 1 mL/min，柱温为 30℃，紫外
检测器波长为 210 nm，进样量为 20 μL。
2 结果
2.1 催化反应产物的验证
对 3 株菌的催化反应产物进行 GC-MS 和 HPLC
分 析，Rhodococcus sp. G2，Rhodococcus sp. G9 的 反
应萃取液中没有发现目的产物，Rhodococcus sp. G14
的反应萃取液中发现了 2-苯基丙酸。图 1 为 Rhodo-
coccus sp. G14 细胞催化反应的萃取液 GC-MS 图谱，2-
苯基丙酸出峰时间为 6.9 min，且在产物当中还有 2-
苯基 -1-丙醇，少量的 2-苯基 2-丙醇和 2-苯基 1-丙烯，
即 Rhodococcus sp.G14 氧化异丙苯的反应可以发生在
苯环侧链的末端和亚末端。同时将反应液用 HPLC
检测，与 2-苯基丙酸标准品出峰时间相对比，可得
到反应产物中含有 2-苯基丙酸。
2.2 催化反应条件的优化
2.2.1 反应时间 以 2-苯基丙酸产量为目标，对其
随反应时间的变化进行了考察。如图 2 示，随着催
化时间的延长，反应液中 2-苯基丙酸含量也在提高，
48 h 时产量基本趋于稳定在 6.02 mg/L。
2.2.2 反应温度 选择全细胞催化反应的最佳温度
对生成 2-苯基丙酸起着重要作用。分别选择催化反
应温度为 20℃ 、25℃ 、30℃ 、37℃进行试验。如
图 3 所示，全细胞催化反应活性随着温度的升高而
增大，25℃效果最佳，高于 25℃催化反应效率则降
低，溶液中生成的 2-苯基丙酸含量降低。
2.2.3 菌体浓度 OD600 对氧化反应的影响 2-苯基丙
酸产量如图 4 所示。随着菌浓的提高，48 h 后，2-
苯基丙酸的浓度也随之提高，最高浓度为 OD600 为
2013年第12期 175左可等 ：红球菌 Rhodococcus. sp G14 生物转化合成 2-苯基丙酸
10.00 时 2-苯基丙酸含量为 11.46 mg/L，但当以单位
OD 为基准，2-苯基丙酸的最大产量为 OD600 在 4.00
时，所以最终选择菌浓 OD600 为 4.00 进行催化反应。
2.2.4 底物浓度对催化反应的影响 考察不同的初
始底物浓度对细胞催化生产 2-苯基丙酸的影响，结
果见图 5。菌体浓度 OD600 为 4.00 时，随着底物浓度
的提高，48 h 后 2-苯基丙酸最大产量为 10.48 mg/L，
此时底物添加量 17.26 g/L；但当底物浓度为 8.63 g/L，
以单位底物浓度为标准时计算 2-苯基丙酸产量的最
大，所以最终选择底物浓度为 8.63 g/L 进行催化反应。900000
900000
900000
900000
900000
900000
900000
900000
900000
900000
900000
900000
100 100
2-㤟สщ䞨
100 100
A
100 100 100 100
B
600
0
1000
1600
2000
2600
3000
3600
4000
4600
6000
6000
6600
6600
7000
7600
8000
8600
9000
9600
30
30.0 61.1 64.1
77.1 91.1
151.9
160.1
105.1
207.9
O
OH
50 70 90 110 130 150 170 190 210
图 1 GC-MS 检测异丙苯氧化产物
0
2
4
6
8
10
20 24 28 32 36 40 44 48 52
t/h
2-
PP
A
mg
/L

图 2 反应时间对催化反应的影响
图 3 反应温度对催化反应的影响
0
2
4
6
8
10
12
14
20 25 30 37
Temperatureć
2-
PP
A
mg
/L

0
2
4
6
8
10
12
14
2 4 6 8 10
OD600
2-
PP
A
mg
/L

0
2
4
6
8
10
12
2.2 4.3 8.6 17.4 34.5
Cumeneg/L
2-
PP
A
mg
/L

图 5 底物浓度对菌体催化反应的影响
图 4 菌体浓度对菌体催化反应的影响
2.2.5 渗透剂处理细胞后催化反应 从图 6 可以看
出，不同渗透剂产生的效果有明显的不同，其中乙
醚，丙酮，氯仿，CTAB，甲苯对菌体催化反应影响
不大，而乙醇和吐温 80 则效果显著，分别使得产
物产量提高了 34% 和 46%（此时 2-苯基丙酸产量为
14.30 mg/L）。所以，采用吐温 80 对全细胞进行渗透
处理后再进行催化反应。
3 讨论
本文主要研究了 Rhodococcus sp.G14 能够催化异
丙苯生物合成 2-苯基丙酸的能力。通过对菌体反应
时间、反应温度、反应菌浓、底物浓度、渗透性的
优化，2-苯基丙酸的产量提高 2.34 倍。目前 2-苯基
丙酸的合成主要以化学法为主，生物法研究相对比
较少。生物法合成 2-苯基丙酸主要通过两种不同类
型的途径 ：其一为将外消旋的酯通过相应的酯酶水
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期176
其产量提高了 46%；并且将细胞反应液置于 220 r/min
摇床中进行充分振荡，可以有效增大细胞与异丙苯
的接触，从而提高异丙苯在溶液中的传质性能。
本研究中底物添加量仍然过高，转化率偏低，
主要是由于催化过程中存在以下几个问题 ：（1）生
成主要产物 2-苯基丙酸和 2-苯基 -1-丙醇 ；（2）生成
副产物 2-苯基 -2-丙醇和 2-苯基 1-丙烯 ；（3）挥发
严重（90%）；（4）细胞内滞留异丙苯。
4 结论
菌株 Rhodococcus sp.G14 催化异丙苯生成 2-苯
基丙酸的反应条件及菌体生长条件进行优化，最优
生长条件菌浓 OD600 可以达到 19.82。最优产酸条件：
菌体浓度 OD600 为 4.00，底物浓度为 8.63 g/L，细胞
需经 1% V/V 吐温 80 渗透处理 10 min 后，反应温度
为 25℃，反应时间 48 h，可以得到 2-苯基丙酸产量
为 14.30 mg/L。
参 考 文 献
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0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
osmotic treatment
R
el
at
iv
ity
ሩ➗
1%
Eth
an
ol
0.1
%C
TA
B
2.5
%T
olu
en
e
1%
Ch
lor
ofo
rm
1.5
%A
cet
on
e
0.5
%D
iet
hy
let
he
r
1%
Tw
een
80
图 6 不同渗透剂对菌体催化反应的影响
解生成 2-苯基丙酸。张波［1］通过对外消旋的 2-苯基
丙酸与异丙醇的酯化再由 PGA 酶催化拆分得到 S-2-
苯基丙酸 ；另一种方法则是直接的对苯环侧链上烷
烃进行末端氧化从而得到相应的酸。Gilligan［8］利
用 Rhodococcus equi TG328 中的腈水合酶和酰胺酶将
2-苯基丙酰胺催化转化生成 2-苯基丙酸。Gandolfi［9］
试验发现对 Acetobacter aceti 以 2-苯基 1-丙醇为代谢
底物的反应液中添加环糊精可以得到 2-苯基丙酸。
Hou［10，11］筛选得到了 8 株可以催化异丙苯得到 2-苯
基丙酸和 2-苯基 -1-丙醇的菌株。
在本试验过程中，Rhodococcus sp.G14 开始生长
在以正十二烷为唯一碳源的培养基中。Hou［10，11］发
现，红球菌在以正烷烃为唯一碳源的培养基中生长
时，其静息细胞催化异丙苯的能力为以葡萄糖为唯
一碳源的 30 倍，研究发现前者菌体内一种单加氧酶
的活性大大增加，且此单加氧酶为氧化过程中的关
键酶。本试验使用了正十二烷为 Rhodococcus sp.G14
生长所需唯一碳源，旨在提高菌体体内单加氧酶的
酶活性，增大对异丙苯的氧化能力。微生物细胞进
行催化反应，通过渗透处理可以促使底物更容易渗
透到细胞内与酶进行充分反应，同时也有利于转化
产物渗透到细胞外。一般渗透方法是采用加入表面
活性剂或有机溶剂从而使得细胞渗透性增大，加快
物质运输的能力［14］。吐温 80 因其良好的增溶性能，
本身具有稳定性高，不受 pH 的影响，毒性、生理
活性较低等原因在诸多领域得到广泛应用［15］。本研
究通过在培养基中添加表面活性剂吐温 80，增大正
烷烃在水中的溶解度，增大菌体浓度，并且增加细
胞通透性。并对此得到的细胞再次进行渗透性处理，
增加细胞的通透性，以此方法得到的 2-苯基丙酸，
2013年第12期 177左可等 ：红球菌 Rhodococcus. sp G14 生物转化合成 2-苯基丙酸
phenyl-propionic acid from（R, S）-2-phenylpropionitrile by
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（责任编辑 李楠）