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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第11期
根结线虫（Meloidogyne spp.）在世界范围内分
布广泛，种类繁多，对农业、园艺等产业危害重大。
据报道根结线虫每年对全世界重要经济作物造成的
损失高达数百亿美元［1］，其危害已超过细菌和病毒，
仅次于真菌。在热带、亚热带雨量充沛、气候温和
的地区，根结线虫的危害尤为严重，在我国多个 省
份也普遍存在［2］。对于根结线虫的防治，以往都是
收稿日期 ：2013-05-07
基金项目 ： “973”计划项目（2012CB017104），国家自然科学基金项目（31170062），海南大学 211 工程建设项目，海南大学环境与植物保
护学院研究生创新平台
作者简介 ： 黄惠琴，副研究员，研究方向 ：微生物资源与利用 ；E-mail ：huanghq21@163.com ；袁维道为并列第一作者
通讯作者 ：鲍时翔，男，研究员，E-mail ：bsxitbb@163.com
一株抗根结线虫放线菌的筛选与鉴定
黄惠琴1 袁维道1，2 魏华1，2 王英1，2 朱军1 孙前光1 鲍时翔1
（1. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海口 571101 ；
2. 海南大学环境与植物保护学院，海口 570228）
摘 要 ： 从海南省东寨港红树林底泥中分离获得具有抗线虫活性的放线菌菌株 HA11097。将该菌株发酵液稀释 20 倍和 40
倍时，抗根结线虫校正死亡率分别为 54.2% 和 46.7%。16S rRNA 基因序列分析表明，菌株 HA11097 属于链霉菌属（Streptomyces）
中的成员，与 S. aculeolatus 的相似性最高，为 98.9%。二者在系统发育树上处于同一分支，亲缘关系最近，DNA-DNA 杂交值为
94.4%。该菌的形态特征、培养特征以及生理生化特征与 S. aculeolatus 也基本一致。综合以上结果，鉴定菌株 HA11097 为针孢链
霉菌 Streptomyces aculeolatus，首次报道了其抗线虫活性。
关键词 ： 红树林 放线菌 根结线虫 鉴定
Screening and Identification of an Actinomycete Strain with
Nematicidal Activity
Huang Huiqin1 Yuan Weidao1，2 Wei Hua1，2 Wang Ying1，2 Zhu Jun1 Sun Qianguang1 Bao Shixiang1
（1. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops of Agriculture Ministry，Institute of Tropical Bioscience and
Biotechnology，CATAS，Haikou 571101 ；2. College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228）
Abstract: Root-knot nematode antagonistic strain HA11097 was isolated from mud samples collected from Dongzhaigang mangroves
in Hainan province. The mortality rates of the fermentation broth against root-knot nematode were 54.2% and 46.7% while diluted 20-fold and
40-fold, respectively. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence showed that strain HA11097 should belong to a member of the
genus Streptomyces, and closely related to S. aculeolatus, with the highest 16S rRNA gene similarity of 98.9%. In the phylogenetic tree, HA11097
was the closest relationship with S. aculeolatus, which both located on the same branch. Their DNA-DNA hybridization value was 94.4%. The
morphological, cultural characteristics and the results of physiological and biochemical properties of the strain were in well agreement with S.
aculeolatus. On the basis of these data, strain HA11097 was identified as Streptomyces aculeolatus. The article first reported that the strain of
anti-nematode activity.
Key words: Mangrove Actinomycetes Root-knot nematodes Identification
以化学防治为主。化学杀虫剂对于环境污染严重，
而且直接危害人、畜健康。随着科学的发展，生物
防治越来越受到人们的重视，从微生物的代谢产物
中开发具有抗根结线虫的活性物质，成为国内外的
研究热点之一。
放线菌是自然界中一类重要的微生物资源，可
产生多种抗生素及非抗生素类活性产物，目前广泛
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期176
应用的抗生素约 70% 是由放线菌产生的［3］。放线菌
次生代谢产物在抗根结线虫的应用方面，国内外文
献报道的并不多。一直以来，对于控制植物寄生线
虫的研究主要集中在真菌方面［4］。本研究采用 24 孔
板液体筛选模型，从红树林底泥中分离、筛选具有
抗线虫活性的放线菌菌株，并对活性菌株进行初步
鉴定，旨在为开发新型杀虫生物农药提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集 于 2011 年 4 月从海南省东寨港红
树林采集底泥样品 11 份，自然风干，备用。
1.1.2 培养基及试剂 分离培养基［5］：高氏一号合
成培养基、1/10 ATCC 培养基、腐植酸 - 维生素培
养基、酵母粉 - 淀粉发酵培养基。形态特征鉴定培
养基 ：高氏一号合成培养基、酵母粉 - 淀粉培养基、
无机盐淀粉培养基、甘油天门冬素培养基、燕麦汁
培养基和土豆汁培养基 ；液体发酵培养基 ：1.0% 玉
米粉、0.1% 酵母粉、1.0% 黄豆粉、0.5% 淀粉、0.05%
KH2PO4（黄豆粉和玉米粉煮沸过滤，取汁），pH7.2。
所有培养基均用陈海水配制。
DNA Marker、2×Es Taq MasterMix 购自北京全
式金生物技术有限公司，细菌基因组 DNA 提取试剂
盒购自成都福际生物技术有限公司，细菌通用引物
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其他
常规试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 放线菌菌株的分离与培养 将样品自然风干
10 d 左右，制成菌悬液，进行系列稀释后分别涂布
在放线菌分离培养基上，28℃培养，待长出菌落后，
挑取单菌落于高氏一号培养基上进行纯化，得到纯
培养。挑取纯化后的放线菌菌落，接种于发酵培养基，
28℃、180 r/min 振荡培养 7 d，10 000 r/min 离心 10
min，备用。
1.2.2 抗根结线虫活性菌株的筛选［6］
1.2.2.1 初筛 采用松材线虫，在 24 孔细胞培养板
中分别加入 50 μL 发酵液、550 μL 无菌蒸馏水，约
200 条（400 μL）松材线虫，混合均匀，以发酵培
养基为对照，每个处理重复 3 次，28℃静置 24 h 后
在倒置显微镜下观察，虫体僵直或卷曲被视为击倒，
计算线虫校正击倒率。被击倒的线虫放入清水中，
24 h 后观察恢复情况，不能恢复活性的记为死亡，
计算校正死亡率。
校正击倒率（%）=100%×（处理击倒率-对照
击倒率）/（1-对照击倒率）
校正死亡率（%）=（1-恢复率）× 校正击倒
率 ×100%
1.2.2.2 复筛 采用根结线虫，对初筛中线虫校正
死亡率达到 50% 以上的菌株发酵液进行复筛，方法
同 1.2.2.1。每个处理重复 3 次，24 h 后镜检，观察
活性情况，计算校正击倒率和校正死亡率。
1.2.3 不同处理时间对线虫活性的影响 用活性菌
株的发酵液分别处理线虫 2、4、8、12 和 24 h，对
线虫进行活性测试，观察线虫对发酵液的反应情况，
计算校正击倒率和校正死亡率。
1.2.4 活性菌株的鉴定
1.2.4.1 形态特征和培养特征 将菌株接种于高
氏一号合成培养基上，28℃插片培养，分别于 4、
7、14 和 21 d 取出玻片，通过光学显微镜（徕卡
DM6000B）和电子显微镜（PhenomTM G2）观察菌株
的形态特征。
将菌株分别接种到 6 种形态特征鉴定培养基上，
28℃倒置培养 4-14 d，观察菌株的基内菌丝、气生
菌丝、有无可溶性色素及生长状况等特征［7］。
1.2.4.2 生理生化特征 对菌株分别进行牛奶凝固
与胨化、淀粉水解、明胶液化、纤维素上生长、黑
色素产生、H2S 产生、硝酸盐还原、碳源利用试验，
温度、pH 和 NaCl 耐受性等试验［8］。
1.2.4.3 16S rDNA 序列测定和系统发育分析 以细
菌基因组 DNA 提取试剂盒提取菌株的基因组 DNA
作为 PCR 扩增的模板，16S rDNA 序列的 PCR 扩增
采用细菌通用引物对（正向引物 ：5-AGAGTTTGA-
TCCTGGCTCAG-3， 反 向 引 物 ：5-GGTTACCTTGT-
TACGACTT-3）。PCR 反 应 体 系 为 50 μL ：基 因 组
DNA 2 μL，正向引物 2 μL，反向引物 2 μL，Es Taq
MasterMix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR 反应条件为 ：
94℃ 5 min ；94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共
30 个循环 ；72℃ 10 min，4℃保温。测序结果在 Ez-
Taxon server 2.1 网站中进行序列比对［9］，在数据库
中调出同源性高的 16S rDNA 序列，采用 ClustalX 2.1
2013年第11期 177黄惠琴等 ：一株抗根结线虫放线菌的筛选与鉴定
软件进行多序列比对，用 MEGA 4.0 软件构建系统
发育树［10］。
1.2.4.4 DNA-DNA 同源性测定 使用细菌基因组
DNA 提取试剂盒提取相关菌株的基因组 DNA。采
用微孔板杂交的方法，通过 DNA 包被、标记 DNA、
预杂交、杂交和检测共 5 个步骤完成 DNA-DNA 同
源性测定［11，12］。
2 结果
2.1 放线菌的分离
从 11 份红树林底泥样品中分离得到 206 株放
线菌，包含 7 个属。其中，链霉菌属（Streptomyces）
的 数 量 最 多，130 株（ 占 63%）， 小 单 孢 菌 属
（Micromonospora）38 株（ 占 18%）， 糖 多 孢 菌 属
（Saccharopolyspora）16 株（占 8%），假诺卡氏菌属
（Pseudonocardia）、束村氏菌属（Tsukamurella）和拟
诺卡氏菌属（Nocardiopsis）各 6 株（各占 3%），白
蚁菌属（Isoptericola）4 株（占 2%）。分离结果与文
献报道的链霉菌与小单孢菌是海岸湿地的主要放线
菌类群结论一致。
2.2 抗线虫放线菌菌株的筛选
对 206 株放线菌发酵液进行抗线虫活性测定，
初筛时获得校正死亡率在 50% 以上的 28 株，占菌
株总数的 13.6%。复筛时，当发酵液稀释 40 倍、处
理时间 24 h 时，获得线虫校正击倒率在 50% 以上的
菌株 4 株，其中菌株 HA11097 对根结线虫的校正击
倒率为 53.3%，校正死亡率为 46.7%。发酵液稀释
20 倍时，校正击倒率和校正死亡率均有所提高，分
别为 62.9% 和 54.2%。
2.3 不同处理时间对线虫活性的影响
将菌株 HA11097 的发酵液稀释 40 倍后，对线
虫进行不同处理时间的对比试验，随着处理时间的
延长，线虫的校正死亡率逐渐增大，在 2、8 和 24 h
时，校正死亡率分别为 2%、17.5% 和 46.7%，结果
如图 1 所示。
2.4 菌株HA11097的鉴定
2.4.1 形态特征和培养特征 孢子丝螺旋形，孢子
呈卵圆形（图 2）。菌株 HA11097 在 6 种形态鉴定
培养基上生长良好，产生气生菌丝，基内菌丝发达，
气丝灰白色至灰色，基丝土褐色，在 6 种培养基上
均发现有淡黄色至微褐色的可溶性色素产生。
0
10
20
30
40
50
2 4 8 12 24
Processing time h
R
ev
is
ed
m
or
ta
lit
y
ra
te
s %
图 1 不同处理时间对线虫活性的影响
图 2 菌株 HA11097 在电子显微镜下的孢子形态（11 400×）
2.4.2 生理生化特征 菌株 HA11097 能利用 L-阿拉
伯糖、D-木糖、D-甘露醇、棉籽糖，水解淀粉，还
原硝酸盐，产生 H2S，生长的温度范围为 14-37℃。
具体特征参见表 1。
表 1 菌株 HA11097 的生理生化特征
特征 结果 特征 结果
生长温度范围（℃） 14-37 D-葡萄糖 -
生长 NaCl 浓度范围（%） 1-3 L-阿拉伯糖 +
生长 pH 范围 6-9 D-木糖 +
明胶液化 + 肌醇 -
淀粉水解 + D-甘露醇 +
硝酸盐还原 + D-果糖 -
H2S 产生 + 棉籽糖 +
黑色素产生 + L-鼠李糖 -
纤维素上生长 + 蔗糖 -
牛奶凝固与胨化 -
“+”表示阳性结果 ；“-”表示阴性结果
2.4.3 16S rDNA 序列系统发育树的构建 经测序获
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期178
得菌株 HA11097 的 16S rDNA 序列 1 375 bp，所得
序列经校对后提交 GenBank，登录号为 JX067935。
在 EzTaxon server 2.1 网站中进行 16S rDNA 序列比
对，同源性高的均为链霉菌属（Streptomyces），与
菌株 S. acueolatus 的相似性最高（98.9%），其次是
S. morookaense（97.8%）、S. rapamycinicus（97.6%）
和 S. yatensis（97.6%）。根据序列同源性从高到低的
顺序选取 8 株有效菌株，利用 ClustalX（2.1）和 Mega
4.0 软件构建系统发育树（图 3）。从系统发育树可
以看出，菌株 HA11097 与菌株 S. acueolatus 处于同
一分支，亲缘关系最近。
2.4.4 DNA-DNA 杂交结果 采用微孔板杂交法检测
菌株 HA11097 与 S. aculeolatus 的 DNA-DNA 同源性，
杂交值为 94.4%。
2.4.5 菌株 HA11097 的鉴定结果 菌株 HA11097 与
菌株 S. acueolatus 具有最高的序列同源性（98.9%），
在系统发育树上同处一个分支，亲缘关系最近，二
者 DNA-DNA 杂交值为 94.4%，大于国际系统细菌
学委员会（ICSB）规定的细菌定种界限 70%，可以
认为是同一个种。比较二者的形态特征和生理生化
特征，也基本一致，差别仅在于菌株 HA11097 不能
利用葡萄糖和果糖、不能使牛奶凝固与胨化。综合
Streptomyces rapamycinicus NRRL B-5491T EF408733
Streptomyces iranensis HM 35T FJ472862
Streptomyces yatensis NBRC 101000T AB249962
Streptomyces mobaraensis NBRC 13819T AB184870
Streptomyces lacticiproducens GIMN4.001T GQ184344
Streptomyces morookaense LMG 20074T AJ781349
Streptomyces thioluteus LMG 20253T AJ781360
HA11097 JX067935
Streptomyces aculeolatus NBRC 14824T AB184624 100
95
80
93
91
67
0.002
图 3 基于 16S rDNA 的菌株 HA11097 与相关菌株的系统发育树
以上形态特征、生理生化特征、16S rDNA 序列分析
及 DNA-DNA 杂交结果，鉴定菌株 HA11097 为针孢
链霉菌 Streptomyces aculeolatus。
3 讨论
放线菌是控制植物病原生物的重要微生物资源，
对病原生物有很高的拮抗作用和寄生性，作为根结
线虫的生防菌株具有巨大的潜能［13］。朱卫刚等［14］
报道了链霉菌产生的阿维菌素成功应用于南方根结
线虫的预防与治疗。罗红利等［15］发现与红灰链霉
菌（S. rubrogriseus）、上升岛链霉菌（S. capoamus）、
灰色链霉菌（S. griseus）和肉色诺卡氏菌（Nocardia
camea）亲缘关系较近的菌株对根结线虫具有较高的
生防效果。本研究采用 24 孔板液体筛选模型，从红
树林土壤样品中筛选了一批具有抗根结线虫活性的
放线菌菌株。此外，在研究中，采用松材线虫作为
初筛线虫，主要是考虑到松材线虫易于培养且繁殖
较快，4-5 d 就可以繁殖一代，可以在较短的时间内
获得大量的线虫，满足了试验的需求。
结合形态特征、生理生化特征、16S rDNA 系
统 发 育 分 析 及 DNA-DNA 杂 交 结 果， 鉴 定 菌 株
HA11097 为 针 孢 链 霉 菌 Streptomyces aculeolatus。
Fukuda 等［16］报道从该菌发酵液中分离到新型抗生
素复合物 A80915，该复合物对革兰氏阳性好氧和厌
氧细菌具有抗菌活性。而具有抗根结线虫活性，本
研究尚属首次报道。
4 结论
通过 24 孔板液体筛选模型，筛选了一批具有
抗根结线虫活性的放线菌菌株。其中菌株 HA11097
的发酵液在稀释 40 倍、处理时间 24 h 时，对根结
线虫的校正击倒率为 53.3%，校正死亡率为 46.7%。
发酵液稀释 20 倍时，校正击倒率和校正死亡率分别
为 62.9% 和 54.2%。对菌株 HA11097 进行了鉴定，
其孢子丝呈螺旋形，孢子卵圆形。能利用的碳源有
L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、棉籽糖。具硝酸
2013年第11期 179黄惠琴等 ：一株抗根结线虫放线菌的筛选与鉴定
盐还原性，能够降解纤维素。菌株 HA11097 与标准
菌株 Streptomyces aculeolatus NBRC 14824T 显示最高
的同源性 98.9%，并且处于系统发育树上同一个分
支，DNA-DNA 杂交值为 94.4%。结合形态和培养
特征、生理生化特征、16S rDNA 序列分析及 DNA-
DNA 杂交结果，将菌株 HA11097 鉴定为针孢链霉菌
（Streptomyces aculeolatus）。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）