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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
盐生杜氏藻（Dunaliella salina，以下简称盐藻）
的细胞结构简单，具有很强的抗盐能力，可以生长
在 5.0 mol/L NaCl 培养液中，而且其培养条件也很简
单。因此，盐藻是研究植物耐盐分子机制的重要模
式生物［1，2］。研究表明当盐藻在高盐环境胁迫下，
体内的蛋白质合成和降解以及能量代谢等多种代谢
途径会发生很大程度的改变［2-4］，其中耐盐作用主
要是依靠盐藻中 Na+/H+ 泵和大量合成兼容性溶质甘
油，但应答盐胁迫的调控过程还少有报道。从信号
传导方面开展对盐藻抗盐生理调节过程的研究，有
收稿日期 ：2013-10-28
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30972240），辽宁省教育厅科技研究项目（2008T023）
作者简介 ：李秀娟，女，硕士研究生，研究方向 ：海洋生物学 ；E-mail ：lixiujuan113@yeah.net
通讯作者 ：柴晓杰，女，博士，教授，研究方向 ：海洋生物分子生物学 ；E-mail ：cxj63@126.com
盐藻小 G 蛋白 DsRab 的原核表达及纯化
李秀娟  柴晓杰  陶晓迎  赵欢  丛玉婷 
（大连海洋大学 农业部北方海水增养殖重点实验室 辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室，大连 116023）
摘 要 ： 前期对盐藻小 G 蛋白基因 DsRab 研究表明，在盐胁迫诱导下该基因转录水平明显提高。为进一步研究该蛋白在盐
藻耐盐机制中的作用，PCR 扩增 DsRab 的开放阅读框（ORF），并将其克隆至带有 GST 标签的原核表达载体 pGS-21a，得到重组表
达载体 pGS-21a-DsRab。将重组表达载体转化 E. coli BL21（DE3），IPTG 诱导表达，并优化诱导表达条件，利用 GST-SefinoseTM Kit
进行纯化，用 SDS-PAGE 和 Western blot 鉴定。结果表明，成功构建了重组表达载体 pGS-21a-DsRab，SDS-PAGE 结果显示得到的
蛋白与预期分子量相符，并且纯度较高 ；Western blot 检测结果初步证明该融合蛋白为 GST-DsRab。
关键词 ： 盐藻 DsRab GST 原核表达 纯化
Prokaryotic Expression and Purification of DsRab from
Dunaliella salina
Li Xiujuan Chai Xiaojie Tao Xiaoying Zhao Huan Cong Yuting
（Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea，Ministry of Agriculture / Key Laboratory of Marine Bio-resoursce
Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province，Dalian Ocean University，Dalian 116023）
Abstract:  Previous studies indicated that the DsRab transcript could be increased by salt stress. In order to study the functions of DsRab
in salinity tolerance, the open reading frame（ORF）of DsRab gene was obtained through PCR. The target fragment was cloned in pGS-21a,
and the recombinant plasmid pGS-21a-DsRab was transformed into E. coli BL21（DE3）. The recombinant protein was induced with IPTG.
Then the prokaryotic expression condition was optiminzed to harvested more supernatant recombinant protein. The products were purified by
GST-SefinoseTM Kit, and identified by SDS-PAGE and Western blot. The results showed that the recombinant expression vector pGS-21a-DsRab
was constructed successfully, the molecular weight of the recombinant protein was in the expected line. Western blot analysis showed that the
recombinant protein can be identified specifically by the anti-GST antibody.
Key words:  Dunaliella salina DsRab GST Prokaryotic expression Purification
助于全面了解盐藻耐盐机制［3］。
小 G 蛋白（Small GTP-binding proteins）分子量
一般在 20-30 kD 之间，以单体形式普遍存在于真核
生物中，通过激活态（结合 GTP）与非激活态（结
合 GDP）的转变来行使分子开关作用，参与重要的
细胞生理活动，包括信号传导、细胞增殖、囊泡转
运、细胞骨架重组等［10，13］。Rab 蛋白是小 G 蛋白家
族（Ras、Rho、Rab、Arf/Sar 和 Ran 5 个亚家族）中
最大的亚家族，近年来在酵母、果蝇、拟南芥、烟
草、水稻等真核生物中发现的 Rab 蛋白遍布于胞内
2014年第4期 177李秀娟等 ：盐藻小 G 蛋白 DsRab 的原核表达及纯化
的各个膜区室［5，9］，在胞吞和胞吐作用中，不同的
Rab 蛋白定位于特定的细胞器膜上，参与膜泡的形
成、定向转运、锚定链接等过程［6，8］。现已发现许
多与植物的抗逆性有关的 Rab 蛋白，其表达量会受
到盐胁迫、低温、干旱等逆境条件的影响［4，7］。因此，
深入了解 Rab 蛋白功能及进一步研究植物抗逆性相
关蛋白的相互作用网络具有重要科学意义。
本实验室已从盐藻细胞中成功克隆出新的 Rab
蛋白基因 DsRab（GenBank Accession No.JN989548），
并用实时荧光定量 PCR 方法研究了 DsRab 基因在盐
胁迫下的表达情况，证明 DsRab 是一个盐诱导上调
基因［4］。本试验构建重组表达载体 pGS-21a-DsRab，
通过优化诱导表达条件使 DsRab 蛋白在上清中的表
达量增加，利用 GST-SefinoseTM Kit 纯化，获得纯度
较高的可溶性融合蛋白，为制备抗体以及进一步在
蛋白质水平上研究该蛋白在盐藻耐盐性机制中的作
用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒 大肠杆菌（E. coli）菌株 DH5α、
E. coli BL21（DE3）、 质 粒 pGS-21a 由 本 室 保 存 ；
pMD18-T Simple Vector 购自 TaKaRa 公司。
1.1.2 试剂 限制性内切酶、Taq 酶、IPTG、X-gal、
T4 连接酶购自 TaKaRa，硝酸纤维素膜、Anti-GST
Antibody、HRP-IgG、沉淀型单组分 TMB 底物溶液
购自 TIANGEN，GST-SefinoseTM Kit（BSP032-7），Pr-
estained Protein Molecular Weight Marker 购自生工生
物工程（上海）有限公司，凝胶回收试剂盒购自爱
思进生物技术有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 原核表达载体的构建 根据 DsRab 基因 cDNA
全长序列（GenBank Accession No.JN989548）设计引
物并加入酶切位点，上游引物（含 EcoR I 酶切位点）
P1 ：5-CGGAATTCATGAACCCAGAGTACGACTACC
-3，下游引物（含 Sal I 酶切位点）P2 ：5-GTCGA-
CCTAGCAGCAGGTGGAGCGG-3。以总 RNA 反转录
的 cDNA 为模板，P1，P2 为引物进行 PCR 扩增。扩
增 条 件 ：94℃ 预 变 性 5 min ；94℃ 变 性 30 s，55℃
退火 30 s，72℃延伸 1 min，35 个 循环 ；72℃延伸
9 min。扩增产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，
回收目的片段，连接到 pMD18-T simple 载体上（T-A
克隆），构建重组质粒 pMD18-DsRab，转化 E. coli
DH5α 感受态，在 Amp 抗性平板上筛选阳性单克隆。
用 EcoR I、Sal I 双酶切目的片段和 pGS-21a 质粒，
用 T4 连接酶连接，构建表达载体 pGS-21a-DsRab，
转化 E. coli DH5α 感受态，筛选阳性单克隆，交由
大连宝生物公司测序，以验证读码框的正确性。
1.2.2 融合蛋白的原核表达 将测序鉴定正确的
表 达 质 粒 pGS-21a-DsRab 转 化 E. coli BL21（DE3），
挑取阳性单克隆，接种于 5 mL 含氨苄青霉素（50
mg/L） 的 LB 液 体 培 养 基 中，37℃ 过 夜 培 养。 次
日， 按 1% 的 比 例 接 种 到 5 mL 新 的 LB 液 体 培 养
基（氨苄青霉素 50 mg/L）中，37℃振荡培养到菌液
OD600=0.6-0.8 时，试验组加入终浓度为 1 mmol/L 的
IPTG，对照组不加 IPTG，37℃诱导 6 h。离心收集
菌体，用 0.01 mol/L PBS 缓冲液悬浮，冰上超声波破
碎，4℃、12 000 r/min 离心 10 min，分离上清与沉淀，
加上样缓冲液，对上清和沉淀进行 SDS-PAGE 检测。
1.2.3 融合蛋白表达条件的优化 按 1.2.2 相同方式
过夜培养的菌液，1% 的比例转接到新的 LB 液体培
养基（氨苄青霉素 50 mg/L）中，37℃振荡培养到菌
液 OD600=0.6-0.8 时，进行分组培养 ：IPTG 终浓度梯
度为 0.1、0.2、0.4、0.8 和 1.0 mmol/L ；诱导温度梯
度为 25、28、30、35 和 37℃ ；培养 6 h。离心收集
细菌，0.01 mol/L PBS 缓冲液悬浮，冰上超声波破碎，
离心取上清，用 SDS-PAGE 检测。
1.2.4 重组蛋白的纯化 优化表达条件下，将过夜
培养的菌液按 1% 的比例接种于 100 mL 的 LB 液体
培养基（含氨苄青霉素 50 mg/L）中，37℃振荡培
养至菌液 OD600=0.6-0.8，加入终浓度为 0.1 mmol/L
IPTG 诱导表达，28℃振荡培养 6 h。4℃、8 000 r/min
离心 3 min，收集细菌，用 20 mL 0.01 mol/L PBS 缓
冲液悬浮，冰上超声波破碎，4℃、12 000 r/min 离
心 20 min，取上清并用 0.45 μm 滤膜抽滤。用 GST-
SefinoseTM Kit 纯化，SDS-PAGE 电泳检测。
1.2.5 Western blotting 检测 纯化后的融合蛋白进
行 SDS-PAGE 电 泳， 电 转 移 至 NC 膜（200 mA，2
h），用 5% 牛血清白蛋白 4℃封闭过夜，加入一抗
Anti-GST Antibody（1∶2 000），37℃ 孵 育 1 h，0.01
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期178
mmol/L PBST 洗 涤 3 次， 每 次 5 min， 然 后 加 入 二
抗 HRP-IgG（1∶200），37℃ 孵 育 1 h，0.01 mmol/L
PBST 洗涤 3 次，每次 5 min，然后加入沉淀型单组
分 TMB 底物溶液显色。
2 结果
2.1 原核表达载体的构建
经 PCR 扩增获得一条 600 bp 左右的条带（图
1-A），与预期片段大小一致。EcoR I、Sal I 双酶切
重组质粒 pGS-21a-DsRab，结果（图 1-B）表明目的
片段已与 pGS-21a 质粒正确连接，重组质粒可以用
于测序。测序结果表明扩增片段与 DsRab 基因开放
阅读框完全一致，读码框正确，原核表达载体 pGS-
21a-DsRab 构建成功。
的表达量最大（图 2-C）。在最优条件下，融合蛋白
的可溶性表达量显著增加（图 2-D）。
2000
bp
M1 1
1000
750
500
250
100
A B
5000
3000
2000
1500
bp
M2 2
1000
750
500
250
100
M1 ：DNA 2000 marker ；1 ：PCR 产 物 ；M2 ：DNA 5000 marker ；2 ：重 组 质
粒 pGS-21a-DsRab 双酶切产物
图 1 盐藻 DsRab 基因 PCR 产物（A）及重组质粒 pGS-
21a-DsRab 双酶切（B）凝胶电泳
2.2 融合蛋白的原核表达
对照组表达菌（含有空载体 pGS-21a）诱导后，
在 35 kD 左右有一条表达增强的标签蛋白条带，含
有重组质粒的表达菌诱导后在 57 kD 左右有一条明
显表达增强的条带，此条带在对照组没有出现，与
预期结果相符（融合蛋白包括预计分子量为 22 kD
的 DsRab 蛋白和 35 kD 的标签蛋白）（图 2-A）。结
果还显示，上清和沉淀均可见清晰的目的蛋白条带，
表明目的蛋白为部分可溶性表达。
2.3 融合蛋白表达条件的优化
电泳结果显示，诱导剂 IPTG 的浓度在 0.1-1.0
mmol/L 范围内，融合蛋白的表达量没有太大变化（图
2-B）。在 25、28、30、35 和 37℃ 5 个诱导温度下，
融合蛋白的表达量比较，在 28℃诱导时，融合蛋白
120
kD
M 1 2 3 4 5
85
50
35
25
20
C
120
kD
M 1 2
85
50
35
25
20
D
GST
GST-DsRab
120
kD
M 1 2 3 4
85
50
35
25
20
A
GST
GST-DsRab
120
kD
M 1 2 3 4 5 6
85
50
35
25
20
B
GST-DsRab
（A）M ：蛋白分子量标准 ；1 ：IPTG 诱导 pGS-21a 标签表达 ；2 ：未诱导
pGS-21a-DsRab 的表达 ；3 ：IPTG 诱导 pGS-21a-DsRab 上清中表达 ；4 ：IPTG
诱导 pGS-21a-DsRab 沉淀中表达 ；（B）1-6 ：IPTG 的浓度依次为 0.1、0.2、
0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol/L ；（C）1-5 ：诱导温度依次为 37、35、30、28 和
25℃ ；（D）1 ：优化条件大量培养后 pGS-21a 标签在上清中表达 ；2 ：优化
条件大量培养后 pGS-21a-DsRab 在上清中的表达
图 2 pGS-21a-DsRab 在大肠杆菌中表达的 SDS-PAGE 电
泳分析
2.4 重组蛋白的纯化及鉴定
纯化产物经 SDS-PAGE 检测，在 57 kD 左右有
单一蛋白条带，表明融合蛋白被有效纯化（图 3-A）。
Western blotting 检测（图 3-B）显示，融合蛋白能与
抗 GST 单克隆抗体特异性结合，具有良好的免疫学
活性，表明融合蛋白在 E. coli BL21（DE3）中成功
表达。
3 讨论
高盐环境下，植物对盐胁迫的应答是非常复
杂的过程，涉及一系列与抗逆性相关的信号传导过
程［6，7］。研究表明 Rab 蛋白作为一种分子开关蛋白，
分布于胞内所有的亚细胞结构，不同的 Rab 蛋白与
相应的上游调控因子和下游效应因子相互作用，参
与了胞内几乎所有的膜运输过程［12，14］。近来大量研
究报道证实有些 Rab 蛋白与植物的高盐适应性有关。
2014年第4期 179李秀娟等 ：盐藻小 G 蛋白 DsRab 的原核表达及纯化
Mazel 等［6］将拟南芥 AtRab7 在转基因植物中表达，
加速了转基因植物根、叶和原生质体中的胞吞作用，
对盐和渗透胁迫的耐受性提高。O’Mahony 等在牧
草（Sporobolus stapfianus）中发现的 sRab2 可能涉及
由植物 ABA 参与的耐旱信号的传导［13，16］。水稻在
冷冻、干旱及生长激素 ABA 存在的条件下，OsRab7
基因的 mRNA 含量呈现不同的趋势［16］；高盐胁迫下，
普通冰草 Rab5B、烟草 PgRab7、花生 AhRab7 基因
的表达量都有增加［7，15，16］。
在高度耐盐的模式生物盐藻中，有关 DsRab 蛋
白的研究鲜有报道。本实验室已经克隆得到盐藻新
基因 DsRab，并初步证明该基因与盐藻耐盐性有关［4］，
为进一步研究 DsRab 蛋白在盐藻抗盐应答中的作用，
获得高纯度的可溶性的 DsRab 蛋白是非常重要的。
本试验中融合蛋白的表达选用经典的大肠杆菌原核
表达系统，表达的融合蛋白在细胞的上清和沉淀中
均有存在，说明融合蛋白以可溶性及包涵体形式表
达。为了获得大量的可溶性蛋白，对诱导剂浓度和
诱导温度两个表达条件进行了优化。其中诱导剂
IPTG 在 0.1-1.0 mmol/L 范围内，融合蛋白表达量相
差不大，为尽可能减少包涵体形式的蛋白表达，诱
导剂的浓度越小越好。试验中的 5 个诱导温度比较，
28℃时蛋白的表达量最大。所以确定的最优表达条
件是 0.1 mmol/L IPTG，28℃，诱导培养 6 h。
本试验中纯化的可溶性 DsRab 蛋白可以用于
筛选与该蛋白可能发生相互作用的蛋白质，进一步
了解 DsRab 上下游的作用因子。为深入研究盐藻
DsRab 蛋白在抗盐方面的作用，也可以在转基因的
植物中过量表达该蛋白，检测转基因植物的高盐适
应性。这些结果，不仅为下一步制备抗体并进一步
研究 DsRab 蛋白在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基
础，而且为该类蛋白在植物抗逆中的作用提供了新
的信息。
4 结论
成功的构建了盐藻 DsRab 蛋白的原核表达载体
pGS-21a-DsRab，并在大肠杆菌 E. coli BL21（DE3）
表达体系中成功表达，优化诱导表达条件后，纯
化上清蛋白，获得了纯度较高的可溶性融合蛋白。
Western blot 初步证明该融合蛋白就是带有 GST 标签
的 DsRab 蛋白。
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M 1 2
85
50
35
25
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A
GST
GST-DsRab
120
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M 1 2
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50
35
25
20
B
GST
GST-DsRab
M ：蛋白分子量标准 ；1 ：纯化得到的标签蛋白 ；2 ：纯化得到的融合蛋白
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（责任编辑 马鑫）