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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-12-27
作者简介 : 解舒涵 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 生物表面活性剂 ; E-mail: shuhan126@163.com.cn
通讯作者 : 张玉苍 , 男 , 教授 , 博士 , 博士生导师 , 研究方向 : 天然产物资源化学 ; E-mail: zycdlcn@yahoo.com.cn
产生物表面活性剂芽孢杆菌培养条件的优化
解舒涵 何连芳 张玉苍
（1 大连工业大学 资源开发利用研究所，大连 116034 ；2 海南大学材料与化工学院，海口 570228）
摘 要： 为了提高生物表面活性剂的表面活性，通过单因素及正交试验对已筛选的产生物表面活性剂芽孢杆菌的培养基及培
养条件进行了优化，优化后的培养基成分为可溶性淀粉 20 g/L，氯化铵 2 g/L，KH2PO4 6 g/L，K2HPO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，
NaCl 2 g/L，CaCl2 0.08 g/L，EDTA 0.4 g/L。培养条件为 4%接种量，种龄 16 h，初始 pH7, 培养温度 37℃ , 摇床转速 160 r/min，发
酵 48 h。优化发酵条件后，发酵液表面张力由初始 67.5 mN/m降低至 24.8 mN/m，生物表面活性剂产量达到 1.08 g/L。
关键词： 生物表面活性剂 表面张力 芽孢杆菌 培养条件 优化
Optimization of Fermentation Conditions for Produced
Biosurfactant by Bacillus
Xie Shuhan He Lianfang Zhang Yucang
（1Institute of Resources Recycling, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034；2College of Materials and Chemical Engineering,
Hainan University, Haikou 570228）
Abstract: In order to improve the biological activity of biosurfactant, the medium and culture conditions for produced biosurfactant Baci-
llaceae were optimized by single factor and orthogonal test. The optimized medium are soluble starch 20 g/L, ammonium chloride 2 g/L, KH2PO4
6 g/L, K2HPO4 2 g/L, MgSO4·7H2O 0.3 g/L, NaCl 2 g/L, CaCl2 0.08 g/L. EDTA 0.4 g/L, Culture conditions are the 4% inoculum, seed age 16 h,
pH value 7, culture temperature 37℃ , shaking flasks speed 160 r/min, culture time 48 h. After optimization of the fermentation condition, the
surface tension of fermentation broth reduces from initially 67.5 mN/m to 24.8 mN/m, and the yield of biosurfactants reached 1.08 g/L.
Key words: Biosurfactant Surface tension Bacillus Fermentation conditions Optimization
生物表面活性剂是微生物在一定条件下产生的
集亲水性和亲油性结构于一体的代谢产物，除具有
降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等作用外，
还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、
能生物降解等优点［1, 2］。因此在食品、农业、医药、
石油化工、环保等领域得到广泛的应用［3］，尤其在
石油开采、治理石油污染方面发挥着巨大的潜力。
生物表面活性剂主要通过微生物发酵法和酶催
化法合成。产生物表面活性剂的微生物中研究的最
多的是假单胞菌和革兰氏阳性的芽孢杆菌［4］。影响
生物表面活性剂产量的主要因素有微生物菌种及发
酵条件［5］。所以高产菌株的筛选，发酵原料及条件
成为优化生物表面活性剂生产的主要因素。生物表
面活性剂的活性主要是通过测定表面张力和界面张
力的变化来表征［6］。
本研究通过单因素及正交试验对以血平板法筛
选出的产生物表面活性剂的芽孢杆菌菌株的发酵培
养基及发酵条件进行了优化，旨在提高生物表面活
性剂的活性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 筛选自大港油田被石油污染的水样，经
形态和 16S rDNA 初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus）。
1.1.2 培养基 斜面活化培养基［7］：牛肉膏 3 g，蛋
白胨 10 g，琼脂粉 20 g，去离子水，pH7.0。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期128
种子液体培养基［7］：葡萄糖 5 g，牛肉膏 3 g，
蛋白胨 10 g，MgSO4·7H2 0.2 g，去离子水，pH7.2。
液体发酵培养基 ：葡萄糖 20 g，蛋白胨 4 g，
KH2PO4 5 g，K2HPO4 5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 2 g，
CaCl2 0.08 g，EDTA 0.4 g，去离子水，pH7.0。
1.2 方法
1.2.1 种子培养 从斜面中挑取两环菌接种于装有
100 mL 种子液的 250 mL 三角瓶中，37℃，160 r/min
摇床培养 16 h。
1.2.2 发酵培养 取培养 16 h 的种子液，以 5% 的
接种量接种于装有 100 mL 发酵液的 250 mL 三角瓶
中，37℃，160 r/min 摇床培养 48 h。
1.2.3 表面张力的测定 采用环法测定发酵液表面
张力，取一定量的发酵液 10 000 r/min 离心 20 min
取上清液，测定其表面张力。
1.2.4 菌体浓度的测定 采用比色法［8］（OD600），取
8 mL 发酵液，在 6 000 r/min 离心 20 min，用同体积
的去离子水均匀悬浮沉淀的菌体，稀释至一定倍数
后，在 600 nm 测定光密度。
1.2.5 生物表面活性剂的定量 发酵液于8 000 r/min，
10 min 去菌体，用盐酸将上清液 pH 值调至 2.0，得
到絮状沉淀，4℃静置过夜，再离心收集沉淀，经减
压蒸干后准确称量［9］。
2 结果
2.1 培养基的优化
2.1.1 碳源的选择 取 20 g/L 的葡萄糖、可溶性淀
粉、甘油、橄榄油和石蜡作为碳源。液体发酵培养
基的初始表面张力值及发酵后表面张力值和菌体生
长见图 1。
由图 1 可知，其中以可溶性淀粉为碳源发酵液
图 1 培养基碳源的选择
初始表面张力为 64.7 mN/m，发酵 48 h 后表面张力
降低到最低 29.4 mN/m，变化率为 54.6%，表面张力
变化率最大，菌体生长次于以甘油为碳源。以葡萄
糖和甘油为碳源，变化率为 44.1% 和 37.9%。所以
可溶性淀粉为最佳碳源。
2.1.2 氮源的选择 取 4 g/L 的豆粕、蛋白胨、尿素、
硫酸铵和氯化铵为氮源。液体发酵培养基的初始表面
张力值及发酵后表面张力值和菌体生长见图 2。
图 2 培养基氮源的选择
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由图 2 可知，以氯化铵和尿素为氮源的液体发
酵培养基发酵液初始表面张力分别为 63.8 mN/m 和
60.3 mN/m，发酵 48 h 后表面张力分别降低到 28.8
mN/m 和 28.2 mN/m，变化率为 54.9% 和 53.2%。菌
体生长以尿素为氮源优于氯化铵。以蛋白胨为氮源
变化率为50.9%。以豆粕为氮源利用较慢，变化率低。
以表面张力变化率和成本考虑，选择氯化铵为最佳
氮源。
2.1.3 可溶性淀粉浓度的确定 以可溶性淀粉为最
佳碳源，分别在液体培养基中添加 10、20、30、40
和 50 g/L 的可溶性淀粉。液体发酵培养基初始表面
张力值及发酵后表面张力值和菌体生长如图 3 所示。
图 3 可溶性淀粉浓度对表面张力和菌体浓度的影响
由图 3 可知，当添加 20 g/L 的可溶性淀粉时，
发酵液初始表面张力为 64.1 mN/m，发酵 48 h 后表
面张力降低到最低 28.7 mN/m 变化率为 55.2%，表
面张力为最低值，变化率最大，菌体生长优于其他
浓度，当可溶性淀粉浓度为 10 g/L 提供菌体前期生
长，较快利用。当可溶性淀粉浓度为 40 g/L 和 50 g/L
由于浓度较高抑制了菌体生长，变化率低于其他浓
度，所以取 20 g/L 的可溶性淀粉为最佳碳源浓度。
2.1.4 氯化铵浓度的确定 以氯化铵为最佳氮源，
分别在液体培养基中添加 1、2、4、8 和 16 g/L 的氯
化铵。液体发酵培养基的初始表面张力值及发酵后
表面张力值和菌体生长见图 4。
图 4 氯化铵浓度对表面张力和菌体浓度的影响
由图 4 可知，当氯化铵浓度为 2 g/L 时，发酵液
初始表面张力为 66.2 mN/m，发酵 48 h 后表面张力
降低到 27.6 mN/m，变化率为 58.3%，表面张力为最
低值，变化率最大，菌体生长优于其他浓度，所以
取 2 g/L 氯化铵为最佳氮源浓度。
2.1.5 磷源浓度的确定 以 KH2PO4∶K2HPO4按1 1
混合作为磷源，分别在液体培养基中添加 6、8、10、
12 和 14 g/L 的磷源。液体发酵培养基的初始表面张
力值及发酵后表面张力值和菌体生长如图 5 所示。
由图 5 可知，当磷源浓度为 8 g/L 时，发酵液初
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始表面张力为 67.4 mN/m，发酵 48 h 后表面张力降
低到 27.1 mN/m，变化率为 59.8%，表面张力为最低
值，变化率最大，菌体生长较好，所以取 8 g/L 为最
佳磷源浓度。
2.1.6 NaCl 浓度的确定 在液体培养基中添加 1、
2、4、8 和 16 g/L 的 NaCl，液体发酵培养基的初始
表面张力值及发酵后表面张力值和菌体生长如图 6
所示。
图 5 KH2PO4 K2HPO4浓度对表面张力和菌体浓度的影响
图 6 NaCl浓度对表面张力和菌体浓度的影响
由图 6 可知，当添加 2 g/L 的 NaCl 时，发酵
液初始表面张力为 67.5 mN/m，发酵 48 h 后表面
张力降到最低 27.0 mN/m，变化率为 60.0%，且
菌体生长优于其他浓度。当添加 8 g/L 和 16 g/L
的 NaCl 时仍使液体发酵培养基表面张力降低到
28.6 mN/m 和 30.4 mN/m。不同盐浓度对表面张力
及菌体生长影响较小 , 取 2 g/L 的 NaCl 为最佳盐
浓度。
2.1.7 MgSO4 浓度的确定 在液体培养基中添加
0.1、0.2、0.3、0.4 和 0.5 g/L 的 MgSO4，液体发酵培
养基的初始表面张力值及发酵后表面张力值和菌体
生长如图 7 所示。
图 7 MgSO4浓度对表面张力和菌体浓度的影响
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由图 7 可知，当取 0.3 g/L 的 MgSO4 时，发酵液
初始表面张力为 67.3 mN/m，发酵 48 h 后表面张力
降到最低 26.2 mN/m，变化率为 61.1%，表面张力为
最低值，变化率最大，且菌体生长优于其他浓度。
取 0.3 g/L 的 MgSO4 为最佳浓度。
2.2 培养条件的优化
2.2.1 最适接种量的确定 分别取 3%、4%、5%、6%
和 7% 的接种量接种于液体发酵培养基中，37℃发
酵 48 h。液体发酵培养基发酵后表面张力值和菌体
生长如图 8 所示。
图 8 接种量对表面张力和菌体浓度的影响
由图 8 可知，当取 4% 的接种量时 , 初始表面张
力 67.4 mN/m，发酵 48 h 后降低到 25.2 mN/m，变化
率为 62.6%，表面张力为最低值，变化率最大，菌
体生长优于其他接种量。取 4% 为最佳接种量。
2.2.2 最适种龄的确定 分别取培养 14、15、16、
17 和 18 h 的种子液，以 4% 的接种量接种于液体发
酵培养基中，37℃发酵 48 h。液体发酵培养基发酵
后表面张力值和菌体生长如图 9 所示。
图 9 种龄对表面张力和菌体浓度的影响
由图 9 可知，当接种 16 h 的种子液时，菌体生
长进入稳定期，初始表面张力 67.3 mN/m，发酵 48 h
后降低到 24.9 mN/m，变化率为 63.0%。表面张力为
最低值，变化率最大，菌体生长较好。取 16 h 为最
佳种龄。
2.2.3 最适 pH 的确定 将培养 16 h 的种子液以
4% 的接种量，分别接种于 pH4、pH5、pH6、pH7
和 pH8 的液体发酵培养基中，37℃发酵 48 h。液体
发酵培养基发酵后表面张力值和菌体生长如图 10
所示。
由图 10 可知，当取 pH7 液体发酵培养基，初
始表面张力 67.4 mN/m，发酵 48 h 后，降低到最低
24.8 mN/m，变化率为 63.2%，表面张力变化率最大，
且菌体生长较好。pH4 和 pH5 发酵液过酸不适宜菌
体生长，变化率低，取 pH7 为最适 pH。
2.2.4 最适温度的选择 将培养 16 h 的种子液以
4% 的接种量，加入 pH7 的液体发酵培养基中，分
别在 28℃、31℃、34℃、37℃和 40℃下培养，发酵
48 h。液体发酵培养基发酵后表面张力值和菌体生
长如图 11 所示。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期132
由图 11 可知，当在 37℃中培养时，液体发酵
培养基初始表面张力 67.3 mN/m，发酵 48 h 后降低
到 24.8 mN/m，变化率为 63.2%，表面张力为最低值，
变化率最大，菌体生长优于其他培养温度。故 37℃
为最佳培养温度。
2.2.5 最适摇床转速的选择 将培养 16 h 的种子液
以 4% 的接种量，加入 pH7 的液体培养基中，发酵
温度 37℃。分别在 120、140、160、180 和 200 r/min
摇床转速下，发酵 48 h。液体发酵培养基发酵后表
面张力值和菌体生长如图 12 所示。
图 11 培养温度对表面张力和的菌体浓度影响
图 12 摇床转速对表面张力和菌体浓度的影响
由图 12 可知，当在 160 r/min 的转速下，初始
表面张力 67.5 mN/m，发酵 48 h 降低到 24.8 mN/m，
变化率为 63.2%，表面张力为最低值，变化率最大。
取 160 r/min 为最佳摇床转速。
2.3 正交试验
采用可溶性淀粉（A），KH2PO4 K2HPO4（B），
接种量（C），pH 值（D）四个因素进行 L9（34）正
交试验设计。见表1，对菌株发酵培养条件进行优化。
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正交试验结果与极差分析见表 2，方差分析结
果见表 3，影响表面张力大小的主要因素是 pH，影
响因素的主次顺序为 D>A>B>C，正交试验得出的优
化发酵条件为 A3B3C1D3，即 pH7，可溶性淀粉 20 g，
KH2PO4 K2HPO4 为 3 1，接种量 4%。以优化后的
结果为培养条件发酵 48 h，发酵液表面张力由初始
67.5 mN/m 降低至 24.8 mN/m，变化率为 63.3%，表
面活性剂产量达到 1.08 g/L。
3 讨论
生物表面活性剂的合成受培养基碳、氮源，pH
值，盐浓度，离子强度，接种量，菌龄等因素影响。
培养条件的优化有利于生物表面活性剂的合成从而
提高其活性。通过优化试验结果可知，碳、氮源是
生物表面活性剂合成的重要因素。以葡萄糖为底物
次于可溶性淀粉，可能由次级代谢产物如糖醛酸的
表 1 正交试验因素水平表
水平 A 可溶性淀粉（g/L） B（KH2PO4 K2HPO4） C 接种量（%） D （pH 值）
1 10 1 3 4 6.0
2 15 1 1 5 6.5
3 20 3 1 6 7.0
表 2 正交试验结果
试验 A B C D 表面张力值（mN/m）
1 1 1 1 1 49.6
2 1 2 2 2 37.2
3 1 3 3 3 27.4
4 2 1 2 3 26.7
5 2 2 3 1 48.9
6 2 3 1 2 32.4
7 3 1 3 2 35.0
8 3 2 1 3 24.8
9 3 3 2 1 46.3
K1 114.2 111.3 106.8 144.8
K2 108.0 110.9 110.2 104.6
K3 106.1 106.1 111.3 78.9
R 8.1 5.2 4.5 65.9
表 3 正交试验结果方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F 比 F 临界值 显著性
A 11.962 2 5.981 9.000
B 5.582 2 2.791 9.000
C 3.669 2 1.835 9.000
D 735.482 2 367.741 9.000 *
误差 200.46 2
产生引起 pH 值的减少产生了抑制作用［10］，以石蜡
为碳源表面张力变化较低，可能菌体生长受到烷烃
碳链长度的影响，细菌以通常的摄取机制对其摄取
利用，不需要表面活性剂的中介作用［11］。菌体能较
好的利用氯化铵合成生物表面活性剂，表面张力变
化较大，菌体虽然能在有机氮源中生长较好，但表
面张力变化较低。较高的盐浓度对表面张力及菌体
* 表示 P<0.05
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期134
生长影响较小 , 并且在 40℃下仍保持较低的表面张
力，本研究表明该菌株具有较好的耐盐性和耐温性。
通过方差分析可见，pH 为显著因素。不同 pH 对菌
体生长影响较大，从而影响菌体次级代谢产物，即
生物表面活性剂的合成。
4 结论
通过对采自大港油田被石油污染的水样中筛选
出的产生物表面活性剂芽孢杆菌发酵条件的优化，
确定了用可溶性淀粉为碳源、用氯化铵为氮源、用
KH2PO4 K2HPO4（3 1）混合物为磷源的发酵培养基；
通过测定表面张力的变化表征了生物表面活性剂的
活性，优化了菌种培养条件，确定该菌株在高盐和
较高温下仍使发酵液保持较低的表面张力，其优良
的特性在微生物采油中提高石油采收率方面必将显
现出良好的应用价值。

参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）