全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
甲型流感病毒是正黏病毒科有囊膜的单股负链
RNA 病毒，其基因组有 8 个 RNA 片段，分别编码
病毒复制循环中必需的结构蛋白及非结构蛋白。根
据病毒表面糖蛋白的不同，甲型流感病毒可以分为
16 种 HA 亚型（H1-H16）以及 9 种 NA 亚型（N1-N9），
可感染多种宿主，包括禽、猪和人等［1］。从 1878
年流感发现于意大利至今，全球性的流感大流行已
出现多次，给公共卫生安全造成极大的威胁 ；1918
年暴发的西班牙流感（H1N1），造成近 4 000 万人
死亡 ；1957 年的亚洲流感（H2N2）和 1968 年的香
港流感（H3N2），均造成了近百万人死亡 ；2003 年
12 月，高致病性 H5N1 禽流感横扫亚洲多国家禽养
殖业，造成极大的经济损失 ；2009 年暴发的猪流感
（H1N1），共在 208 个国家得到确诊，累计 1.8 万人
收稿日期 ：2014-04-09
基金项目 ：河南省科技厅基础与前沿技术（122300410135）
作者简介 ：韩庆功，男，讲师，硕士，研究方向 ：动物传染病的诊断与防治 ；E-mail ：hanqinggong7606@163.com
RNAi 技术在抗甲型流感病毒中的研究进展
韩庆功  郑玉姝
（河南科技学院动物科学学院，新乡 453003）
摘 要 ： RNAi 技术广泛应用于防治人类多种疾病病原的药物和疫苗开发中，并取得了巨大的成果。流感病毒极易发生抗原
漂移和抗原转变，这给抗流感病毒药物和疫苗的研制提出很大的挑战。RNAi 技术的出现给流感的防治提供了新的思路。对近年来
国内外利用 RNAi 技术开发抗流感病毒药物和新型流感疫苗研究现状及前景进行综述，以期为流感的综合防治研究提供参考。
关键词 ： 流感病毒 RNA 干扰 siRNA miRNA 复制 疫苗
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.009
Research Advance of RNAi in Anti-influenza Virus
Han Qinggong Zheng Yushu
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003）
Abstract: The RNAi technology has been widely used in drug and vaccine development of the prevention and treatment of various kinds
of human diseases pathogeny,and has made great achievements.Antigenic drift and antigenic shift extremely easily occurred in influenza virus,
which had put forward a bigchallenge for the development of anti-influenza virus drugs and vaccines.The appearance of RNAi technology gived
good ideas for the prevention and control of influenza.This paper summarized the research status and prospects of using RNAi technology to
develop anti-influenza virus drugs and new influenza vaccine at home and abroad in recent years, in order to provide references for the research
for the prevention and control of influenza.
Key words: Influenza virus RNA interference siRNA miRNA Replication Vaccine
死亡 ；2013 年 3 月 31 日中国报道了全球第１例人
感染 H7N9 病例，这是全球首次发现的由新亚型流
感病毒引起人的一种急性呼吸道传染病，新型禽流
感病毒再次引起人们的关注。截至 2014 年 2 月 4 日
共报告 286 例人感染 H7N9 禽流感病例，其中 60 例
死亡。张宝等通过序列分析揭示新型 H7N9 病毒的
来源和重组产生模式，推测出此次 H7N9 病毒流行
至少由 5 个病毒经过 4 次重组产生，产生两个主要
流行株 A 和 B 型［2-4］。21 世纪以来流感病毒流行爆
发的这些新特点引起了世界各国的高度重视，也给
流感病毒科研工作者提出了更严峻的挑战。
目前流感病毒防治主要依靠药物及疫苗，药物
主要包括离子通道 M2 阻滞剂和神经氨酸酶抑制剂
等化学药，但抗流感病毒药物的长期应用可能产生
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期56
耐药性病毒株。而流感疫苗不仅开发周期长，而且
不能保护所有亚型的流感病毒感染，在一定程度上
也限制了抗流感病毒爆发的效果。RNAi 技术的出现
为抗病毒研究提供了新思路，为病毒病的治疗提供
了一种新的选择。近年来利用 RNAi 技术研究如何
抗流感病毒成为热点。
1 RNA 干扰机制
RNAi（RNA interference，RNAi） 是 高 度 特 异
的在 mRNA 水平上的基因沉默机制，由内源性或外
源性 dsRNA（Double-stranded RNA，dsRNA）诱发。
dsRNA 在细胞内被切割成 21-25 nt 干扰性小 RNA
（Small interfering RNA，siRNA），siRNA 介 导 识 别
并靶向切割同源性靶 mRNA 分子，从而导致该基因
不表达。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发
现的一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA，其
大小长约 20-25 个核苷酸。成熟的 miRNAs 是由较
长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产
生的，随后组装进 RNA 诱导的沉默复合体，通过
碱基互补配对的方式识别靶 mRNA，并根据互补程
度的不同指导沉默复合体降解靶 mRNA 或者阻遏靶
mRNA 的翻译。由于 RNAi 能特异性地抑制基因表达，
所以可用于流感病毒感染的治疗及预防［5］（图 1）。
2 RNAi 抗 A 型流感病毒感染的策略
2.1 siRNA靶向病毒mRNA抗流感病毒感染
因为 RNA 病毒基因组都比较小，RNA 病毒基
因几乎都在病毒复制过程中发挥重要作用，理论上
沉默病毒中的任何一个基因都可以抑制病毒的繁殖。
流感病毒为分节段 RNA 病毒，其基因组存在高突变
和基因重排的特征并因此产生多达 15 种 HA 和 9 种
NA 亚型，而且每种亚型还拥有众多的病毒株，这给
病毒的防治带来巨大的挑战。鉴于上述情况抗流感
病毒 siRNA 的设计一般基于以下几点考虑 ：（1）由
于基因组 RNA 为 NP 蛋白所包被，因此 siRNA 优
选靶向病毒 mRNA 而非基因组 RNA ；（2）为减少
基因漂移和基因重排的影响，siRNA 靶向 mRNA 高
度保守区，这样可以同时抑制不同亚型的病毒复
制［6］。目前科研人员已经能够设计出靶向流感病毒
多个病毒株或多个基因的广谱 siRNA 药物［7-9］。例
如，Sirnaomics 公司开发的 STP702 即同时对 H5N1、
H1N1 及 H3N2 型流感病毒有效，虽然该药物仍然没
有进入市场获得检验，但其思路值得肯定。
2.2 靶向病毒svRNA抗流感病毒感染
甲型流感病毒包含 8 个单体 RNA 片段，每个片
段都有两个任务 ：通过转录过程制造蛋白 ；通过复
制过程制造出新的病毒片段。因为每个单体必须执
行两个功能，病毒必须让某一个过程优先完成，先
转录然后再开始复制。 最近，西奈山医学院微生物
学家 tenOever BR 使用超高通量测序技术首次找到了
甲型流感病毒中的一种 svRNA，并确定它就是控制
病毒从转录过渡到复制的“开关”。在 H1N1（Influenza
A/PR/34） 感 染 的 肺 上 皮 细 胞 中，90% 以 上 的 小
RNAs 是细胞 miRNAs，约 0.12% 直接来源于流感病
毒，而在这些直接来源于流感病毒的小 RNA 中约
有 30% 为 svRNAs（Virus-encoded short vRNAs），由
病毒 RNA 编码，长度为 22-27 nt，这些 svRNAs 可
能通过与病毒聚合酶的相互作用调控病毒的转录和
复制［10，11］。Umbach 等［12］采用同样的方法分析这
些病毒 RNA 编码的 svRNAs，也证明了他们的存在。
虽然这些 svRNA 的作用机制和功能仍有待进一步研
图 1 RNAi 途径［5］
shRNA
Nucleus
Cytoplasm Exportm 5
Pre-miRNA
Pre-miRNA
Pre-miRNA
Dicer
miRNA
mRNARISCAgo2
mRNA
RISC
Ago2
mRNA degradation
siRNA
Drosha
2014年第12期 57韩庆功等：RNAi 技术在抗甲型流感病毒中的研究进展
究，但是其可能成为抗流感病毒的新靶标，或者本
身就是抗流感病毒的候选药物。值得一提的是在流
感病毒中，svRNA 始终如一地位于病毒 RNA 片段之
间，并且在每种流感病毒中都出现。这个发现意味
着或许人们可以通过抑制 svRNA 影响病毒的复制过
程，并最终研制出一种广谱流感病毒 RNA 药物。
2.3 siRNA靶向细胞mRNA抗流感病毒感染
流感病毒自身只编码 11 个蛋白，却可以在禽类
和哺乳动物众多宿主内复制，这是由于其利用了宿
主细胞的众多功能。RNAi 技术成为筛选宿主基因组
中的病毒复制相关基因的有力工具，研究表明宿主
细胞通路中大量蛋白参与流感病毒复制过程［13］。因
此，另一种利用 RNAi 抗流感病毒的方法是下调宿
主细胞功能基因，因为宿主基因的突变率非常低，
所以用这种方法抗流感病毒可以减少耐药病毒株的
出现，而缺点是干扰正常的细胞通路可能带来一些
副作用［14］。近几年随着基因组高通量筛选 siRNA 技
术的发展应用，科研人员筛选出一系列流感病毒感
染相关基因及其通路［15-17］。这些研究表明诸多宿主
细胞基因在流感病毒复制中发挥重要作用。例如，
SON、CLK1、ATP6V0D1、COPG、eIF4A3、FGFR，
GSK3-β 及 CAMK2B 等。 其 中 包 括 流 感 病 毒 生 长
的一些基本元件，如 nuclear export factors NXF1 和
XPO1。靶向这些基因的 siRNA 在体内试验中均表现
出抗病毒特性。因此，利用 siRNA 下调宿主基因不
失为一种抗流感病毒新的候选策略。
2.4 靶向细胞miRNA抗流感病毒
MicroRNA（miRNA）是一类调控基因转录和翻
译的小型非编码 RNA。作为转录后基因调控因子，
miRNA 在各种不同的基本生理活动和疾病中发挥作
用。2010 年，研究发现，miRNA 作为关键的效应
分子在宿主与病原相互作用中发挥重要功能。细胞
miRNA 不仅对病毒的复制具有正负调控作用，而且
能够通过改变细胞基因表达建立起抗病毒免疫防御
反应［18］。显然，研究与流行病和致命性流感病毒有
关的特定的 microRNA 将有助于开发新的抗病毒治
疗方法，减少出现病毒耐药的风险。
2.4.1 miRNA 调控免疫反应 在动物和其他脊椎
动物中，宿主编码的 miRNA 参与调节了内在的和
适应性的免疫应答。美国西北大学的研究团队利用
miRNA 表达谱芯片分析表明一些内源性的 miRNA
在两种甲型流感病毒侵染后出现明显的积聚，这些
miRNA 包 括 miR-7、miR-132、miR-146a、miR-187、
miR-200c 和 miR-1275［19］。研究表明甲型流感病毒
侵染后是通过一个次级应答通路启动初始体 miRNA
转录。基因表达谱分析发现这些 miRNA 靶向的 26
个基因（mRNA），包括 IRAK1，MAPK3 和其他先
天免疫信号系统的组成成员。Lam 等［20］的研究也
表明禽流感病毒扰乱了宿主 miRNA 表达，病毒感
染 后 miR-21*、miR-100*、miR-141、miR-574-3p、
miR-1274a 和 miR1274b 表达改变。其中高表达 miR-
141 能抑制细胞因子-转化生长因子（TGF-β2D）表
达，而 TGF-β2 能够吸引和调控炎症因子，这种改变
决定了感染的严重性。国内吉林大学研究团队也发
现流感病毒侵染细胞中，miRNA 和 Bcl-2 家族抗凋
亡因子蛋白之间存在相互联系。分析发现一些和细
胞凋亡有关的 miRNA 在甲型流感病毒侵染的 A549
细胞中被激发，其中 miR-29c 有明显上调并介导了
BCL2L2 表达抑制和引起细胞凋亡［21］。上述研究都
表明任何 miRNA 都具有潜在的抗病毒作用，从而成
为机体防御病毒感染的关键一环。
2.4.2 miRNA 影响病毒复制 流感病毒复制依赖宿
主基因表达，因此通过 miRNA 调控宿主基因也会影
响病毒的复制能力。Ma 等［22］发现宿主 microRNA
let-7c 能 抑 制 人 肺 表 皮 细 胞 感 染 H1N1 病 毒 的 M1
蛋 白 表 达， 从 而 抑 制 病 毒 复 制。Song 等［23］ 也 发
现 miRNA 323（（miR-323），miR-491 和 miR-654 靶
向 PB1 基因的同一保守区并抑制 H1N1 流感病毒
的复制。Song 等［24］研究感染 H1N1 流感病毒患者
的外周血单核细胞的 miRNA 变化后发现有多达 41
种 miRNA 发现变化。其中 miR-31、miR-29a、miR-
148a 变化显著，并直接影响细胞内多个重要通路和
关键基因。此外，Wang 等［25］综合分析禽流感病毒
感染的鸡肺部 miRNA 及其靶基因的变化发现，gga-
miR-34a、122-1、122-2、146a、155、206、1719、
1594、1599 和 451 发生了显著变化。哥伦比亚大学
研究者分析了调控猪流感 H1N1 病毒大流行和高致
病性禽流感 H7N7 的两类不同 microRNA 发现，有
一小类 microRNA 同时调节这两种病毒感染，靶向
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这些 miRNA 可能开发出潜在的广谱抗流感病毒药
物［26］。因此这些 miRNA 成为潜在的抗病毒治疗靶标。
3 RNAi 在流感疫苗开发和生产中应用
3.1 利用miRNA技术提高流感病毒疫苗生产能力
利用传代细胞 MDCK 和 vero 细胞生产流感疫苗
在近年得到快速发展，但野生型流感病毒和鸡胚疫
苗毒株在这些细胞中不能有效繁殖影响了流感疫苗
的生产能力，也极大地限制了针对流感病毒的防治。
因此，开发新型疫苗毒株和基于细胞生产流感病毒
疫苗需提高病毒的生长滴度。RNAi 技术为人们提高
疫苗的生产能力提供了一条新的可行性途径。
2011 年，RNAi 先驱 Alnylam 制药公司就与葛
兰素史克（GSK）公司合作，他们利用 RNA 干扰
（RNAi）技术构建的重组疫苗株同时具有定向沉默
某些特意基因的作用，从而抑制或提高流感病毒的
繁殖与复制能力。将该重组疫苗株应用于细胞培养
技术生产流感疫苗时，可实现增加疫苗生产过程中
病毒滴度，从而提高疫苗生产能力［27］。最近日本
的科研人员也在此方面取得了令人兴奋的进展，通
过筛选与 I 型干扰素途径密切相关的 78 个靶基因
并设计其 shRNA 序列，采用 RNAi 技术敲除相关基
因后发现有 23 个候选基因敲除后能增强流感病毒
A/Puerto Rico/8/1934 在 A549 细胞中的繁殖能力。二
次筛选后发现，敲除 IRF7 后能显著抑制 IFN-a/b 产
生，MDCK 细胞中病毒滴度显著增加。因此他们认
为用 RNAi 技术敲除 IRF7 基因后能使疫苗的生产能
力得到提高。值得一提的是，该技术还将有益于从
临床标本中更容易的分离出疫苗病毒株［28］。
3.2 应用microRNA 靶向性调控能力开发减毒疫苗
MicroRNA 转录后小分子调节物还可以用于调节
病毒载体的靶向性。因为 miRNA 主要通过 5 端的
前 2-8 个核苷酸的种子序列（Seed sequence）识别
mRNA 3 端非翻译区（3UTR）来实现在转录后水平
上调节基因的表达，所以将含有特定 microRNA 靶
向元件（miRNA target element，miRTE）的靶盒置于
目的基因或病毒载体关键元件的 3UTR 区，就能通
过内源性的 microRNA 来调控目的基因的表达，达
到在转录后水平上调节病毒载体的靶向性［29-31］。最
近几年，流感活体疫苗因能激活免疫系统的全部元
件，成为竞相开发的热点。利用 microRNA 靶向元
件消除病毒副作用为开发具有组织特异性的活体减
毒疫苗提供了一条新途径。如果在病毒基因组中插
入宿主 miRNA 的靶序列，在病毒感染宿主细胞的复
制增殖过程中，miRNA 与病毒 RNA 上的靶序列结
合，抑制病毒 RNA 的翻译和病毒的增殖，从而导致
减毒，这就是 miRNA 介导的病毒减毒策略。由于其
基于机体中固有的 miRNA 与人工插入病毒基因组的
靶序列互补而介导的翻译抑制，所以此途径适用于
各种亚型流感病毒减毒株的构建。miR-93 是哺乳动
物机体内普遍存在的一种 miRNA，在人和鼠成纤维
细胞中的表达是保守的。基于这一特征，Perez 等［32］
通过点突变的方法在流感病毒核衣壳蛋白保守区引
入 miR-93 靶序列，分别获得 H1N1 和 H5N1 亚型流
感病毒减毒株。这些减毒株即使高滴度接种小鼠，
仍不能使小鼠致病。同时，减毒株免疫原性良好，
接种小鼠后可诱导高水平的体液免疫应答，对野毒
株的攻击产生完全的免疫保护。更重要的是，由于
miR-93 在鸡胚中含量极低，减毒株在鸡胚中的增殖
不受抑制，其生长特性与野毒株相同，因此仍能采
用鸡胚培养的方式大量制备。这种方法还可以与现
有的冷适应流感病毒活疫苗合并使用以进一步增强
减毒性疫苗的安性性，减少从实验室逃逸出高传染
性流感病毒的几率。
3.3 利用miRNA技术提高流感病毒疫苗效价
人类基因组中有超过 30% 的基因受 miRNA 所
调控，包括一些重要的免疫相关基因。因此人工利
用这些 miRNA 的 RNA 干扰效应进行抗病毒是重要
的研究领域，而如何在体内有效传输这些 RNA 小分
子到特定细胞群体中是目前的科研瓶颈。澳大利亚
的研究人员发现细胞因子信号转导抑制因子（SOCS）
作为重要的细胞因子调控子在主动免疫中发挥重要
的作用，而 miR-155 在体内直接靶向 SOCS 而促进
不同的 T 细胞亚群增值，因此他们利用反向遗传工
程使重组流感病毒表达 miR-155 并侵染细胞调控机
体免疫机能，该研究为开发更强免疫效价的流感疫
苗奠定了基础。Perez 团队也成功将 has-miR-142 发
夹结构插入流感病毒 NS 基因，重组病毒不仅保持复
制能力还能在感染细胞中表达功能性 has-miR-142。
2014年第12期 59韩庆功等：RNAi 技术在抗甲型流感病毒中的研究进展
流感病毒是 RNA 病毒，其感染局限于呼吸道，基因
整合进宿主的风险也比 DNA 病毒载体低。鉴于流感
病毒减毒疫苗已在临床上证明是安全可靠，Perez 认
为用流感减毒株来作为载体递送 RNA 药物治疗呼吸
系统疾病不仅高效而且低毒［33］。
4 RNAi 技术抗流感病毒的优点及存在挑战
siRNA 治 疗 比 常 规 化 学 药（ 如 Tamiflu 和
Relenza） 具 有 某 些 优 势［34］。 首 先，siRNA 药 物
可以快速合成和规模化制备 ；其次，当病毒对特
定 siRNA 产生抗性时，可以立即更换靶向病毒的
siRNA 序列 ；第三，即便 siRNA 药物的序列不同，
但是其合成方法和工艺完全相同 ；第四，许多抗流
感病毒药物活性有机成分水溶性差，而 siRNA 极
易溶于水，易于药物输送［35］。然而，抗流感病毒
siRNA 在临床上也面临挑战，其中首要问题即如何
有效传输 RNA 药物至呼吸道。近年来国内外学者
利用脂质体传输 siRNA 治疗流感病毒取得了一些成
果，但是这些方法仍存在一定的缺点，不能有效传
输到呼吸道表皮细胞［36］。因此国内外学者在脂质
体之外又开发出了多种不同的 siRNA 传输方法。慢
病毒介导的 RNAi 具有转移基因效率高，作用持久
稳定等特点，成为基因治疗和基因功能研究的重要
工具。田进等［37］利用慢病毒表达靶向禽流感病毒
PA、NP 和 PB2 多个基因，成功抑制了病毒的复制。
刘文博等［38］利用减毒鼠伤寒沙门氏菌表达禽流感
病毒特异性 siRNA，体内试验表明其可以产生功能
性 siRNA，并对机体形成一定的保护力。
5 结语
甲型流感病毒感染是动物病毒性传染病，不仅
给养殖畜牧业造成巨大的经济损失，而且严重威胁
人类公共卫生安全。虽然目前已开发多种疫苗和抗
病毒药物，对流感病毒的防治起到很大促进作用 ；
但是流感病毒变异极快，如何有效控制疾病仍然是
摆在流感病毒科研工作人员面前的巨大挑战，这促
使人们不断寻求新的防控途径。RNAi 的发现改变
了人们对细胞基因调控的传统思路，提供了特异性
阻断基因表达的新工具为抗流感病毒开辟了新领域。
尽管其机制仍未完全弄清，但 RNAi 技术由于其特
异性、稳定性、高效性、靶基因位点的高选择性等
突出优势，为流感病毒等流行性疾病提供了新的治
疗方案。目前 RNAi 在各方面的研究日新月异，可
以预见随着 RNAi 技术的逐步应用，其将在人类防
控或消灭甲型流感病毒过程中发挥巨大作用。
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（责任编辑 狄艳红）