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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
简 单 序 列 重 复 区 间 扩 增 多 态 性（Inter-simple
sequence repeats，ISSR）是在微卫星分子标记（SSR）
基础上创建的一种分子标记［1，2］。该技术无需预
先克隆和测序，兼有 RAPD 技术与 SSR 技术优点
于一身，成本低、操作简单、灵敏度高、检测基因
组的多态性强。目前已在生物的种质鉴定、遗传多
样性检测、基因定位及遗传图谱等方面得到广泛的
应用［3］。
海南木莲（Manglietia hainanensis Dandy）是木
兰科木莲属植物，主要分布于海南省的乐东、保亭、
琼中等市县，是海南岛的乡土树种之一，属国家三
级保护植物种［4］。该树种为常绿乔木，树形优美、
收稿日期 ： 2013-03-18
基金项目 ：国家林业公益行业科研专项子项目（200804001）
作者简介 ：魏小玲，女，硕士研究生，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：csftu-wxl@163.com
通讯作者 ：曹福祥，男，教授，博士生导师，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：csfucao@163.com
海南木莲遗传多样性的 ISSR 及亲缘关系的分析
魏小玲  曹福祥  陈建
（中南林业科技大学，长沙 410004）
摘 要 ： 将简单重复序列区间扩增多态标记（inter-simple sequence repeats，ISSR）技术应用于海南木莲 4 个种群的 36 份样
品的遗传多样性分析，10 个引物共扩增出 106 条条带，其中有 87 条多态性条带，多态位点百分率（PPB）为 82.08%。4 个种群的
海南木莲等位基因数（Ne）的变异幅度为 1.416 6-1.625 7，Nei’s 基因多样性指数（H）的变异幅度为 0.222 8-0.339 2，Shannon 信
息指数（I）的变异幅度为 0.315 1-0.491 0，种群间的分化系数（Gst）为 0.197 1，由遗传一致度进行了 4 个种群的 UPGMA 聚类。
关键词 ： 海南木莲 ISSR 遗传多样性 亲缘关系
Studies on the Genetic Diversity and Relationship of Manglietia
hainanensis Dandy by ISSR
Wei Xiaoling Cao Fuxiang Chen Jian
（Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）
Abstract:  Inter-simple sequence repeat（ISSR）technique was applied to detect 4 populations and 36 samples of Manglietia hainanensis
Dandy，and 106 bands were amplied by 10 primers，including 87 polymrphic bands. The polymorphic percentage is 82.08%. The variation
range of alleles per locus（Ne）was 1.416 6-1.625 7 ；variation range of Nei’s gene diversity（H）was 0.222 8-0.339 2 ；variation range of
shannon’s information index（I）was 0.315 1-0.491 0 ；coefficient of gene differentiation（Gst）of the 4 populations was 0.197 1. Based on
the genetic identity，dendrogram of 4 populations was constructed by UPGMA.
Key words:  Manglietia hainanensis Dandy ISSR Genetic diversity Relationship
花大芬芳，并具有药用、芳香、木材等多种经济价
值。木莲属（Manglietia）植物是现存木兰科植物中
最原始的类群，也是研究木兰科植物系统发育学、
分类及演化的关键类群［5］，由于气候环境和人为活
动的影响，海南木莲的天然种群日益减少。本试验
采用 ISSR 分子标记技术从分子生态学角度，对海南
木莲 4 个种群样本（湖南新宁、湖南长沙、海南省
乐东县、海南省陵水县）的遗传多样性、生态环境
差异对遗传分化的影响，以及种群间的亲缘关系等
方面进行研究，以期为木莲属植物的引种及种质资
源的保护与利用提供一定的理论依据。
2013年第8期 75魏小玲等 ：海南木莲遗传多样性的 ISSR 及亲缘关系的分析
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料来源 材料采集于海南省乐东县尖峰岭
（天然种群），海南省陵水县吊罗山（天然种群），湖
南省长沙市（人工林，1984 年引自于湖南新宁引种
自），湖南省新宁县（人工林，1979 年引自于海南
省乐东县）36 份样本（表 1）。采集的嫩叶装于放有
硅胶的袋子中，用湿纱布擦干净后，放置于 4℃冰
壶中带回实验室，置于 -70℃冰箱保存备用。
表 1 海南木莲居群与生境
居群 样本数 海拔（m） 生境
海南省乐东县（LD） 10 600-870 林中或公路旁
海南省陵水县（LS） 7 700-820 林中，沟边或公路旁
湖南省新宁县（XN） 10 300-330 林中
湖南省长沙市（CS） 9 62-80 公路旁
1.1.2 主要试剂 十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl
sulfate，SDS）、十六烷基三甲基溴化胺（cetyl triethyl
ammonium bromide，CTAB）、Tris 碱、 乙 二 胺 四 乙
酸 二 钠（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、β-巯基乙醇，均为分子
生 物 学 纯 或 分 析 纯，Taq DNA 聚 合 酶、EcoR Ⅰ、
RNaseA、GeneRulerTM 200 bp plus DNA Ladder 和 1 kb
DNA Ladder 购自 Fermentas 公司，ISSR 随机引物由
上海生物工程技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取与检测 采用预先去杂
CTAB 法［6，7］提取基因组 DNA，对其质量和纯度用
1% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 ISSR-PCR 扩增反应 从 100 条随机引物中筛
选 10 条扩增条带清晰、多态性条带丰富的引物（表
2）对海南木莲 4 个种群的 36 份样本进行 ISSR-PCR
扩增。扩增体系为 20 μL 反应体系中，模板 DNA 为
60 ng，dNTPs 为 0.25 mmol/L， 引 物 为 0.5 μmol/L，
Mg2+ 为 2.0 mmol/L，Taq DNA 聚 合 酶 为 1.25 U。 试
验程序为 ：94℃预变性 3 min ；94℃变性 30 s，50-
56℃退火 45 s，72℃延伸 90 s，36 个循环 ；72℃延
伸 420 s，4℃保存。
扩增后采用 1×TAE 电泳缓冲液，在 1.5% 的
琼脂糖凝胶中，恒定电压（3-5 V/cm）下电泳，使
DNA 分子量标准完全展开后结束电泳。在凝胶成像
系统下观察并成像记录。
表 2 用于 ISSR 分析的 10 个引物序列及退火温度
引物 序列 退火温度（℃）
UBC811 （GA）8G 54
UBC812 （GA）8A 50
UBC825 （AC）8T 52
UBC827 （AC）8G 54
UBC835 （AG）8YC 56
UBC836 （AT）8YA 52
UBC840 （GA）8YT 52
UBC841 （AG）8YC 54
UBC842 （GA）8YG 56
UBC846 （CA）8RT 52
R=（A，G）；Y=（C，T）
1.2.3 数据统计与分析 应用 GIS-2010 凝胶成像系
统进行电泳图谱带检测。清晰可变的电泳条带用于
数据的统计分析。按扩增条带的有无计数，当扩增
出一条带时，赋值为“1”，不存在时，赋值为“0”，
将读取的数据输入 Excel 2003 建立表征数据矩阵，
用于数据的进一步分析。
应用 POPGENE32 软件对全部群体和单个群体
进行遗传参数分析。计算 Nei’s 遗传一致度和遗传
距离，采用 UPGMA 法分析群体间的遗传关系［8］。
2 结果
2.1 基因组DNA的提取
应用预先去杂 CTAB 法提取海南木莲 4 个种群
36 份 DNA 样本，经凝胶电泳检测（图 1），基因组
DNA 纯度高、电泳条带清晰、无拖带现象，达到后
续试验要求。
M
10000
bp
6000
5000
4000
3000
2000
1000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 1415 1617 18 19 20 21 22 2324 25 26 27 28 2930 31 3233 34 35 36
M ：DNA Marker ；1-36 ：海南木莲 36 个样品基因组扩增产物
图 1 海南木莲 36 个样品的基因组电泳图
2.2 ISSR扩增DNA多态性分析
10 条引物共扩增到 106 条带，其中多态性条带
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期76
为 87 条，每个引物可扩增的多态性条带长度范围为
200-2 200 bp，数目在 9-12 条，多态条带百分率为
82.02%。说明 4 个种群海南木莲的遗传多态性较丰
富，部分 ISSR-PCR 扩增电泳结果如图 2-图 4。
间的变异水平，说明不同种群间的海南木莲的遗传
多样性是丰富的。
表 3 四个种源的海南木莲的遗传多样性指标
种群 Na Ne H I
湖南长沙（CS） 1.744 7 1.625 7 0.336 1 0.478 3
海南陵水（LS） 1.542 6 1.416 6 0.228 7 0.329 7
湖南新宁（XN） 1.702 1 1.559 2 0.303 6 0.399 2
海南乐东（LD） 1.489 4 1.419 5 0.222 3 0.315 1
平均值 1.642 2 1.505 2 0.272 7 0.380 6
种群间 1.819 1 1.613 2 0.339 2 0.491 0
2.4 地理差异对海南木莲遗传分化的影响
4 个海南木莲种群间的遗传分化系数（Gst）为
0.197 1，基因流（Nm）为 2.036 7，群体内总基因多
样性（Ht）为 0.339 6，群体内基因多样性（Hs）为 0.272
7，种群内变异为 80.30%，种群间的变异为 19.70%。
总的遗传变异中有 80.30% 存在于种群内。
2.5 遗传距离与亲缘关系的聚类分析
4 个 种 群 的 海 南 木 莲 的 Nei’s 遗 传 距 离 为
0.036 6-0.194 3， 平 均 为 0.128 9 ；遗 传 一 致 度 为
0.823 4-0.964 1，平均值为 0.880 1（表 4）。遗传一
致度和遗传距离分化最大的分别为湖南新宁和湖南
长沙，湖南新宁与海南陵水 ；湖南长沙与湖南新宁
的遗传距离和一致度分化最小。但每个种群的遗传
距离差异不是很大，说明各种群间的遗传变异保持
了较高的稳定性。
表 4 不同地理种源海南木莲的 Nei’s（1978）遗传一致度
（上三角）和遗传距离（下三角）
种源 CS LS XN LD
CS *** 0.865 2 0.964 1 0.888 6
LS 0.144 8 *** 0.847 6 0.823 4
XN 0.036 6 0.165 3 *** 0.891 8
LD 0.118 1 0.194 3 0.114 5 ***
根据 Nei’s（1978）遗传距离，对海南木莲 4 个
种群进行 UPGMA 聚类分析，结果如图 5 所示。通
过 ISSR 分子标记技术印证了湖南长沙与湖南新宁的
两个海南木莲种群确实引种于海南乐东，而海南乐
东与海南陵水的两个种群存在的一定的遗传距离。
3 讨论
遗传多样性是生物长期进化的结果，是物种
M 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819
M ：200 bp DNA Ladder Plus ；1-36 ：引物 UBC827 海南木莲多态性扩增
图 2 引物 UBC827 对海南木莲的多态性扩增
M 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213 141516 171819
M ：200 bp DNA Ladder Plus ；1-36 ：引物 UBC840 海南木莲多态性扩增
图 3 引物 UBC840 对海南木莲的多态性扩增
M20212223 242526 2728 2930 3132 3334 3536M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213141516 1718 19
M ：200 bp DNA Ladder Plus ；1-36 ：引物 UBC846 海南木莲多态性扩增
图 4 引物 UBC846 对海南木莲的多态性扩增
2.3 海南木莲遗传多样性ISSR分析
通过分析 4 个种群的海南木莲 DNA 的观测等位
基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei’s 基因
多样性指数（H）及 Shannon 多样性指数（I）等遗
传多样性指数，结果如表 3 所示。Na 的变异幅度为
1.489 4-1.744 7，平均值为 1.642 2 ；H 的变异幅度
为 0.222 3-0.336 1，平均值为 0.272 7 ；I 的变异幅度
为 0.315 1-0.478 3，平均值为 0.380 6，均小于种群
2013年第8期 77魏小玲等 ：海南木莲遗传多样性的 ISSR 及亲缘关系的分析
间产生了较高的遗传分化，这一结果与 Soltis 等［11］
研究的结果相一致，即对遗传变异在群体内和群体
间的分配有显著而一致影响的是繁育方式。
4 结论
海南木莲 4 个种群间产生了较高的遗传分化 ；
湖南新宁与长沙的海南木莲种群确实引种于海南乐
东。虽然海南木莲属于热带树种，但引种到亚热带
地区后，海南木莲仍可产生一定的遗传分化，以适
应当地环境进而生长良好。
参 考 文 献
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P and SSR）in tetraploid potato（Solanum tuberosum L.）germp
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［2］ 黎裕 , 贾继增 , 王天宇 . 分子标记的种类及其发展［J］. 生物
技术通报 , 1999（4）：19-22.
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Botany, 2001, 87 ：585-590.
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（责任编辑 李楠）
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图 5 不同种源海南木莲 UPGMA 聚类图
生存和发展的前提。许多研究认为濒危、特有植
物的遗传多样性较低，但也有研究表明，有些稀
有、濒危植物同样可以表现出较高的遗传多样性［9］。
在 物 种 的 遗 传 多 样 性 水 平 上， 海 南 木 莲 的 PPB
（82.08%）、H（0.339 2）和 I（0.491 0）与木兰科的
其他几种濒危物种属于较高的一类。这可能是因为，
海南木莲虽然分布范围窄，现存居群少，但生命力强，
经过自然选择的作用，适应生存环境的基因被保留
和积累下来，使得该物种的遗传多样性较高。另外，
海南木莲花大，气味芬芳，具有虫媒传粉的典型特
征，这样的繁育方式有利于维持其较高的遗传多样
性。这些都说明海南木莲具有较高的遗传多样性与
其生活史特征及生态特征是有很大关系的。
以自交为主的物种，群体间的遗传变异较大，
通常达到一半以上 ；而以异交为主的物种，一般只
有约 10% 的遗传变异存在于群体间。4 个种群的海
南木莲中遗传距离最远的为海南乐东和海南陵水，
其值为 0.194 3 ；而湖南长沙与湖南新宁的遗传距离
仅 为 0.036 6。Slatkin 和 Hamrick 等 认 为 若 Nm>1，
就足以抵制遗传漂变的作用，同时也可以防止发生
居群间的较大的分化。因此，不同的种源地的海南
木莲由于气候、地理环境等因素的影响，其生存必
将产生与生存环境相适应的遗传分化。
对海南木莲 4 个种群进行 UPGMA 聚类分析，
海南木莲可以聚为 3 类。湖南新宁与湖南长沙聚为
一类 ；湖南新宁和长沙的种群与海南乐东的种群有
较近的亲缘关系 ；而海南乐东的海南木莲种群很可
能来源于海南陵水。遗传距离分析结果说明，湖南
新宁与长沙的海南木莲种群可能确实引种于海南乐
东，在湖南地区经过近 30 年的生长，本来分布于热
带地区的海南木莲在处于亚热带的湖南也能适应当
地的生态环境，产生相应的遗传分化茁壮生长。由
于海南木莲为异交物种，通过虫媒传粉时，种子传
播和萌发受环境因素的影响，使得海南木莲在种群