全 文 ：生物技术通报
·研究报告· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
大豆转录因子 GmERF5 启动子的克隆及活性分析
翟莹1 张军2 赵艳1 孙天国1 姚雅男3 杨晓杰1
（1. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院 遗传重点实验室，齐齐哈尔 161006 ；2. 黑龙江省兽医科学研究所，齐齐哈尔 161006 ；
3. 长春农业博览园，长春 130117）
摘 要 ： 乙烯响应因子（Ethylene-responsive factors，ERFs） 广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答。从大豆吉林 32 的
基因组 DNA 中分离到 GmERF5 的启动子片段，全长 1 924 bp 。该区段含有 9 种与逆境相关的顺式作用元件，即 G-box 、GT-1 、
LTRE-1 、W-box 、TL1 、DPBF 、MYB 、MYC 和 BIHD10S 。将该启动子构建到植物表达载体 pCAMBIA1301 上与葡萄糖苷酸酶（GUS）
基因融合，注射法转化烟草叶片，并进行干旱、高盐和低温处理，通过 GUS 组织化学染色和 GUS 荧光值的测定分析启动子的启动
活性。结果表明，在未处理条件下，该启动子能驱动下游 GUS 基因的表达。干旱和低温处理 10 h 能明显增强 GmERF5P 的启动活性。
关键词 ： 大豆 GmERF5 GUS 活性 启动子 逆境诱导
Cloning and Activity Analysis of Soybean GmERF5 Promoter
Zhai Ying1 Zhang Jun2 Zhao Yan1 Sun Tianguo1 Yao Yanan3 Yang Xiaojie1
（1. College of Life Science and Agro-forestry，Qiqihaer Univesity，Key Laboratory of Genetics，Qiqihaer 161006 ；2. Heilongjiang Institute of
Veterinary Science，Qiqihaer 161006 ；3. Changchun Agriculture Expo Garden，Changchun 130117）
Abstract:  ERF transcription factor family is extensively involved in the biotic and abiotic responses. The GmERF5 promoter（1 924 bp）
was isolated from soybean genome using PCR. Sequence analysis indicated that GmERF5P contains several stress-induced elements ：G-box,
GT-1, LTRE-1, W-box, TL1, DPBF, MYB, MYC and BIHD10S. GmERF5P was subcloned into pCAMBIA1301 vector to drive the GUS gene
to express in tobacco leaves by Agrobacterium-mediated injection transformation. The activity of GmERF5P was analyzed using histochemistry
staining and GUS fluorescence intensity analysis. The results indicated that GmERF5P activated expression of GUS report gene under normal
growing conditions. The activity of GmERF5P was up-regulated after the treatments of drought and low temperature for 10 h.
Key words:  Soybean GmERF5P GUS activity Promoter Stress-induced
当植物处于不利的环境中时会迅速激活相关的 植物中相继获得大量 ERF 基因。近年来， 将拟南芥
信号转导途径［1］， 合成大量逆境相关的基因产物， 中的 ERF 转录因子 HARDY 在三叶草中异位表达，
包括酶、分子伴侣、离子通道蛋白和转运体等［2］， 降低了转基因植物的蒸腾作用和对钠离子的摄入量，
使植物更好的适应各种生物和非生物胁迫。其中， 从而提高了转基因三叶草的抗旱性和抗盐性［5］。超
逆境相关转录因子由于可以和启动子中特定的元件 表达 SlERF1 的转基因番茄与野生型相比含有更高
结合， 通过调节自身的改变从而调控下游多个目的 的相对含水量、脯氨酸含量和可溶性糖含量， 提高
基因的表达而在植物适应不利环境条件方面发挥重 了转基因番茄的抗盐性［6］。另外， 将番茄中的另一
要作用［3］。乙烯响应因子（Ethylene-responsive fac- 个 ERF 转录因子 TSRF1 在烟草和番茄中过表达， 通
tors，ERFs） 是植物中特有的一类转录因子， 广泛参 过 GCC-box 激活抗病基因的表达可提高转基因植物
与植物对生物和非生物胁迫的应答。自 Ohme-Takagi 的抗病性， 而将其在水稻中过表达则可以通过调控
和 Shinshi［4］首次从烟草中分离出 4 个 ERF 基因以 胁迫响应基因的表达来提高转基因水稻的抗旱性［7］。
来， 已从拟南芥、番茄、水稻、小麦、玉米等不同 从拟南芥中分离出一个受低氧、高盐、ABA 和紫外
收稿日期 ：2013-09-06
基金项目 ： 齐齐哈尔大学青年教师科研启动支持计划项目（2012k-M20）
作者简介 ： 翟莹， 女， 博士， 讲师， 研究方向 ： 大豆分子育种 ；E-mail ：fairy39809079@126.com
101 2014年第1期 翟莹等 ： 大豆转录因子 GmERF5 启动子的克隆及活性分析
辐射诱导的 AtERF71/HRE2， 将其在拟南芥中超表达
提高了转基因拟南芥对高盐、水淹和紫外辐射的抗
性［8］。由此可见，ERF 转录因子的应用是提高农作
物综合抗逆能力的有效策略。
植物基因的启动子位于基因 5端上游区域，调控
基因的转录起始和频率， 使基因在不同的组织器官、
不同的发育时期以及不同环境条件下表达［9］。启
动子序列除含有基本元件 TATA-box 和 CAAT-box 外，
还存在一些特异性的顺式作用元件， 它们可以与转
录因子蛋白等调节蛋白质协同作用［10］。研究转录因
子基因的启动子有助于理解该基因的逆境胁迫调控
机制及信号调控网络。然而， 到目前为止关于 ERF
基因启动子及其表达调控的研究报道并不多。
本研究前期从大豆品种吉林 32 中分离出一个
可以被逆境胁迫所调控的 ERF 转录因子 GmERF5
（GenBank 登录号为 JN416600）［11］。为研究 GmERF5
的表达调控模式及其在大豆胁迫响应中的调控功能，
本研究分离出 GmERF5 的启动子片段， 进行生物信
息学分析， 并构建植物表达载体转化烟草叶片， 分
析该启动子对干旱、高盐和低温的应答反应。
1 材料与方法
1.1 材料
供试大豆（Glycine max L.） 吉林 32 由吉林大学
植物种质资源与利用研究室提供 ； 烟草（Nicotiana
tabacum L.）NC89 由本实验室保存 ； 载体 pCAMBIA-
1301 、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 及根癌农杆
菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 均由本实验
室保存。
1.2 方法
1.2.1 GmERF5 基因启动子的克隆和序列分析 利
用已克隆到的大豆 GmERF5 转录因子 cDNA 序列搜
索大豆基因组数据库 GmGDB（http ：//www.plantgdb.
org/GmGDB/）， 获得其上游大概 2 000 bp 的启动子序
列。利用引物设计软件 Primer5 设计引物，在其两边，
引物序列如下（ 下划线部分为 EcoR I 和 Nco I 酶切位
点）F：5-GGGAATTCGCTATTCCCCTAAACTTTG-3；
R ：5-GGCCATGGGTTTCTTCTTCAGAACTTGAG-3。
以大豆吉林 32 叶片 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增。
PCR 程序为 94℃ 8 min ；94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃
1 min， 进行 30 个循环 ；72℃ 延伸 8 min 。PCR 产物
经切胶回收后连接至 pMD18-T 载体， 将筛选获得阳
性质粒命名为 pMD18-T-GmERF5P， 并送华大基因
进行测序。测序结果利用 DNAMAN 软件进行序列比
对，PLACE（http ：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/） 数
据库用于启动子顺式作用元件的预测分析。
1.2.2 表达载体的构建 将测序正确的 pMD18-T-
GmERF5P 质 粒 和 pCAMBIA1301 质 粒 分 别 用 EcoR
I 和 Nco I 双酶切后经 T4 连接酶过夜连接， 以菌液
PCR 和双酶切鉴定阳性克隆。利用冻融法将表达载
体 pCAMBIA1301-GmERF5P 和 pCAMBIA1301 分 别
转化农杆菌 EHA105 。
1.2.3 烟草叶片的转化及胁迫处理 农杆菌介导的
烟草叶片的转化参照 Yang 等［12］的方法并加以改
进。烟草苗采用盆栽， 于温室中培养 6 周后开始进
行处理。将分别含有 pCAMBIA1301-GmERF5P 载体
和 pCAMBIA1301 空载体的农杆菌菌液于 YEP 培养
基中，28℃，120 r/min（ 摇床）， 振荡培养至 OD600
大约为 0.6 时，2 000×g 离心 15 min 收集菌体， 用
MS 液体培养基（ 附加 10 mmol/L MES 和 100 μmol/L
AS） 重悬菌体至 OD600 大约为 0.8 。用 1 mL 注射器，
分别抽取 1 mL 重悬后的菌体和对照 MS 重悬液注
入到烟草植株幼嫩叶片的叶脉间， 做好标记， 覆膜
保湿培养 40 h 后对烟草整株进行各种胁迫处理。将
注射后的烟草苗分别置于含 10 % PEG8000 和 200
mmol/L NaCl 的水溶液中进行干旱和高盐处理；于 4℃
培养箱进行低温处理。处理后 10 h 取样进行 GUS 基
因表达的检测。
1.2.4 GUS 基因表达的检测 参照 Jefferson［13］的方
法对 GUS 报告基因的表达进行检测。将处理后的烟
草叶片剪下进行 GUS 组织化学染色 ： 加入 GUS 染
色液［14］， 于 37℃ 温育过夜， 用 75 % 的乙醇脱色至
底色完全消失。另将 0.1 g 处理后的烟草叶片在液氮
中研磨成粉末，加入 600 μL 酶提取缓冲液，4℃ 离心，
用 Bradford 法［15］测定上清液中的蛋白浓度。取出
部分上清液加 GUS 反应底物 4-MUG， 于 37℃ 反应
10 min， 在荧光分光光度计上进行 GUS 荧光值的测
定。试验设置 3 次生物重复， 用获得的荧光值除以
蛋白浓度和时间得到 GUS 相对活性。
102 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期
2 结果
2.1 GmERF5启动子的扩增
将已获得的逆境诱导相关转录因子 GmERF5 的
cDNA 序列输入大豆基因组数据库进行搜索， 获得
该序列上游大概 2 000 bp 的 DNA 序列。进一步设计
引物， 通过 PCR 从大豆吉林 32 的叶片 DNA 中扩增
得到 1 924 bp 的 GmERF5 启动子序列， 命名为 Gm-
ERF5P。经分析该序列富含 A/T（ 含量达 73.1 %），
这是植物启动子序列的主要特征之一。
2.2 GmERF5P的序列分析
利用数据库 PLACE 对获得的启动子序列进行
分析， 结果（ 图 1） 表明，GmERF5P 除含有基本启
动子特征元件 TATA-box 和 CAAT-box 外， 还含有与
逆境相关的 9 种顺式作用元件， 即 ：3 个与脱水响
应相关的 G-box 元件、11 个病原体和盐诱导响应相
关的 GT-1 元件、1 个低温响应相关的 LTRE-1 原件、
1 个伤害响应相关的 W-box 元件、1 个抗病相关的
TL1 元件、1 个 ABA 诱导转录因子 DPBF 的结合位点、
阴影和黑体位置表示预测的顺式作用元件
图 1 GmERF5P DNA 序列的生物信息学分析
4 个脱水响应相关的 MYB 转录因子识别位点、5 个
脱水和冷诱导相关的 MYC 转录因子识别位点和 2 个
抗病相关的 OsBIHD1 转录因子结合位点 BIHD10S 。
射对照重悬液的烟草叶片都没有被 X-Gluc 溶液染成
蓝色， 而转化 pCAMBIA1301 空载体的烟草叶片在
未处理和 3 种逆境处理条件下都可以被 X-Gluc 溶液
2.3 GmERF5P的逆境诱导瞬时表达 染成较一致的深蓝色， 说明 GUS 报告基因在烟草叶
烟草叶片的 GUS 染色结果（ 图 2） 表明， 仅注 片中能够被 pCAMBIA1301 载体上的烟草花叶病毒
103
250
2014年第1期 翟莹等 ： 大豆转录因子 GmERF5 启动子的克隆及活性分析
35S（CaMV35S） 组成型启动子启动， 且基本不受
以上 3 种逆境处理的调节。在未处理条件下， 转化
pCAMBIA1301-GmERF5P 的烟草叶片被 X-Gluc 溶液
染成浅蓝色， 表明在正常条件下 GmERF5P 本身具
有启动活性， 但与 CaMV35S 相比， 其启动活性较弱。
经过干旱和低温处理后， 烟草叶片呈现出的蓝色比
未处理时的蓝色深， 表明 GmERF5P 的启动活性在
处理 10 h 时能被干旱和低温所诱导， 使下游目的基
因的表达量增高。但高盐处理 10 h 对 GmERF5P 的
启动活性影响不大。
3 讨论
影响外源基因在转基因植物中表达的因素有很
多， 其中以启动子的调控最为关键。逆境诱导启动
子仅在植物遭受逆境胁迫时才大量启动下游抗逆基
因的表达， 可以避免外源基因在转基因植物中持续
表达所造成诸多负面影响［16，17］。因此， 逆境诱导启
动子的使用对植物应对逆境环境具有重要的意义。
GmERF5 是从大豆吉林 32 中分离到的一个编码
ERF 转录因子基因， 能够被多种生物及非生物胁迫
所诱导［11］。长度为 1 924 bp 的 GmERF5 基因启动子
CaMV35S GmERF5P 片段能够在干旱和低温处理 10 h 后明显提高下游报
告基因的表达量， 具有一定的逆境诱导活性。此结
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图 2 逆境诱导后烟草叶片 GUS 组织化学染色
烟草叶片的 GUS 荧光值检测结果与 GUS 染色
结果相符合。如图 3 所示， 干旱和低温处理 10 h 均
能使 GmERF5P 的启动活性有不同程度的增强， 而
高盐处理则没有提高 GmERF5P 的启动活性。
果与前期研究结果相符， 实时荧光定量 PCR 结果表
明大豆中 GmERF5 基因在干旱和低温处理 10 h 后表
达量上升明显， 而高盐处理 10 h 后基因表达量变化
不大［11］。利用生物信息学方法对 GmERF5P 上的顺
式作用原件进行预测， 发现其含有多个与脱水、高
盐、低温、病原物和伤害等逆境相关的顺式作用元
件， 由此推测各种逆境环境可能就是通过这些顺式
作用元件来调节 GmERF5 基因的表达， 进而再通过
GmERF5 所介导的信号路径调控大豆对生物及非生
物胁迫的响应， 从而表现出复杂的调控方式。逆境
处理 10 h，GmERF5P 对干旱处理的响应最为明显，
序列分析结果表明 GmERF5P 上存在 3 个脱水响应
元件 G-box ； 其次是对低温的响应，GmERF5P 序列
仅存在 1 个低温响应元件 LTRE-1 ； 尽管 GmERF5P
序列上存在 11 个盐诱导响应元件 GT-1， 但其对高
盐处理的响应不明显。由此表明启动子的逆境诱
导活性不仅只取决于逆境诱导元件的个数， 还应
该由元件的种类及相对位置等共同决定［18］。另外
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CaMV35S
GmERF5P
需要进一步的研究。
100 启动子序列中的 A/T 含量与启动子的启动活性
呈正相关， 这些序列的功能很可能是与植物细胞核50
内的 A/T 丰富序列结合蛋白相作用， 从而对基因的
0 ᵚ༴⨶ ᒢᰡ 儈ⴀ վ⑙ 表达起调控作用［20，21］。GmERF5P 序列中含有大量
图 3 逆境诱导后烟草叶片 GUS 活性分析 A/T 序列， 推测其可能具有较高的启动效率。通过
GmERF5 基 因 的 表 达 还 可 能 受 到 MYB 转 录 因 子、
MYC 转录因子等逆境相关转录因子的调控［19］。但是，
具体是哪些元件在 GmERF5P 中发挥关键作用， 尚
200
150
104 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期
GUS 组织化学染色和 GUS 荧光值的测定， 证明了
GmERF5P 即使在未诱导条件下也能有效地启动下游
GUS 报告基因的表达。但 GmERF5P 启动子无论在
未处理还是在逆境处理 10 h 后其启动强度都明显低
于 CaMV35S 启动子， 这可能是由于 GmERF5P 序列
相对较长， 远端可能存在负调控元件， 也可能与逆
境处理时间有关， 这方面仍需做启动子缺失和逆境
诱导时间相关试验来进一步验证［19］。
4 结论
本研究首次克隆了大豆转录因子 GmERF5 基因
的启动子序列，该区段含有 9 种与逆境相关的顺式作
用元件。将该启动子构建植物表达载体并转化烟草
叶片。在未处理条件下， 该启动子能驱动下游 GUS
基因的表达， 干旱和低温处理 10 h 能明显增强 Gm-
ERF5P 的启动活性。
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（责任编辑 狄艳红）