全 文 ：·综述与专论· 2012年第8期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2011-12-16
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31160301）, 广西自然科学基金项目（0991046）, 广西自然科学基金创新研究团队项目（2011GXNSFF018002）
作者简介 : 黄东亮 , 男 , 博士 , 副研究员 , 研究方向 : 甘蔗分子育种 ; E-mail: hdl666@163.com
李双喜 , 男 , 硕士 , 研究方向 : 甘蔗分子生物学 ; E-mail: lishuangxi@163.com
李双喜与黄东亮为同等贡献者
通讯作者 : 李杨瑞 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 甘蔗栽培与遗传育种 ; E-mail: liyr@gxaas.net
甘蔗基因克隆研究进展
黄东亮1， 2， 3， 4 李双喜1， 2， 3， 4 廖青4， 5 方锋学1， 2， 3， 4 李杨瑞2， 3， 4
（1 广西农业科学院甘蔗研究所，南宁 530007 ；2 广西甘蔗遗传改良重点实验室，南宁 530007 ；3 农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点
实验室，南宁 530007 ；4 中国农业科学院甘蔗研究中心，南宁 530007 ；5 广西农业科学院农业资源与环境研究所，南宁 530007）
摘 要： 甘蔗是重要的糖料和能源作物，在我国，其糖产量占全国食糖产量的 94%。甘蔗是高光合效率 C4作物，其蔗糖含
量是所有植物中最高的，其基因组中蕴藏着大量重要基因。因此，甘蔗基因克隆对甘蔗品种定向改良具有重要意义。从蔗糖代谢、
生长发育和抗逆性三个方面全面总结甘蔗基因克隆的研究进展，并提出今后研究的建议，以期为今后甘蔗基因研究提供参考。
关键词： 甘蔗 基因 克隆
Advance on Sugarcane Gene Cloning
Huang Dongliang1， 2， 3， 4 Li Shuangxi 1， 2， 3， 4 Liao Qing4， 5 Fang Fengxue 1， 2， 3， 4 Li Yangrui2， 3， 4
（1Sugarcane Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007；2Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic
Improvement，Nanning 530007；3Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement （Guangxi），Ministry of Agriculture，
P.R.China，Nanning 530007；4Sugarcane Research Center，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007；5Agricultural
Resources and Environment Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007）
Abstract: Sugarcane is the most important sugar crop and energy crop. Cane sugar occupies 94% of the total sugar in China. Sugarcane
is also a kind of C4 crop with high photosynthesis efficiency. The sucrose content in sugarcane is highest in all crops. There are a lot of elite
genes in sugarcane genome. Gene cloning from sugarcane shows great significance to directional improvement of sugarcane variety. This review
comprehensively summarizes the cloning of sugarcane genes involved in sucrose metabolism, growth and development, and stress resistance. The
further study focuses are suggested, which are expected to contributed to further study on sugarcane gene cloning.
Key words: Sugarcane Gene Cloning
甘蔗是重要的糖料作物，蔗糖产量对保障我国
食糖安全具有重大战略意义。甘蔗优良品种的选育
是甘蔗增产的关键因素。目前甘蔗育种以常规杂交
育种为主。亲缘关系近、遗传基础狭窄是甘蔗常规
育种的瓶颈。利用生物技术手段，可以快速挖掘甘
蔗种质资源中的重要性状基因。将现代生物技术与
常规育种技术相结合，将有效地提高甘蔗育种效率。
蕴藏在各类甘蔗栽培种、热带种、细茎野生种、斑茅、
滇蔗茅和近缘植物中的基因资源，是甘蔗改良的重
要基因来源。了解甘蔗基因克隆现状，有助于把握
下一步研究方向，进一步挖掘更多甘蔗重要基因用
于品种改良。
1 蔗糖代谢相关基因
蔗糖是植物光合作用的主要产物，是碳运输的
主要形式。蔗糖从叶片通过韧皮部运输到需要碳源
和能量的库器官，供应植物的生长和用于合成淀粉、
脂肪等贮藏物质。蔗糖参与植物对逆境胁迫的反应，
是细胞代谢的调控因子。蔗糖还具有信号功能，可
调节转运蛋白、贮藏蛋白和编码酶的基因的表达［1］。
植物中的蔗糖代谢途径，见图1。目前研究认为，
在高等植物中，与蔗糖代谢密切相关的酶主要有蔗
糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶和转化酶。
2012年第8期 9黄东亮等 ：甘蔗基因克隆研究进展
1.1 蔗糖磷酸合成酶
蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，
SPS）是植物体内控制蔗糖合成的关键酶［2］。SPS 以
UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）为供体，以 6-磷酸果
糖（fructose-6-phosphate）为受体，催化合成 6-磷酸
蔗糖（sucrose-6-phosphate）。6-磷酸蔗糖在 SPP（磷
酸蔗糖磷酸化酶）的作用下脱磷酸并水解形成蔗糖
和磷酸根离子，此反应基本上是不可逆的 ；而 SPS
和 SPP 又是以复合体的形式存在于植物体内，所以
SPS 催化蔗糖生成实际上也是不可逆的（图 1）［2］。
fructose-1， 6-bisphosphate. 1， 6- 二磷酸果糖 ； FBPase. 果糖 1， 6- 二磷酸酯酶 ；UDPG. 尿苷二磷酸葡萄糖 ；fructose-6-
phosphate. 6- 磷酸果糖 . 蔗糖磷酸合成酶 ；UDP. 二磷酸尿苷 ；sucrose-6-phosphate. 6- 磷酸蔗糖 ；SPP. 磷酸蔗糖磷酸化
酶 ；SuS. 蔗糖合成酶 ；IV. 转化酶
图 1 植物蔗糖代谢途径
表 1 目前甘蔗中鉴定的 SPS基因
家族 名称 来源 氨基酸长度（aa） 作者 参考文献 备注
A 家族
SofSPSA gi302826883/HM854011 1 060 黄东亮等 ［5］ 获得包括 5端和 3端非编码区的完整 cDNA 序列
SofSPSII gi161176316/EU269038 1 060 Zhou，et al. 未发表 只获得编码区 cDNA 序列
B 家族
SofSPSB gi346685057/JN584485 1 074 黄东亮等 未发表 获得包括 5端和 3端非编码区的完整 cDNA 序列
SofSPSI gi1854376/AB001337 1 047 Sugiharto，et al. 未发表 缺少 N 端部分序列
D 家族
SofSPSDⅢ gi305677549/HQ117935 964 黄东亮等 未发表 获得包括 5端和 3端非编码区的完整 cDNA 序列
SofSPSⅢ gi1854378/AB001338 963 Sugiharto，et al. 未发表 获得包括 5端和 3端非编码区的完整 cDNA 序列
根据 SofSPSIII 的 cDNA 序列，何文锦等［6］也
从甘蔗品种 FN95-1702 叶片中克隆了相应的基因并
进行序列分析，二者的核酸序列相似性达 99.07％，
氨基酸序列相似性达 98.86％，但没有进一步研究报
道。
1.2 蔗糖合成酶
在蔗糖代谢途径中，蔗糖合成酶（sucrose syn-
thase，SuS）催化 UDP 和蔗糖合成果糖和 UDPG
（图 1）。尽管反应是可逆的，但普遍认为 SuS 的主
要功能是分解蔗糖，为多糖的合成提供前体，如为
胞壁合成提供底物和合成淀粉［7］。所以，蔗糖合成
酶是蔗糖进入各种代谢途径所必需的关键酶之一。
SuS 基因首先从玉米中克隆出来［8］。对 SuS 进
行进化分析表明，SuS 分为 3 个家族，且同一植物
中有多个分别属于不同家族的 SuS 基因，它们的
表达具有发育和组织器官特异性［9］。如玉米中存
在 3 个编码 SuS 的基因 ：Sh1、Sus1 和 Sus3［10］。水
稻基因组至少含有 3 个 SuS 基因 ：Rsus1、Rsus2 和
Langenkamper 等［3］对高等植物基因组和已知
的 SPS 基因的全长序列和其保守序列进行生物信息
学分析后把 SPS 基因分为 A、B 和 C 家族。但是，
Castleden 等［4］之后还对小麦等单子叶植物的 SPS 基
因进行研究后认为，双子叶植物中的 SPS 基因至少
有 A、B 和 C 3 个家族，而禾本科的单子叶植物中的
SPS 基因则可分为 5 个家族，分别为 A、B、C、DIII
和 DIV。
从NCBI数据库搜索发现，目前甘蔗已克隆了A、
B、DIII 3 个家族完整的 SPS 基因（表 1）。其中，A
家族 SPS 基因已构建了植物表达载体，为进一步鉴
定其功能奠定了基础［5］。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期10
Rsus3［11］。甘蔗与水稻同属禾本科，与玉米同属禾
本科须芒草分支，亲缘关系近。所以甘蔗基因组中
至少也有 3 个 SuS 基因。
2001 年 Lingle 和 Dyer［12］从甘蔗中克隆了第一
个 SuS 基因。根据 Linge 等获得的 SuS 基因序列，
雷美华等［13］也从甘蔗中扩增了 SuS 基因的 DNA 片
段并进行序列分析。实际上目前只克隆了一个甘蔗
SuS 基因，且没有进一步研究的报道。
1.3 转化酶
在蔗糖代谢中，转化酶（invertase，IV）催化蔗
糖转化为果糖和葡萄糖（图 1）。转化酶包括酸性转
化酶（acid invertase，AI）和中性 / 碱性转化酶（neutral
invertase，NI）［14］。就目前所知，几乎每种植物中
都存在转化酶同工酶，由几种转化酶基因编码。不
同的转化酶基因在不同品种、器官、时间、诱导剂
作用下，其基因表达模式均不同［14］。
人们对中性 / 碱性转化酶的研究较少，仅从胡
萝卜和拟南芥中克隆了中性转化酶［15，16］。而酸性转
化酶已经从番茄、马铃薯、绿豆、拟南芥、胡萝卜、
葡萄和甜瓜等多种植物中被克隆出来［14］。但目前还
没有在甘蔗中克隆出转化酶的报道。
1.4 蔗糖代谢途径中的其他酶
1.4.1 磷酸蔗糖磷酸化酶 磷酸蔗糖磷酸化酶（suc-
rose-phosphatase，SPP）催化 6-磷酸蔗糖脱磷酸形成
蔗糖和磷酸根离子，是蔗糖生物合成途径中的最后
一步。由于这一步反应基本上是不可逆的，所以在
它之前催化6-磷酸蔗糖形成的蔗糖磷酸合成酶（SPS）
是控制蔗糖合成的关键酶［2］。因此，对 SPP 的研究
比对 SPS 的研究少得多。
同样，高等植物中也存在由多个不同基因编码
的 SPP 同工酶。如拟南芥基因组中有 4 个 SPP 类似
基因，且每个都表达 ；水稻基因组中也有 4 个与拟
南芥中结构相似的 SPP 类似基因 ；人们从玉米中已
鉴定出 2 个有酶活性功能的 SPP 基因 ；小麦和番茄
中也被证实有多个 SPP 类似基因［17］。
目前，仅从 NCBI 基因库中搜索到一个甘蔗 SPP
基因（DQ092445/GI ：69205228），但并没有相应的
报道。
1.4.2 果糖-1，6-二磷酸酯酶 在植物蔗糖合成途
径中，果糖-1，6-二磷酸酯酶（fructose-1，6-bisp-hos-
phatase，FBPase）水解果糖-1，6-二磷酸（FBP）形
成 6-磷酸果糖（F6P）和无机磷（图 1）。这一步
反应是不可逆的，也是调节蔗糖合成的第一步
反应［18］。
1995 年，人们已从甘蔗中鉴定出一个细胞质
型 FBPase 基因（GI895908/X89006） ［19］。根据该基
因序列，叶冰莹等［20］也从甘蔗茎和叶片中克隆出
FBPase 基因。
1.4.3 果糖 6-磷酸-2-激酶和果糖-2，6-二磷酸酶 果
糖-2，6-二磷酸（F2，6BP）是果糖-1，6-二磷酸酯酶
（fructose-1，6-bisphosphatase，FBPase）的强抑制剂，
而且其还改变了 FBPase 催化反应动力学特性。另
外，F2，6BP 还能加强 AMP 对 FBPase 的抑制活性
以及提高该酶对 pH 和 Mg2+ 的依赖性。因此，普
遍认为 F2，6BP 在调节 FBPase 和蔗糖合成中起关
键 性 的 作 用［18］。 果糖-6-磷酸-2-激 酶（fructose-6-
Phosphate，2-Kinase，F6P，2K） 和 果糖-2，6-二 磷 酸
酶（fructose-2，6-Bisphosphatase，F2，6BPase） 分 别
催化 2，6-二磷酸果糖的形成和降解［18］。
这两种酶活性最先于大鼠中发现，试验证明它
们是由同一蛋白表现出的双功能酶活性。即 F6P，2K
是一个具有两种催化活性的双功能蛋白，在同一多
肽链上既具有激酶结构域又具有酯酶结构域［21， 22］。
根据玉米、水稻的果糖-6-磷酸，2-激酶 / 果糖-2，
6-二磷酸酶（F6P，2K/F2，6BPase）的保守区域序列，
已从甘蔗叶片中克隆 F6P，2K 基因，为进一步研究
其功能奠定了基础［23］。
1.4.4 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 尿苷二磷酸
葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase，
UGPase）催化 Glc-1-P+UTP=UDPG+PPi。在植物的
不同组织中 UGPase 所催化的反应方向不同。在植物
叶中，UGPase 将催化生成的 UDPG 提供给 SPS，进
一步合成蔗糖 ；在植物的非光合作用组织，如在顶
芽中，UGPase 可能参与蔗糖的降解，将 UGPD 转化
为 Glc-1-P［24］。在植物的贮藏组织，如在种子胚乳
及块茎中，UGPase 参与造粉体中淀粉的合成［25］。
目前，已从水稻、黄芪、大麦、马铃薯及拟南
芥等多种植物中克隆了 UGPase，从甘蔗中也克隆了
UGPase 基因［26］，但没有进一步研究的报道。
2012年第8期 11黄东亮等 ：甘蔗基因克隆研究进展
2 生长发育相关基因
2.1 乙烯生物合成途径中的2个关键酶
乙烯是调控生长发育、成熟衰老的重要内源激
素，对植物的代谢调节贯穿于整个生活周期。从种
子萌发到开花、性别分化以及果实成熟等都有乙烯
的参与［27］。
乙烯的生物合成途径中（图 2），起关键作用的
2 个酶是 ACC 合成酶和 ACC 氧化酶。ACC 合成酶
基因和 ACC 氧化酶都是多基因家族，每个基因的表
达调控受不同诱导剂的诱导［28］。
南瓜、豌豆、烟草、拟南芥、番茄和白杨等多种植
物中克隆了 GA20 氧化酶基因并对其进行功能研究，
吴建明等［36］首次从甘蔗中克隆到了 GA20 氧化酶基
因片段（EU650640），为进一步克隆甘蔗 GA20 氧化
酶基因全长序列、研究该基因在甘蔗节间伸长过程
中的表达调控及甘蔗茎间伸长中的作用机理提供理
论依据。
2.3 延伸因子
真核生物延伸因子（elongation factor）可分为
eEF1 和 eEF2。eEF1 介 导 氨酰-tRNA 与 核 糖 体 结
合，它有 4 个亚基，分别命名为 eEF1A、eEF1Bα、
eEF1Bβ 和 eEF1Bγ ；eEF2 因 子 是 单 体， 催 化 与
mRNA 相连的核糖体的移动［37］。
eEF1A（elongation factor 1A）是一个主要的翻
译因子，除参与蛋白质合成外，还参与多种细胞过
程［37， 38］。植物的 eEF1A 大多数由多基因编码，目
前已在多种植物中克隆了 eEF1A 基因［37］。
Vijaykumar 等［39］首先从甘蔗叶片中克隆了 eEF-
1A 基因（AF281361），之后，Wang 等［40］从甘蔗茎中
克隆了 eEF1A 基因（EF581011）全长 cDNA，该序
列全长 1 736 bp，包含一个 1 344 bp 的 ORF，编码
447 个氨基酸，与已报道的甘蔗 eEF1A 基因（AF-
281361 和 AF331850）同源性分别达 82％和 92％。
3 抗性相关基因
3.1 非生物胁迫相关基因
3.1.1 脯氨酸代谢相关酶
3.1.1.1 Δ1-吡咯啉-5-羧 酸 合 成 酶（Δ1-pyrroline-5-
carboxylate synthetase，P5CS） 干旱胁迫会促使植物
体累积可溶性大分子渗透保护物质，如脯氨酸、甜
菜碱和糖醇，其中脯氨酸是分布最广的渗透剂。脯
氨酸代谢中间产物具有诱导基因表达以及降低渗透
胁迫所造成的氧伤害作用［41］；脯氨酸的生物合成途
径有 2 种，即谷氨酸途径和鸟氨酸途径［42，43］。
脯氨酸生物合成的谷氨酸途径最早是通过大肠
杆菌发现的。细菌中的 L-谷氨酸（L-glutamic acid，
L-Glu）在依赖于 ATP 的谷氨酸激酶（γ-glutamic acid
kinase，γ-GK）作用下生成 γ-谷氨酰磷酸，又在 GSA
脱氢酶作用下生成 L-谷氨酸-γ-半醛（GSA），GSA 自
发环化形成的△-1-二氢吡咯-5-羧酸（△-1-pyrroline-
MET. methionine，蛋氨酸 ；SAM. S-adenosylmethionin，S- 腺苷蛋氨
酸；ACC. 1-aminocylopropane-1-carboxylic acid，1- 氨基 - 羟基环丙烷；
ACS. ACC synthase，ACC 合成酶 ；ACO. ACC oxidase，ACC 氧化酶
图 2 乙烯生物合成途径
王爱勤等［29］已从甘蔗中克隆了 3 个家族的 ACC
合成酶基因（AY620985、AY620986 和 AY78891），
并对环境胁迫和激素诱导这 3 个 ACC 合成酶基因的
表达进行了研究［30］。此外，王爱勤等还首次从甘
蔗中克隆了一个 ACC 氧化酶基因（AY521566）［31］，
并构建了甘蔗 ACO 基因的植物表达载体［32］及对该
酶进行纯化并研究其特性［33］，为甘蔗的基因工程育
种奠定理论基础并提供技术储备。
2.2 赤霉素生物合成途径中的关键酶
赤霉素（GA）是高等植物体内重要的激素，参
与包括种子萌发、茎伸长、叶片伸展、表皮毛发育、
根生长、花和果实发育等多种植物生理过程［34］。
目前，已经在植物、真菌和细菌中发现赤霉
素类物质 136 种，其中大多数种类存在于高等植物
中，一部分存在于真菌或细菌中 ；另一部分属真菌
和植物共有。按其发现的顺序，分别命名为 ：GA1，
GA2，GA3⋯⋯GA136［35］。
GA20 氧化酶是植物体内最重要的 GA 生物合
成和调控酶，它能催化从 GA12 到 GA9 及 GA53 到
GA20 一系列的氧化反应经连续氧化失去 CO2 的过
程，生成具有生物活性的 GA。目前已在水稻、玉米、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期12
5-carboxylate，P5C）在△-1-二氢吡咯-5-羧酸还原酶
（P5Creductase，P5CR）催化下生成 L-脯氨酸。△-1-
啉吡咯-5-羧酸合成酶（P5C synthetase，P5CS）和
P5CR 是谷氨酸途径中的 2 个关键酶，其中 P5CS 催
化第一步反应，P5CR 催化最后一步反应，第一步反
应为限速反应［44］。目前已从虹豆、豌豆、大豆、水
稻和拟南芥中克隆到 P5CS 基因，这些基因的表达
均表现出受干旱和高盐胁迫诱导的特征［44］。
Huang 等［45］采用同源克隆与 RT-PCR 法从甘蔗
叶片中得到甘蔗 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Sacchar-
um officinarum L. Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，
ScP5CS）基因的编码区 cDNA 序列 （EU005373）。该
核苷酸序列与前人已注册的甘蔗 P5CS（EF155655）
相比，同源率达到 98%，但推断编码的氨基酸同源
率仅为 92％，推断为甘蔗 P5CS 基因家族中的一个
新成员。
3.1.1.2 Δ-鸟氨酸转氨酶 Δ-鸟氨酸转氨酶（orni-
thine-Δ-aminotransferase，Δ-OAT）是脯氨酸生物合成
的鸟氨酸代谢途径的关键酶，对脯氨酸合成起着重
要的作用［46，47］。
张积森等［48］通过消减文库技术结合 cDNA 芯
片技术还克隆了一个甘蔗 Δ-OAT 基因。荧光实时
PCR 分析 Δ-OAT 在根、茎、叶的表达，该基因在茎
的表达较高，其次是叶而后为根，但没有明显的组
织表达特异性。这是首次报道的甘蔗 Δ-OAT 基因克
隆研究结果，为该基因的深入研究和应用奠定一定
基础。
3.1.2 醛脱氢酶 醛脱氢酶（aldehyde dehydrogen-
ase，ALDH）基因是已被证明的与植物的水分胁迫
相关的众多家族基因之一，该家族基因是以共同醛
化合物为底物的一类大家族基因［49］。
在动物中发现有 ALDH 基因的 18 个亚家族［50］，
在模式植物拟南芥中，醛脱氢酶大家族中已发现了
至少 9 个亚家族基因，可能存在 14 个 ALDH 编码
基因［49］。
琥珀酸半醛脱氢酶基因（succinic semialdehyde
dehydrogenase，SSADH） 是 植 物 ALDH 家 族 基 因
的一个重要成员，在拟南芥中被归入 ALDH5 家族
（ALDH families 5），是一个线粒体脱氢酶基因，参
与重要代谢过程［51］。
张积森等［52］通过消减文库技术结合 cDNA 芯
片技术克隆了甘蔗 SSADH 基因。序列比对分析
表明，所克隆的甘蔗 SSADH 全长 cDNA 与拟南芥
（NM_106592.3）的 ALDH5F1 同源性为 73%，表明
克隆的 cDNA 序列可以归为甘蔗的醛脱氢酶家族基
因 ALDH5F1。通过荧光实时 PCR 分析 SSADH 表达
表明，该基因参与干旱胁迫下的全程响应，并证明
水分胁迫下该基因表达与 Ca2+ 的存在调控关系。
3.1.3 转录因子 植物许多基因的表达都是由特定
的转录因子与特定的顺式作用元件相互作用调控
的［53］。植物中存在的转录因子中有相当一部分与抗
逆性有关。
锌指蛋白是真核生物中普遍存在的一类转录因
子，这种蛋白质与 Zn2+ 结合形成稳定的手指结构，
在基因的表达调控等生命过程中发挥重要作用［54］。
已有研究表明，锌指蛋白与植物的抗盐胁迫、抗旱
和抗冷等抗逆性相关［55-57］。
刘金仙等［58］从甘蔗叶片中克隆出一个锌指蛋
白基因 Sc-zf。该基因不仅可以通过上调表达响应外
源黑穗病菌和 NaCl 的胁迫，而且该基因的表达受到
PEG 胁迫的抑制，推测甘蔗锌指蛋白基因在甘蔗的
抗病和抗盐胁迫机制中发挥一定作用。这是首例从
甘蔗中克隆和表达分析锌指蛋白基因的报道。
NAC 转录因子家族是植物特有的 NAC 转录因
子家族，数量众多，广泛分布于陆生植物中，构成
最大的转录因子家族之一。NAC 转录因子在多个生
长发育和胁迫应答过程中发挥重要作用，已成为当
前植物基因功能及表达网络调控研究中的热点［59］。
Nogueira 等［60］从甘蔗中鉴定了一个 NAC 家族
转录因子——SsNAC23。SsNAC23与甘蔗冷害、虫害、
水分胁迫有关。
3.2 生物胁迫相关基因
3.2.1 蛋白酶抑制剂（proteinase inhibitor） 植物有
多种防御病原菌侵害的机制。蛋白酶抑制剂能干扰
病原菌的生长和发育而成为植物防御病原菌侵害的
重要机制之一［61］。
Soares-Costa 等［62］鉴定了一个甘蔗半胱氨酸蛋
白酶抑制剂（Cystatin）基因并在大肠杆菌中表达。
经纯化的蛋白酶抑制剂能抑制丝状真菌 Trichoderma
2012年第8期 13黄东亮等 ：甘蔗基因克隆研究进展
reesei的生长，暗示该基因能应用于甘蔗真菌病害的
防治。这是第一个从甘蔗中鉴定的蛋白酶抑制剂。
之后，Gianotti 等［63］又从甘蔗中鉴定了 2 个蛋白酶
抑制剂，即 CaneCPI-2 和 CaneCPI-3，并在大肠杆
菌中表达，为进一步研究酶活性和蛋白质结构打下
基础。
3.2.2 抗病基因同源序列（resistance gene analog，
RGA） 通过抗病基因识别病原物的入侵，从而诱
导植物产生过敏反应或者随后引起系统抗性，是植
物抵御病原物入侵的重要方式。尽管抗病基因之间
的序列同源性很低，大多抗病基因都存在特异的保
守序列，如富亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat，
LRR）、 核 苷 酸 结 合 位 点（nucleotide binding site，
NBS）、丝氨酸-苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，
STK）、亮氨酸拉链（leucine zippers，LZ）、跨膜结
构域（transmembrane domain，TM）和 Toll 白介素-1
区域（Toll-interleukin-1region，TIR）等［64］。
根椐其产物中保守结构域的不同，可将抗病基
因分成 5 类，其中 NBS 类是已分离抗病基因中最大
的一类，它们广泛存在于植物的基因组中［65， 66］。
研究证明，一些 RGA 与抗病基因（resistance
gene，R 基因）紧密连锁，甚至本身就是抗病基因
的一部分。此外，RGA 还具有容易获得、扩增结果
稳定和费用低廉等优点。因此，以 RGA 区段的保守
性为基础设计 PCR 特异简并引物，扩增 R 基因同源
序列，进而进行抗病基因的分离和克隆，已经成为
当前比较流行的标记、定位和克隆植物抗病基因的
策略之一［67］。
甘蔗 RGA 的研究仅有少量报道。Rossi 等［68］
采用与典型病原菌抗性基因同源比对的方法，从甘
蔗 EST 数据库中获得 88 个 RGA，并研究它们在甘
蔗基因组中的分布。McIntyre 等［69］克隆了 54 个甘
蔗 RGA 用于鉴定甘蔗重要病害抗病位点的分子标记
研究。
根据已知植物（拟南芥、烟草和亚麻）抗病基
因（RGAs）保守序列设计简并引物，已从甘蔗高抗
黑穗病品种 NCo376 的基因组 DNA 和 cDNA 中扩增
出 11 条抗病基因同源序列，进行序列分析表明，这
些 RGAs 均含有典型的 NBS-LRR 类抗病基因所拥有
的保守结构域 P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a 和疏水
结构域。编号为 EF059974 的 PIC 基因的表达不仅
受黑穗病菌胁迫的影响，而且受水杨酸的诱导和过
氧化氢的抑制，也具有抗病基因组织特异性和组成
型表达特性。推测 PIC 基因与甘蔗某种病害的抗性
相关［70］。
这些 RGA 的获得，为进一步通过分子生物学和
遗传学手段对这些抗病基因同源序列进行全长克隆、
功能分析、染色体定位及其同已知抗病基因的连锁
关系分析等奠定了基础。
4 结语
甘蔗基因组中蕴藏着大量重要基因。但与水稻、
玉米等作物相比，甘蔗中克隆的基因数量还较少，
且基本为同源克隆而来，而验证功能并加以利用的
基因还没有。究其原因，一方面是我国甘蔗生物技
术方面的研究起步晚，基础研究相对薄弱；另一方面，
甘蔗是复杂的无性繁殖多倍体植物，利用分子标记
技术进行重要基因的定位有一定的难度。因此，今
后的研究中，一方面要继续通过同源克隆方法克隆
甘蔗重要基因，并鉴定其功能加以应用。其次，还
要试图改变分子标记策略，通过分子标记方法定位
并克隆甘蔗重要基因并加以应用。但是，最重要的
还是要开展甘蔗基因组学研究，通过甘蔗基因组测
序与功能基因组学研究获得一批具有自主知识产权
的重要基因，应用于作物品种改良。
参 考 文 献
［1］ 杨国志 , 张明方 . 植物蔗糖代谢参与酶的表达及调控 . 北方园
艺 , 2006（5）：45-47.
［2］ Huber SC, Huber JL. Role and regulation of sucrose-phosphate
synthase in higher plants. Annual Review of Plant Physiology and
Plant Molecular Biology, 1996, 47 ：431-444.
［3］ Langenkämper G, Fung RW, Newcomb RD, et al. Sucrose phosphate
synthase genes in plants belong to three different families. J Mol
Evol, 2002, 54（3）：322-332.
［4］ Castleden CK, Aoki N, Gillespie VJ, et al. Evolution and function
of the sucrose-phosphate synthase gene families in wheat and other
grasses. Plant Physiology, 2004, 135（3）：1753-1764．
［5］ 黄东亮, 方锋学, 黎涛, 等 .甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因（SofSPSA）
的克隆及正反义植物表达载体的构建 . 农业生物技术学报 ,
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期14
2011, 19（4）：624-633.
［6］ 何文锦, 黄金存, 周平, 等.甘蔗叶片蔗糖磷酸合成酶基因cDNA
克隆及序列分析 . 亚热带农业研究 , 2007, 3（4）：294-296.
［7］ Mccollum TG, Huber DJ, Cantliffe DJ. Soluble sugar accumulation
and activity of related enzymes during muskmelon fruit development.
Journal of the American Aociety for Horticultural Science, 1998,
113 ：399-403.
［8］ Mccarty DR, ShawJR, Hannah LC. The cloning genetic mapping
and expression of the constitutive sucrose synthase locus of maize.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 1986,
88 ：9099-9103.
［9］ 卢合全 , 沈法富 , 刘凌霄 , 等 . 植物蔗糖合成酶功能与分子生物
学研究进展 . 中国农学通报 , 2005, 21（7）：34-37.
［10］ Shane CH, Steven CH. Proteasome activity and the post-trans-
lational control of sucrose synthase stability in maize leaves. Plant
Physiology and Biochemistry, 2004, 42 ：197-208．
［11］ Wang AY, Kao MH. Differentially and developmentally regulated
expression of the rice sucrose synthase genes. Plant Cell Physiology,
1999, 40（8）：800-807.
［12］ Lingle SE, Dyer JM. Cloning and expression of sucrose synthase-1
cDNA from sugarcane. Journal of Plant Physiology, 2001, 158 ：
129-131.
［13］ 雷美华 , 叶冰莹 , 王冰梅 , 等 .甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆 .应
用与环境生物学报 , 2008, 14（2）：177-179.
［14］ 李肖蕖 , 王建设 , 张根发 . 植物蔗糖转化酶及其基因表达调控
研究进展 . 园艺学报 , 2008, 35（9）：1384-1392.
［15］ Lee HS, Sturm A. Purification and characterization of neutral and
alkaline invertase from carrot. Plant Physiology, 1996, 111（4）：
1513-1522.
［16］ Qi X, Wu Z, Li J, et al. AtCYT-INVI, a neutral invertase, is
involved in osmotic stress-induced inhibition on lateral root growth
in Arabidopsis. Plant Molecular Biology, 2007, 64 ：575-587.
［17］ Lunn JE. Sucrose-phosphatase gene families in plants. Gene, 2003,
303 ：187-196.
［18］ 王忠 . 植物生理学［M］. 第 1 版 . 北京 ：中国农业出版社 ,
2000.
［19］ Grof CPL, Glassop D, Bugos RC, et al. Sequence of a cDNA
encoding cytosolic Fructose-1, 6-bisphosphatase from sugarcane
（Saccharum L.）. Plant Physiology, 1995, 109 ：339.
［20］ 叶冰莹 , 黄金存 , 邵武华 , 等 . 甘蔗果糖-1, 6-二磷酸酯酶的
cDNA 片段克隆及序列分析 . 中国糖料 , 2009（3）：1-4.
［21］ EI-Maghrabi MR, Claus TH, Pilkis J, et al. Regulation of rat liver
fructose-2, 6-bisphosphatase. J Biol Chem, 1982, 257 ：7603-7607.
［22］ Pilkis SJ, Regen DM, Stewart HB, et al. Evidence for two catalytic
sites on 6-phosphofructo-2-kinase/fructose 2, 6-bisphosphatase.
Dynamics of substrate exchange and phosphoryl enzyme formation.
J Biol Chem, 1984, 259 ：949-958.
［23］ 何炜 , 叶冰莹 , 周平 , 等 . 甘蔗果糖-6-磷酸 , 2-激酶 / 果糖-2, 6-
二磷酸酶基因的 cDNA 克隆及序列分析 . 福建师范大学学报 ：
自然科学版 , 2009, 125（13）：109-113.
［24］ Winter H, Hube SC. Regulation of sucrose metabolism in higher
plants ：Localization and regulation of activity of key enzymes.
Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2000, 35
（4）：253-289.
［25］ Kleczkowski LA, Geisler M, Ciereszko I, et al. UDp-glucose
pyrophosphorylase an old protein with new tricks. Plant Physiology,
2004, 134 ：912-918.
［26］ 连玲 , 叶冰莹 , 何炜 , 等 . 甘蔗 UGPase cDNA 的克隆及序列分
析 . 福建师范大学学报 ：自然科学版 , 2009, 25（3）：105-108.
［27］ Johnson PR, Ecker JR. The ethylene gas signal transduction
pathway ：a molecular perspective. Annual Review of Genetics,
1998, 32 ：227-254.
［28］ 秦毓茜.乙烯的生物合成及信号转导研究进展.安徽农业科学,
2006, 34（4）：622-624, 640.
［29］ 王爱勤 , 杨丽涛 , 王自章 , 等 . 甘蔗乙烯合成酶基因家族三个
成员的克隆与序列分析 . 热带亚热带植物学报 , 2005, 13（6）：
485-492.
［30］ 王爱勤 , 杨丽涛 , 王自章 , 等 . 环境胁迫和激素诱导甘蔗 ACC
合成酶基因家族三个成员的表达 . 作物学报 , 2006, 32（5）：
734-737.
［31］ 王爱勤 , 杨丽涛 , 王自章 , 等 . 甘蔗 ACC 氧化酶全长 cDNA 的
克隆及序列分析 . 广西植物 , 2006, 26（2）：194-199.
［32］ 董伟清 , 王爱勤 , 韦波 , 等 . 甘蔗 ACC 氧化酶基因的克隆与植
物表达载体构建 . 安徽农业科学 , 2008, 36（17）：7147-7149,
7171.
［33］ 王爱勤 , 韦波 , 韦宇拓 , 等 . 重组甘蔗 1-氨基环丙烷-1-羧基
（ACC）氧化酶的纯化及其特性 . 农业生物技术学报 , 2009, 17
（2）：323-327.
［34］ Pimenta Lange MJ, Lange T. Gibberellin biosynthesis and the
regulation of plant development. Plant Biology, 2006, 8（3）：
2012年第8期 15黄东亮等 ：甘蔗基因克隆研究进展
281-290.
［35］ 谈心 , 马欣荣 . 赤霉素生物合成途径及其相关研究进展 . 应用
与环境生物学报 , 2008, 14（4）：571-577.
［36］ 吴建明 , 李杨瑞 , 王爱勤 , 等 . 甘蔗 GA20 氧化酶基因片段克
隆及序列分析 . 热带作物学报 , 2009, 30（6）：817-821.
［37］ 覃迎姿 , 黄先益 , 叶兴枝 , 等 . 植物延伸因子 eEF1A 研究进
展 . 广西农业科学 , 2009, 40（5）：472-477.
［38］ 周冰 , 曹诚 , 刘传喧 . 翻译延伸因子 1A 的研究进展 . 生物技
术通讯 , 2007, 18（2）：281-284.
［39］ Vijaykumar D, Ramachander TVN, Mahishi LH, et al. Molecular
cloning, characterization and tissue specific expression of an
elongation factor 1A gene in Saecharum officinalllm L.. Plant
Science, 2002, 162 ：315-321.
［40］ Wang AQ, Qin YZ, Ye XZ, et al. Molecular cloning and tissue
specific expression of an elongation factor 1A gene in sugarcane
stalks. Sugar Technology, 2008, 10（2）：119-123.
［41］ Mccue KF, Hanson A. Drought and salt tolerance ：towards
understanding and application. Trends Biotechnology, 1990, 8 ：
358-362.
［42］ Hu CA, Delauney AJ, Verma DP. A bifunctional enzyme （Δ1-
pyrroline-5-carboxylate synthetase） catalyzes the first two steps in
proline biosynthesis in plants. Proceedings of the National Academy
of Sciences of the USA, 1992, 89 ：9354-9358.
［43］ Delauney AJ, Hu CA, Kishor PB, et al. Cloning of ornithine-Δ-ami-
notransferase cDNA from Vigna aconitifolia by transcomplementa-
tion in Escherichia coli and regulation of proline biosynthesis. The
Journal of Biological Chemistry, 1993, 268 ：18673-18678.
［44］ 全先庆 , 张渝洁 , 单雷 , 等 .高等植物脯氨酸代谢研究进展 .生
物技术通报 , 2007（1）：14-18.
［45］ Huang CM, Yang LT, Li YR, et al. Isolation and characterization
of a gene encoding the Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase in
sugarcane （Saccharum officinarum L.）. Guangxi Agricultural
Sciences, 2009, 40（2）：113-116.
［46］ Nancy HR, Fawaz AB, Kristof L, et al. Overexpression of ornithine-
delta-aminotransferase increases proline biosynthesis and confers
osmotolerance in transgenic plants. Molecular Breeding, 2002, 9
（2）：73-80.
［47］ Wu LQ, Fan ZM, Guo L, et al. Over-expression of an Arabidopsis
delta-OAT gene enhances salt and drought tolerance in transgenic
rice. Chinese Science Bulletin, 2003, 48（19）：2050-2056.
［48］ 张积森 , 陈由强 , 郭春芳 , 等 . 甘蔗水分胁迫响应的 Δ-鸟氨
酸转氨酶基因克隆及分子特征分析 . 热带作物学报 , 2009, 30
（8）：1062-1068.
［49］ Hans-Hubert K, Dorothea B, Wei Y, et al. The ALDH gene super-
family of Arabidopsis. Trends in Plant Science, 2004, 9（8）：372-
377.
［50］ Vasiliou V, Nebert DW. Analysis and update of the human aldehyde
dehydrogenase （ALDH） gene family. Human Genomics, 2005, 2
（2）：138-143.
［51］ Bouché N, Fait A, Bouchez D, et al. Mitochondrial succinic-
semialdehyde dehydrogenase of the gamma-aminobutyrate shunt is
required to restrict levels of reactive oxygen intermediates in plants.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2003,
100 ：6843-6849.
［52］ 张积森 , 郭春芳 , 王冰梅 , 等 . 甘蔗水分胁迫响应相关醛脱
氢酶基因的克隆及其表达特征分析 . 中国农业科学 , 2009, 42
（8）：2676-2685.
［53］ 张亚洲 , 陈芬 , 徐庆国 . 转录因子 DREB 在植物抗逆中的应
用 . 作物研究 , 2009, 23（5）：290-292.
［54］ Laity JH, Lee BM, Wright PE. Zinc finger proteins：new insights into
structural and functional diversity. Current Opinion in Structural
Biology, 2001, 11（1）：39-46.
［55］ Sakamoto H, Maruyama K, Sakuma Y, et al. Arabidopsis Cys2/His2-
type zinc-finger proteins function as transcription repressors under
drought, cold, and high salinity stress conditions. Plant Physiology,
2004, 136 ：2734-2746.
［56］ Mukhopadhyay A, Vij S, Tyagi AK. Over expression of a zinc-
finger protein gene from rice confers tolerance to cold, dehydration,
and salt stress in transgenic tobacco. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the USA, 2004, 101（16）：6309-6314.
［57］ Sugano S, Kaminaka H, Rybka Z, et al. Stress-responsive zinc
finger gene ZPT2-3 plays a role in drought tolerance in petunia.
Plant Journal, 2003, 36（6）：830-841.
［58］ 刘金仙 , 阙友雄 , 郑益凤 , 等 . 甘蔗锌指蛋白基因的克隆和表
达分析 . 农业生物技术学报 , 2009, 17（4）：707-712.
［59］ 彭辉 , 于兴旺 , 成慧颖 , 等 . 植物 NAC 转录因子家族研究概
况 . 植物学报 , 2010, 45（2）：236-248.
［60］ Nogueira FTS, Schlögl PS, Camargo SR, et al. SsNAC23, a member
of the NAC domain protein family, is associated with cold, herbivory
and water stress in sugarcane. Plant Science, 2005, 169 ：93-106.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期16
［61］ Ryan CA. Proteinase inhibitors in plants：genes for improving defe-
nses against insects and pathogens. Annual Review of Phytopatho-
logy, 1990, 28 ：425-449.
［62］ Soares-Costa A, Beltramini LM, Thiemann OH, et al. A sugarcane
cystatin ：recombinant expression, purification, and antifungal
activity. Biochemical and Biophysical Research Communications,
2002, 296（5）：1194-1199.
［63］ Gianotti A, Rios WM, Soares-Costa A, et al. Recombinant expres-
sion, purification, and functional analysis of two novel cystatins
from sugarcane （Saccharum officinarum）. Protein Expression and
Purification, 2006, 47（2）：483-489.
［64］ 李美玲 , 严成其 , 王栩鸣 , 等 . 同源序列法克隆植物抗病基
因研究进展及其在野生稻中的应用 . 生物技术通讯 , 2010, 21
（1）：126-130.
［65］ Hammond-Kosack KE, Jones JD. Plant disease resistance genes.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,
1997, 48 ：575-607.
［66］ Jones JD. Putting knowledge of plant disease resistance genes to
work. Current Opinion in Plant Biology, 2001, 4（4）：281-287.
［67］ 丁国华 , 池春玉 , 王桂玲 , 等 . 植物抗病基因同源序列研究进
展 . 中国农学通报 , 2006, 22（1）：38-41.
［68］ Rossi M, Araujo PG, Paulet F, et al. Genomic distribution and
characterization of EST-derived resistance gene analogs （RGAs）
in sugarcane. Molecular Genetics and Genomics, 2003, 269 ：
406-419.
［69］ McIntyre CL, Casu RE, Drenth J, et al. Resistance gene analogues
in sugarcane and sorghum and their association with quantitative
trait loci for rust resistance. Genome, 2005, 48 ：391-400.
［70］ 阙友雄 , 许莉萍 , 林剑伟 , 等 . 甘蔗 NBS-LRR 类抗病基因同源
序列的分离与鉴定 . 作物学报 , 2009, 35（4）：631-639.
（责任编辑 狄艳红）