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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
小 麦 条 锈 病 是 由 小 麦 条 锈 病 菌（Puccinia
striiformis f. sp. tritici）引起的小麦叶部病害，严重时
也危害穗部。小麦条锈病在许多国家和地区均有发
生，我国是小麦条锈病发生最广泛的国家之一［1，2］。
防治小麦条锈病最有效、最经济、最安全的方法是
收稿日期 ：2013-12-16
基金项目 ： 国家“863”高技术研究发展计划（2008AA10Z115），国家自然科学基金项目（30971874），转基因生物新品种培育科技重大专
项（2009ZX08012-011B）
作者简介 ：黄宇，男，硕士研究生，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：nictkk@163.com
通讯作者 ：潘映红，男，研究员，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：panyinghong@caas.cn
质谱非标记定量分析小麦抗条锈病近等基因系
蛋白质变化
黄宇1，2，3  冯晶4  饶力群1  徐世昌4  潘映红2，3
（1. 湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128 ；2. 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081 ；3. 国家农作物基因资源与基因改良
重大科学工程，北京 100081 ；4. 中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193）
摘 要 ： 利用基于液相色谱串联 Orbitrap 质谱（Q Exactive）的非标定量（Label-free）技术，对小麦抗病单基因近等基因
系 Taichung29*6/Yr10 和背景品种 Taichung29 叶片的蛋白质表达进行了比较分析。经 MASCOT 软件搜库，在两个样品中共同鉴定
到 2 257 个蛋白，其中有准确定量信息的蛋白共 1 549 个，含量变化大于 2 倍的差异蛋白有 102 个。对 102 个差异表达蛋白进行了
Gene Ontology（GO）功能注释和分析，发现他们多数定位于细胞基质和核糖体等细胞器，具备结合、催化等功能，主要参与代谢、
细胞过程、应激等生物学进程，其中超氧化物歧化酶、甲硫氨酰氨肽酶、溶酶体 -β-葡萄糖苷酶和铁蛋白等可能与小麦抗病单基因
近等基因系 Taichung 29*6/Yr10 的抗病性有一定相关性。
关键词 ： 小麦 条锈病 抗病性 蛋白质组学 非标记定量 Q Exactive 质谱
Label-free Quantitative Proteomics Analysis of a Wheat Near-isogenic
Line Pair with Q Exactive Mass Spectrometer
Huang Yu1，2，3 Feng Jing4 Rao Liqun1 Xu Shichang4 Pan Yinghong2，3
（1. College of Bbioscience and Biotechnology，Hunan Agriculture University，Changsha 410128 ；2. Institute of Crop Science，Chinese
Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081 ；3. The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Beijing
100081 ；4. Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）
Abstract:  In this study, the protein expression of a wheat near-isogenic line pair, Taichung 29*6/Yr10 and Taichung 29, have been
compared with label-free quantitative proteomic approach based on liquid chromatography tandem Q Exactive hybrid quadrupole-Orbitrap mass
spectrometer. By MASCOT database search, a total of 2 257 proteins were identified from both of the samples, and among of them 1 549 proteins
were accurately quantitated and 102 differentially expressed proteins（>2 fold）were detected. Gene ontology（GO）analysis showed that
these differential proteins were mainly localized to cell matrix and organelles such as ribosome, and mainly involved in binding and catalytic
functions. Among of 102 proteins which mainly take part in metabolic, cellular and stress responses processes, Superoxide dismutase, Methionine
aminopeptidase, Lysosomal-β-glucosidase, and Ferritin may play some important roles in Taichung 29*6/Yr10 resistance to Yellow rust.
Key words:  Wheat Yellow rust Resistance Proteomics Label-free quantitation Q Exactive Mass Spectrometer
利用抗病品种。虽然国际上已经命名了 49 个位点的
55 个小麦抗条锈病基因（Yr1-Yr52），但其中大多数
抗病基因具有生理专化性，常常因为条锈菌小种的
快速变异而失去抗性，目前，只有少数的抗病基因
仍保持抗性，如 Yr5、Yr10 和 Yr15 等［2-5］。随着大
2014年第6期 89黄宇等 ：质谱非标记定量分析小麦抗条锈病近等基因系蛋白质变化
量物种基因组测序的完成，人们清楚的意识到单纯
从基因组和转录组的信息并不能完全揭示生命活动
的规律，作为功能基因组学研究内容之一的蛋白质
组学已经成为生命科学研究领域的热点和前沿［6］。
目前，已知的小麦抗条锈病基因都是通过遗传推导
确定的，仅有极少数基因如 Yr36 的序列已经明确。
因此，从蛋白质组学的角度去揭示病原物致病机理
和抗病品种的抗病机制，对小麦抗条锈性的合理利
用和小麦条锈病的可持续控制极具研究价值。
双 向 电 泳 是 目 前 蛋 白 质 组 学 研 究 的 传 统 方
法［7-9］，但该技术本身存在分离蛋白范围有限、歧
视效应、与质谱联用效果差等诸多缺陷［10］。近年
来，随着高精度生物质谱技术和基于生物信息学的
海量数据处理技术的进步，规模化的精确测量细胞
内蛋白质组的表达变化已成现实。定量蛋白质组研
究方法也从传统的基于二维凝胶电泳结合质谱鉴定
的策略向着更高准确度、更大范围和更高通量的方
向发展。蛋白质组学定量方法根据是否对蛋白质 / 多
肽进行标记可以分为标记和非标记两类。标记定
量方法是基于在肽段中引入稳定同位素标记（如
2H、13C、15N、18O），使得在同一次质谱扫描中标
记“轻”和“重”同位素的多肽具有相同的色谱行
为和离子化效率，此时成对出现的质谱峰信号的相
对强度可以精确地反映样品中蛋白质的比例。根据
同位素掺入的方式，标记方法可以分为代谢标记、
酶促标记和化学标记等，在这些标记方法中，化学
标记的种类最为繁多，应用也最为广泛。代表性的
化学标记方法包括标记多肽（蛋白质）N 端氨基的
iTRAQ［11］、标记 C 端羧基的酯化标记、针对半胱
氨酸巯基的 ICAT［12］以及与质谱多反应监测（MRM-
MS）技术联用的 mTRAQ 标记技术［13］等。以上这
些标记定量方法具有良好的定量可靠性，不仅可以
用于不同样品间的相对定量分析，还可以用于蛋白
质的绝对定量分析，但成本普遍偏高。相对于传统
的标记定量法，非标定量法（Label-free）不需要在
样本分析前对蛋白 / 多肽进行标记，避免了样品处
理过程中可能造成的损失，在检测肽段的数量、蛋
白质的覆盖率和分析通量方面具有较大优势，且不
受样品来源和数量限制。非标定量法通过比较质谱
谱图计数（spectrum counting）或质谱峰强度（peak
area intensity）分析不同来源样品蛋白的含量变化，
是目前比较蛋白质组学上运用较为普遍的一种手段。
Boeri 等［14］采用 Label-free 方法和 MALDI-Q-TOF 技
术在定量分析表皮生长因子的磷酸化蛋白动力学、
蛋白质覆盖率、序列鉴定、识别磷酸化位点等方面
取得了新进展。Wang 等［15］采用非标定量方法分别
结合 LCQ、LTQ-FT 质谱对多种样品的重现性作了测
试，并详细研究分析了蛋白质的磷酸化过程。最近，
Zhang 等［16］借助 LTQ 质谱和 PTMap 软件，鉴定出
酵母菌组蛋白上新的丙酰化和丁酰化修饰，并发现
了 14 种潜在的、未知的蛋白修饰。
本研究以非标定量法结合液相色谱串联质谱技
术对小麦感病品种 Taichung29（T29）以及抗病近等
基因系 Taichung 29*6/Yr10（TYr10）进行差异蛋白
分析，并通过生物信息学的方法分析差异蛋白所属
的细胞成分（Cellular component）、分子功能（Molecular
function）和生物学途径（Biological process），旨在
为小麦条锈病的可持续控制研究提供线索。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料来源 小麦感病品种 T29 以及抗病品种
近等基因系 TYr10 小麦均由中国农业科学院植物保
护研究所条锈病组繁殖培养。
1.1.2 材料的培养 小麦种子经浸润，催芽后种于
口径 50 cm×100 cm 塑料盆中，置于自控温室中（温
度昼 15-20℃/ 夜 11-14℃，光照强度 6 000 Lx，光
照时间 12 h），直到幼苗于温室内培养至 1 叶期。
1.1.3 主要仪器和试剂 HPLC 液相系统 Easy-nLC
1000（ 美 国 Thermo Scientific 公 司 ）；Q Exactive MS
质谱仪（美国 Thermo Scientific 公司）；Mini 垂直蛋
白电泳仪（美国 Bio-Rad 公司）；Milli-Q 超纯水系
统（美国 Millipore 公司）；冷冻高速离心机（美国
科峻仪器公司）；Lambda25 型紫外可见分光光度计
（美国 Perkin-Elmer 公司）；溴酚蓝 bromophenol blue、
碘乙酰胺 IAA、二硫基苏糖醇 DTT、聚丙烯酰胺
Acr、过硫酸钠 APS、甘氨酸 Glycine、四甲基乙二
胺 TEMED、十二烷基硫酸钠 SDS、三羟甲基氨基甲
烷 Tris（美国 GE Healthcare 公司）；测序级胰蛋白酶
TPCK-Trypsin（美国 Promega 公司）；乙腈 ACN、三
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期90
氟乙酸 TFA（美国 Fisher Scientific 公司）。
1.2 方法
1.2.1 小麦叶片总蛋白的提取 根据刘伟霞等［17］
的方法稍加修改，称取新鲜 1 叶期小麦叶片 2 g，液
氮研磨 20 min，转入 50 mL 离心管中，加入 50 mL
预冷丙酮（2% DTT，10% TCA）-20℃过夜沉淀（至
少 12 h）。离心 40 000×g，1 h，弃去上清。加入 50
mL 冰丙酮（2% DTT）放入 -20℃，静置 1 h（中间
震荡 3 次）40 000×g，1 h 离心，重复 3 次，将沉淀
至于通风厨吹干。沉淀即为蛋白粗样品，若要长期
储存则放于 -80℃冰箱保存，或将干粉溶于 UA 缓冲
液 中（ 尿 素 8 mol/L，Tris-HCl 100 mmol/L，pH8.5）
用于电泳以及酶解。
1.2.2 蛋白定量 参照 Bradford 法进行蛋白定量［18］，
采用 BSA 做标准曲线。
1.2.3 SDS-PAGE 1D SDS-PAGE 参考仪器说明并在
Mini-protean Ⅲ cell 垂直板电泳仪上进行。
1.2.4 FASP 酶解 取蛋白总量为 1 mg 的蛋白裂解
样品于 10 k 超滤管中，并加入 DTT（20 mmol/L）还
原 3 h， 加 入 200 μL UA 缓 冲 液， 离 心 14 000×g，
15 min 离 心， 重 复 两 次。 加 入 100 μL IAA，600
r/min 混匀 1 min，暗处孵育 20 min，14 000×g，10
min 离心。加入 200 μL UA，再离心 15 min，重复两
次。加入 200 μL ABC（碳酸氢铵 0.05 mol/L），离心
14 000×g，10 min 离心，重复两次。转入新的收集
管，加入一定量 ABC，加入 Trypsin（1∶50）；混匀，
37℃摇床 16-20 h 离心 14 000×g，10 min 离心，加
入 40 μL 50 mmol/L ABC，离心 14 000×g 10 min 离心，
冻干，-20℃保存。
1.2.5 色 谱 条 件 高 效 液 相 色 谱 仪 ：Thermo
Scientific Easy-nLC 1000 ；色谱柱 ：Easy-spray column
（C18，2 μm，100Å，75 μm×15 cm）；流动相 ：A ：
0.1% Formic acid，2% Acetonitrile in water ；B ：0.1%
Formic acid in Acetonitrile ； 梯 度 ：3%-8% B in 10
min，8%-20% B in 78 min，20%-30% B in 15 min，
30%-90% B in 10 min，90% B for 7 minutes ；流速 ：
250 nL/min。
1.2.6 质谱分析条件 质谱仪 ：Thermo Scientific Q
Exactive ；喷雾电压 ：2.3 kV ；毛细管温度 ：250℃ ；
S-lens ：55% ；碰撞能量 ：27% HCD ；分辨率设置 ：
一级 70 000@m/z 200，二级 17 500@m/z 200 ；母离
子扫描范围 ：m/z 300-1800 ；子离子扫描范围 ：start
from m/z 100 ；Data-dependent MS/MS ：Top 15。
1.2.7 Q Exactive 质 谱 数 据 分 析 原 始 文 件（raw
file）使用 Maxquant 软件进行 Label-free 定性和定量
分析，搜索相应的小麦蛋白数据库。具体搜库参数
如下 ：前体离子质量偏差 ：10 ppm ；碎片离子质量
偏差 ：25 mmu ；固定修饰 ：半胱氨酸（Cysteine）烷
基化（+57.021 Da）；动态修饰：甲硫氨酸（Methionine）
氧化（+15.995 Da）；天冬酰胺和谷氨酰胺（Asparagine
& Glutamine）脱氨基化（+0.984 Da）；酶 ：trypsin ；
漏切位点 ：2。数据库来自 UNIPROT（http ：//www.
uniprot.org/）。
1.2.8 差异表达蛋白的 GO（Gene Ontology）分析
根据蛋白数据库中的各蛋白 GO 注释，并结合其来源，
人工选择鉴定所得到的蛋白最可能的细胞成分、分
子功能和生物学途径，并对其进行基因富集度计算
和图示化。鉴定蛋白的 GO 信息来自 UNIPROT 网站
（http ：//www.uniprot.org/）。
2 结果
2.1 小麦叶片总蛋白的提取分析与SDS-PAGE电泳
小麦叶片通过 TCA/ 丙酮沉淀，用 UA 裂解液
溶 解， 通 过 Bradford 法 进 行 定 量， 测 出 TYr10 中
蛋白浓度为 7.80 mg/mL，T29 提取蛋白浓度为 8.01
mg/mL，计算得出总蛋白的提取率分别为 0.58% 和
0.60%。通过 SDS-PAGE（图 1）对提取结果进行检
测发现，两组样品之间平行度较好，相应的蛋白条
带清晰，初步表明蛋白提取效果理想，样品纯度适
于进行下一步工作。
94
kD
M 1 2
67
47
30
20
14
M ：蛋白 Marker ；1 ：TYr10 叶片总蛋白 ；2 ：T29 叶片总蛋白
图 1 小麦叶片总蛋白 SDS-PAGE 电泳图
2014年第6期 91黄宇等 ：质谱非标记定量分析小麦抗条锈病近等基因系蛋白质变化
2.2 液相色谱串联质谱鉴定
将蛋白粗样品复溶、酶切之后，经过 Easy-nLC
1000 液 相 系 统 进 行 色 谱 分 离， 并 通 过 Q Exactive
进行质谱分析（3 次技术重复），得到的数据进行
Mascot 搜索，共鉴定到 2 257 个蛋白。对已鉴定蛋
白 通 过 严 格 标 准 进 行 筛 选（peptide FDR & protein
FDR ≤ 1%），且设定每个蛋白需有两条以上肽段提
供定量比值，最终确定具有可靠定量信息的蛋白有
1 549 个（数据略）。
2.3 差异表达蛋白筛选结果及其GO分析
在上述具有定量信息的 1 549 个蛋白中，共筛
选出蛋白表达水平差异大于 2 倍，且 3 次技术重复
RSD<50% 的蛋白 102 个，其中低表达 31 个，高表
达 71 个（表 1）。这些蛋白的相对分子量（MW）分
表 1 质谱数据分析差异蛋白结果（TYr10 vs T29）
Protein ID Organism Protein description Theoretical pI MW（Da） Differential Expression RSD（%）
M7ZJ93 T. urartu Cortical cell-delineating protein 7.43 16664.9 0.163 24
M7Z338 T. urartu Uncharacterized protein 5.55 13760.4 0.252 39
M8A763 T. urartu Inositol-tetrakisphosphate 1-kinase 1 6.06 39292.9 0.274 31
M7YY72 T. urartu Putative 5-adenylylsulfatereductase1，chloroplastic 6.69 50663.7 0.291 39
M7ZME5 T. urartu Lysosomal beta glucosidase 6.21 68682.4 0.344 33
A1YV22 T. aestivum Photosystem Iiron-sulfur center 6.51 8899.3 0.383 20
Q5GMP4 T. aestivum Peroxidase 5.59 36505.3 0.389 28
Q0WXG6 T. aestivum Triticain gamma 6.40 39435.2 0.393 28
M8ART3 T. urartu Peptidyl-prolylcis-trans isomerase B 9.14 46754.8 0.408 50
M8AKN2 T. urartu Glycine-rich RNA-binding protein 2，mitochondrial 7.88 16932.4 0.428 40
Q8GT63 T. monocotccum Extracellular invertase 5.11 64112.1 0.429 43
M8A2U2 T. urartu Asparticproteinase nepenthesin-1 4.93 44253.6 0.434 18
M7YQM8 T. urartu Peptidyl-prolylcis-trans isomerase 9.62 17069.9 0.437 19
D2K937 T. aestivum Pyruvate dehydrogenase E1componenα-subunit 6.08 4415.8 0.446 17
M8A6M3 T. urartu Bifunctionalphosphatase IMPL2，chloroplastic 5.79 27829.8 0.448 40
M7YAM8 T. urartu 40S ribosomal protein S27 8.73 18276.1 0.449 46
M7ZW88 T. urartu Oryzain alpha chain 5.27 52998.4 0.454 44
M7YL81 T. urartu Protein CbbY 5.98 23648.3 0.456 33
A4K4Y7 T. aestivum Alpha tubulin-4D 4.81 49772.9 0.457 39
M7ZYY0 T. urartu Protease Do-like 8，chloroplastic 6.61 46513.7 0.459 33
M7YZA6 T. urartu Peroxidase 43 5.12 41173.3 0.464 23
M7ZL69 T. urartu Subtilisin-like protease 5.93 111852.3 0.466 22
M7YYL2 T. urartu Eukaryotictranslation initiation factor 5B 5.38 121355.8 0.473 9
M7Z4G9 T. urartu Uncharacterized protein 5.83 16022.2 0.475 31
Q4AEC1 T. aestivum Chalconeisomerase（Fragment） 5.06 13059.6 0.477 8
I3RTA5 T. aestivum Sucrose ：fructan 6-fructosyltransferase 5.19 68877.3 0.478 32
M8AD05 T. urartu Carbonic anhydrase，chloroplastic 6.10 20045.0 0.481 15
M8AHW7 T. urartu Vesicle-fusing ATPase 5.62 77606.8 0.482 18
M7ZAW1 T. urartu 31kDaribonucleoprotein，chloroplastic 4.73 25117.4 0.483 26
M7ZFJ6 T. urartu Mitochondrial-processing peptidasesubunitα 7.08 49976.1 0.484 16
M7ZJZ9 T. urartu Pyruvate dehydrogenase E1componentsubunitα 7.61 47744.4 0.496 35
M8A580 T. urartu 60S ribosomal protein L4-1 10.41 35894.9 2.005 14
M8A3P6 T. urartu Ananain 6.09 41980.3 2.013 20
Q5G1L6 T. aestivum Ferritin 5.66 28097.8 2.033 36
M7YDC8 T. urartu Uncharacterized protein 6.25 10453.2 2.044 35
Q5QFC3 T. aestivum Asparagine synthetase 6.01 65462.5 2.059 50
M7ZIA1 T. urartu 60S ribosomal protein L35a-1 10.31 20602.5 2.061 12
P69667 T. aestivum 50S ribosomal protein L23，chloroplastic 10.13 10763.6 2.077 9
M7ZWX9 T. urartu 60S acidic ribosomal protein P3 4.48 12089.2 2.087 36
M7ZSA1 T. urartu Uncharacterized protein 9.20 164949.9 2.134 32
M8AW09 T. urartu 40S ribosomal protein S17-4 10.22 16448.0 2.173 7
M8A0Q2 T. urartu Uncharacterized protein 6.82 16987.6 2.192 31
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期92
Protein ID Organism Protein description Theoretical pI MW（Da） Differential Expression RSD（%）
O80370 T. aestivum VER2 6.66 32435.4 2.194 12
M7ZG61 T. urartu Putative inactive purple acid phosphatase 5.78 73203.8 2.350 23
Q8VYX1 T. aestivum Phosphoethanolaminemethyltransferase 5.21 56858.3 2.364 32
Q6PWL8 T. aestivum Putativevacuolardefense protein 8.18 17792.9 2.368 17
F6MEX1 T. durum Non-specific lipid-transfer protein 9.35 11137.9 2.375 48
M7ZN65 T. urartu 30S ribosomal protein S7，chloroplastic 11.82 17658.8 2.386 31
M7YLJ3 T. urartu BifunctionalproteinFolD 8.72 32703.0 2.410 45
M7ZRR9 T. urartu 60S ribosomal protein L35a-3 10.53 12694.7 2.427 45
Q1KMV0 T. aestivum Non-specific lipid-transfer protein 9.20 11117.8 2.443 40
M7Z596 T. urartu Proliferating cell nuclear antigen 4.71 41945.7 2.495 3
M7YMB7 T. urartu 60S ribosomal protein L6 10.18 24618.8 2.499 25
M8A5Q9 T. urartu 50S ribosomal protein L15，chloroplastic 10.15 17283.0 2.508 3
M7Z9H6 T. urartu 50S ribosomal protein L17，chloroplastic 11.51 19180.2 2.522 26
M7Z0K9 T. urartu Methionine aminopeptidase 2B 8.55 48120.3 2.528 35
M8AJX1 T. urartu HMG-Y-related protein A 10.47 13038.9 2.532 13
Q95H53 T. aestivum 30S ribosomal protein S11，chloroplastic 12.01 15566.3 2.556 41
Q5XUU9 T. aestivum Cytoplasmatic ribosomal protein S13 10.53 17065.1 2.556 24
Q96185 T. aestivum Superoxide dismutase 7.91 25274.8 2.607 45
M7Y9G4 T. urartu 50S ribosomal protein L3，chloroplastic 10.32 26801.2 2.609 14
M8APZ5 T. urartu 40S ribosomal protein S14 10.31 19096.0 2.644 31
M7Z1Q7 T. urartu Uncharacterized protein 5.86 37180.0 2.695 48
M8AF37 T. urartu Uncharacterized protein 6.20 5667.2 2.703 38
M7YQB5 T. urartu Beta-amylase 5.29 63676.2 2.705 7
Q95H50 T. aestivum 50S ribosomal protein L16，chloroplastic 11.63 15490.2 2.735 7
M7ZKL5 T. urartu Uncharacterized protein 5.60 33700.8 2.771 37
M8A205 T. urartu Histone H3.3 10.41 15972.5 2.814 36
M8AVT1 T. urartu Heat shock cognate 70 kDa protein 5.34 76902.9 2.881 39
M8B120 T. urartu
Succinyl-CoA ligase［ADP-forming］subunit beta，
6.50 45184.4 2.884 48
mitochondrial
M8A5N4 T. urartu 50S ribosomal protein L13，chloroplastic 9.34 75245.1 2.971 24
M7YV08 T. urartu Putative GTP-binding protein EngB 9.72 68648.4 3.012 42
M7YWJ7 T. urartu
Putative NADH dehydrogenase［ubiquinone］1
8.83 13618.4 3.020 41
alphasubcomplex subunit 12
P93594 T. aestivum Beta-amylase 5.24 56611.1 3.024 18
M7Z4V5 T. urartu Uncharacterized protein 4.89 19795.5 3.194 50
M7ZMK8 T. urartu Annexin D4 6.93 34894.8 3.304 40
M7Z484 T. urartu 30S ribosomal protein S17，chloroplastic 9.94 16394.8 3.449 7
M7Z2R9 T. urartu Putative disease resistance proteinRXW24L 8.89 100329.0 3.518 46
Q6R2V1 T. aestivum High-molecular-weight glutenin subunit1Dx2.1 5.84 88974.1 3.830 34
M7Z922 T. urartu Annexin 6.15 34999.7 3.918 43
M7ZZT1 T. urartu Ras-related protein RABE1c 7.66 21457.2 4.058 45
M7ZZ46 T. urartu Photosystem II 10 kDa polypeptide，chloroplastic 10.36 12656.7 4.383 17
M7YS78 T. urartu 40S ribosomal protein S4 10.16 29949.9 4.580 18
M7ZZW7 T. urartu Histone H2B 10.19 26019.3 4.760 23
M7YPJ9 T. urartu 14 kDaproline-rich protein DC2.15 8.70 9304.2 5.605 43
P02276 T. aestivum Histone H2A.2.1 10.63 16013.0 5.677 15
M7Z4J1 T. urartu 60S ribosomal protein L18a 10.41 21339.0 6.714 13
M8AQG0 T. urartu Ribonuclease 1 8.82 27273.6 6.820 37
M7Z7X5 T. urartu 60S ribosomal protein L7-2 10.02 28259.1 6.994 13
M8A5T3 T. urartu Histone H2A 10.71 16594.6 10.235 29
M7ZFV3 T. urartu Histone H2A 10.62 16425.3 11.406 40
M7ZBJ1 T. urartu
Ribulosebisphosphate carboxylase/oxygenaseactivase
6.32 58390.6 15.221 7
B，chloroplastic
M7Z207 T. urartu 60S ribosomal protein L17-1 10.28 19485.4 15.683 41
续表
2014年第6期 93黄宇等 ：质谱非标记定量分析小麦抗条锈病近等基因系蛋白质变化
布为 4.42 kD（D2K937）-164.95 kD（M7ZSA1），等
电点（pI）分布为 4.71（M7Z596）-12.01（Q95H53），
相对分子量和理论等电点分布广泛。
按照 UNIPROT（http://www.uniprot.org/）数据库
中的各蛋白质的 GO 注释分别进行细胞成分、分子
功能和生物学途径分类。结果（图 2）显示，102 个
差异蛋白中有 63 个没有明确的亚细胞定位，其余主
要来源于细胞基质（36.3%）与核糖体（23.6%）等
细胞器；分子功能涉及结合（41.2%）、催化（37.3%）
等方面 ；生物学途径 GO 分析表明，这些蛋白主要
参与代谢（58.8%）、细胞过程（50.0%）、应激（3.9%）
等生物学进程。这些蛋白中，具有细胞成分（Cellular
component）GO 注释信息的蛋白 39 个，占总差异
蛋白的 38.2%，其中细胞基质蛋白 37 个，基质蛋
白中也分布于核糖体、细胞核和膜系统的蛋白分别
为 24、8 和 3 个，另有 2 个膜蛋白不分布于细胞基
质 ；具有分子功能（Molecular function）GO 注释信
息的蛋白 85 个，占到总差异蛋白的 84.3%，其中具
有结合功能的蛋白 42 个，在这 42 个蛋白中也具有
催化活性、结构大分子功能的蛋白分别为 21 个和 5
个，具有催化活性的蛋白一共是 38 个，其中 1 个同
时具有大分子结构功能，另有 7 个具有其他分子功
能的蛋白 ；具有生物学途径（Biological process）GO
注释信息的蛋白 75 个，占总差异蛋白的 73.6%，其
中代谢途径相关蛋白 60 个，在这 60 个蛋白中同时
与细胞进程、应激反应、转运过程以及生物调节过
程相关的蛋白分别有 41、2、1 和 5 个。与细胞进程
相关的蛋白一共有 51 个，其中同时与转运以及生物
调节过程相关的蛋白分别为 3 个和 6 个。应激反应、
转运过程和生物调节过程相关的蛋白总数分别为 4、
intracellul
ar, 36.30%
A
ribosome,
23.60%
unknow,
61.80%
membrane,
4.90% nucleus,
7.80%
B
unknow,
16.67% Other, 7%
binding,
41.20%
catalytic
activity,
37.30%
structural
molecule
activity,
24.50%
C
unknow,
26.40%
metabolic
process,
58.82%
cellular
process,
50.00%
biological
regulation,
6.90%
transport,
5.88%
response to
stimulus,
3.92%
A ：具有细胞成分（Cellular component）；B ：具有分子功能（Molecular function）；C ：具有生物学途径（Biological process）
图 2 T29 与 TYr10 叶片间差异蛋白的 GO 注释图
6 和 7 个。
3 讨论
样品制备是质谱非标记定量分析的关键步骤之
一，其成功与否对研究结果影响巨大，但目前还没
有一种提取植物叶片完整蛋白质的标准方法［19］。由
于小麦等植物叶片中含有 RuBisCo 等一些高拷贝数
的持家蛋白，可能导致某些调控因子和信号因子等
低丰度蛋白难以检测，对样品进行去除高丰度蛋白
处理可以在一定程度上缓解此类问题，然而此类方
法成本昂贵或操作步骤复杂，容易造成蛋白的丢
失［20，21］。本研究运用 TCA/ 丙酮沉淀法对小麦叶片
总蛋白进行提取，蛋白提取率分别为 0.58% 和 0.60%，
达到目前的一般标准［9，22］，在此基础上首次运用质
谱非标定量法对 TYr10 与 T29 进行了比较蛋白质组
学研究。结果显示，在两个样品中共鉴定到 2 257
个蛋白，其中具有准确定量信息的蛋白 1 549 个，
从已定量的蛋白中共筛选到 102 个差异表达蛋白。
由于在不同真核生物中的大多数基因拥有相似
的生物学功能，因此在某些物种获得基因或蛋白质
的生物学信息可辅助揭示其他物种中相应基因或蛋
白质的功能，综合这些信息的 GO 注释目前已成为
功能基因生物信息学分析的核心内容之一［23，24］。本
研究从 GO 数据库中获取了 102 个差异表达蛋白所
属的细胞成分、生物学途径和分子功能的 GO 注释，
并人工对差异蛋白进行 GO 功能分析和图示化。这
一结果表明该鉴定蛋白质组数据具有较好的生物学
功能覆盖范围，包括光合作用、糖代谢以及能量代
谢等一系列生物过程，这与报导过的植物抗病相关
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期94
研究结果相一致［25-27］。
在 已 鉴 定 的 差 异 蛋 白 中， 代 谢 相 关 蛋 白 60
个， 其 中 Q96185 为 超 氧 化 物 歧 化 酶（Superoxide
dismutase，SOD）。SOD 广泛存在于真核细胞与原核
细胞的细胞质、线粒体和叶绿体中，可清除生物体
内超氧阴离子自由基，有效地抵御氧自由基对有机
体的伤害［28］，研究还发现大豆在感染 SMV 后引起
了活性氧的累积，诱导防御酶活性的增强，从而使
SOD 活性的上升［29］，而 SOD 在 TYr10 中表达有明
显上升可能与其抗病性有关。M7Z0K9 为甲硫氨酰
氨肽酶（Methionine aminopeptidase，MetAP）。MetAP
在细胞内的主要功能是切除细胞内新合成蛋白的 N
端甲硫氨酸，在细胞信号转导、蛋白互作、肿瘤生
长以及细菌和病毒感染等生理病理过程发挥着重要
的作用［30，31］，但是与 TYr10 的抗病性的关系尚不
清楚。M7ZME5 为溶酶体 -β-葡萄糖苷酶（Lysosomal
beta glucosidase）。 马 成 等［8］ 曾 报 道 Taichung29*6/
Yr5 叶片在接种条锈菌 CYR32 后 β-葡萄糖苷酶水平
下降，本研究发现溶酶体 -β-葡萄糖苷酶在未接种的
TYr10 中表达较 T29 低，提示该蛋白可能与抗病性
有一定相关性。本研究还鉴定到 6 个与运转相关的
差异蛋白，其中 Q5G1L6 为铁蛋白（Ferritin）。铁蛋
白广泛存在于动物、植物和微生物体内，在植物中
作为专门的贮铁蛋白，是植物光合作用和固氮等生
化反应的铁源，不仅调节体内铁的含量，而且是一
种重要的胁迫反应蛋白，在植物的发育、抵抗氧化
损害等方面发挥重要的作用［32］，该蛋白在 TYr10 中
的高表达可能与其抗病性有关。此外，还鉴定到 4
个应激反应相关的差异蛋白，其中 M7Z2R9（Putative
disease resistance protein RXW24L）与 Q6PWL8（Put-
ative vacuolar defense protein） 在 TYr10 表 达 明 显 提
高，可能与该近等基因系的抗病机制相关，值得进
一步研究。多年来，育种工作者一直以选育和推
广抗病品种作为病害的主要防治手段，且颇见成
效，但小麦抗条锈性丧失和抗条锈病机理一直是未
能解决的问题。对近等基因系 Taichung 29*6/Yr10
差异表达蛋白的分析，为理解小麦抗条锈性丧失和
研究 Yr10 基因的抗条锈病机理提供了新的线索和
思路。
4 结论
利用质谱非标定量技术可有效地进行小麦蛋白
质组定量分析，运用该技术从小麦抗病单基因近等
基因系 Taichung 29*6/Yr10 和背景品种 Taichung 29
叶片中共鉴定到 102 个差异表达蛋白。已鉴定到的
差异表达蛋白大多定位于细胞基质以及核糖体等细
胞器，具备结合、催化等功能，主要参与代谢、细
胞过程、应激等生物学进程，其中超氧化物歧化
酶、甲硫氨酰氨肽酶、溶酶体 -β-葡萄糖苷酶和铁
蛋白等可能与小麦抗病单基因近等基因系 Taichung
29*6/Yr10 的抗病性有一定相关性。
致谢 ：质谱分析和数据处理得到赛默飞世尔科
技（中国）有限公司色谱与质谱部聂爱英博士的帮助。
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（责任编辑 马鑫）