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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):158-166
收稿日期 ：2014-09-22
基金项目 ：江苏省自然科学基金项目（BK20130932），江苏省高校自然科学基金项目（13KJB530009）
作者简介 ：王世锋，男，硕士研究生，研究方向 ：微生物发酵工程 ；E-mail ：sg3ever@126.com
通讯作者 ：雍晓雨，男，博士，讲师，研究方向 ：应用微生物 ；E-mail ：yongxiaoyu@njtech.edu.cn
Bacillus amyloliquefaciens C1 菌株 γ-PGA 合成基因
pgsBCAE 的克隆与表达
王世锋1，2 何剑1，2 陈怡露1 郑涛1，2 沈其荣3 雍晓雨1，2
（1. 南京工业大学生物与制药工程学院，南京 211816 ；2. 南京工业大学 生物能源研究所，南京 211816 ；
3. 南京农业大学资源与环境科学学院，南京 210095）
摘 要： γ-PGA 是微生物合成的一种新型高分子生物可降解材料，基因工程菌株的构建对于其合成机理及开发生产具有较高
的研究价值。利用 Self-Formed Adaptor PCR（SEFA-PCR）方法扩增出菌株 B. amyloliqueficiens C1 的 γ-PGA 合成酶基因簇 pgsBCAE，
将其克隆到表达载体 pET29a（+）中并转化至表达宿主 E.coli BL21（DE3）。结果表明，转化所得的工程菌株在 IPTG 诱导下通过摇
瓶发酵生产 0.14 g/L 的 γ-PGA。Mn2+ 和 Zn2+ 能够显著促进重组子 E.coli BL21（pET29α-pgsBCAE）发酵合成 γ-PGA 的产量，并且这
种促进作用随着 Mn2+ 和 Zn2+ 浓度的提高而越加显著。Mg2+ 在低浓度（1 mmol/L）下也促进重组子合成 γ-PGA，之后随着 Mg2+ 浓度
的升高，这种促进作用逐渐减弱，当 Mg2+ 浓度达到 4 mmol/L 时，反而抑制重组子 γ-PGA 的合成。菌株 B. amyloliqueficiens C1 基因
组内含有完整的 γ-PGA 合成酶基因簇 pgsBCAE，该基因簇能够在表达宿主 E. coli BL21 中被诱导表达并合成 γ-PGA，且其 γ-PGA 的
合成受金属离子的影响。
关键词 ： γ-多聚谷氨酸 ；合成基因 ；SEFA-PCR ；异源表达 ；金属离子
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.025
Clone and Heterologous Expression of the Poly-γ-glutamic Acid
Synthesis Gene pgsBCAE from Bacillus amyloliquefaciens C1
Wang Shifeng1，2 He Jian1，2 Chen Yilu1 Zheng Tao1，2 Shen Qirong3 Yong Xiaoyu1，2
（1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing TECH University，Nanjing 211816 ；2. Bioenergy Research Institute，
Nanjing TECH University，Nanjing 211816 ；3. College of Resources and Environmental Science，Nanjing Agricultural University，
Nanjing 210095）
Abstract: Poly-γ-glutamic acid（γ-PGA）, a new type of biodegradable material with high molecular weight, is synthesized by many
microbes; the construction of genetic engineering strain will be highly valuable to the research of synthesis mechanism and production of γ-PGA.
The gene cluster, pgsBCAE, involving in the biosynthesis of γ-PGA in Bacilus amyloliqueficiens C1 were amplified by SEFA-PCR, which were
then ligated in expression vector pET29a（+）and transformed into E. coli BL21（DE3）host cells. The recombinant clone, E. coli BL21
（pET29a-pgsBCAE）induced by IPTG obtained the ability to synthesize γ-PGA by fermentation in shake flask, and the yield of γ-PGA was 0.14 g/L.
Both Mn2+ and Zn2+ increased γ-PGA production of E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）. With the increase of the concentration of Mn2+ and Zn2+,
this promotion became much more significantly. On the other hand, Mg2+ in low concentration（1 mmol/L）also promoted γ-PGA production, the
promotion decreased with the increase of Mg2+ concentration, while high concentration of Mg2+（4 mmol/L）inhibited γ-PGA production of the
recombinant clone significantly. The above results suggested that Bacilus amyloliqueficiens C1 contained the intact gene cluster pgsBCAE for the
synthesis of γ-PGA, which can be cloned and expressed in E. coli BL21. The production of γ-PGA in the genetic engineering strain was affected
by several metal ions.
Key words: poly-γ-glutamic acid ；synthesis gene ；SEFA-PCR ；heterologous expression ； metal ions
2015,31(5) 159王世锋等 ：Bacillus amyloliquefaciens C1 菌株 γ-PGA 合成基因 pgsBCAE 的克隆与表达
γ-多聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是
微生物利用 D-和/或 L-谷氨酸通过 α-氨基与 γ-羧基
之间形成 γ-酰胺键聚合而成的一种阴离子型高分子
聚合物，具有水溶性、可生物降解、可食用等特点，
对人体和环境安全。其分子内含有大量游离羧基，
对养分具有较大的亲和力，同时又具有较强的保湿
和吸水性，近年来在食品工业、化妆品生产、制药业、
污水处理和农业等方面具有广泛的应用［1］。
Green 等［2］发现 B. anthracis 的 γ-PGA 合成基因
存在于质粒 pXO2 上 ；而 Candela 等［3］ 发现 capB、
capC、capA 和 capE 是 影 响 γ-PGA 合 成 最 主 要 的 4
个 基 因。Ashiuchi 等［4，5］ 报 道 了 在 B. subtilis IFO
3336 中有 3 个基因参与了 γ-PGA 的合成，分别为
pgsB、pgsC 和 pgsA。Candela 等［3］于 2005 年在该 3
个基因下游发现了一小段开放阅读框，命名为 pgsE。
该段序列与 capE 同源性很高，所以 pgsE 极有可能
也参与 γ-PGA 的合成。B. amyloliqueficiens C1 是本实
验室自行从菜园土中筛选的一株高产 γ-PGA 的菌株，
其摇瓶发酵产量能够达到 18.4 g/L，相对分子质量为
1.8×103 kD，且 PCR 结果显示该菌株拥有 γ-PGA 合
成所需的相关基因 pgsABC。B. licheniformis［6］和 B.
subtilis natto［7］等菌株常被用来生产 γ-PGA，但野生
菌株的遗传不稳定性可能会导致 γ-PGA 合成能力的
降低甚至丧失，γ-PGA 的降解，以及在某些生长状
态下产生大量的胞外多糖类副产物。与传统的诱变
育种相比，新兴的基因工程手段有望成为 γ-PGA 高
产菌的有效改造方式。马婕等［8］将 B. subtilis 168 模
式菌株的 γ-PGA 合成基因 ywsC、ywtA 和 ywtB 连接
到 pTrcHisA 载体后转化至宿主菌 E. coli BL21（DE3），
其 γ-PGA 产量最高可达 0.134 g/L。Ashiuchi 等［4］将
pgsBCA 基因通过融合表达的手段克隆到 pTrc99A 质
粒中，并将此质粒转化 E.coli JM109 中，获得的阳性
克隆中能够得到 0.024 g/L 的 γ-PGA。Jiang 等［9］将 B.
subtilis subsp. chungkookjang 中的 pgsBCA 基因分别克
隆到以 Ptrc 和 PHCE 为启动子的质粒中，得到重组质
粒 pMpgsBCA 和 pCOpgs，然后将这两个质粒分别转
入 E. coli BL21（DE3）、W3110 及 FMJ123 中，结果
转入了 pMpgsBCA 的 E. coli BL21（DE3）合成了最
高产量的 γ-PGA，为 0.061 g/L。
本研究以 B. amyloliquefaciens C1 基因组的 DNA
为模板，扩增出 γ-PGA 合成基因 pgsBCAE 后，将其
克隆入表达载体 pET29a（+）中，该载体转化 E.coli
BL21（DE3）后发酵，并设法提高重组菌中 γ-PGA
的产量，旨在为以 B. amyloliquefaciens C1 为基础构
建高产 γ-PGA 的工程菌提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 本研究所用菌株和质粒见表 1。
表 1 菌株和质粒
菌株和质粒 基本特性 来源
菌株
E.coli DH5α F-recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsrdR17 supE44 relA1 deoRΔ（lacZYA-argF）U169 Lab stock
E.coli BL21（DE3） hsdS gal（λcIts857 ind1 Sam7 nin5 lac UV-5-T7） Lab stock
C1 γ-PGA producing strain，wild type This work
质粒
pMD19-T vector AmpR，cloning vector TaKaRa
pET29a（+） KanR，expression vector under the control of T7 promoter Lab stock
pMD19-T-pgsBCAE AmpR，pMD19-T，containing pgsBCAE gene This work
pET29a（+）-pgsBCAE KanR，pET29a（+），pgsBCAE in Kpn I and BamH I sites This work
1.1.2 培 养 基 与 试 剂 LB 培 养 基（g/L）：蛋 白
胨 10，酵母膏 5，NaCl 10，pH7.0 ；液体发酵培养
基 ：柠檬酸 13.5，谷氨酸 10，NH4Cl 6.8，甘油 75，
K2HPO4 1，pH7.2 分别加入 ：（1）0、0.1、0.2 和 0.4
mmol/L 的 ZnCl2 ；（2）0、0.1、0.2 和 0.4 mmol/L 的
FeCl3 ；（3）0、1、2 和 4 mmol/L 的 MgSO4 ；（4）0、
0.2、0.4 和 0.8 mmol/L 的 MnSO4；Taq 酶、LA Taq 酶、
PrimeSTAR HS DNA Polymerase、限制性内切酶、GC
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5160
buffer、T4 DNA 连接酶等分子试剂均购自 TaKaRa 公
司 ；抗生素均购自上海生物工程有限公司。
1.1.3 抗 生 素 氨 苄 青 霉 素（Amp） 浓 度 为 100
μg/mL，卡那霉素（Kan）浓度为 50 μg/mL。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 和质粒 DNA 的提取 采用 Axy-
Prep 细菌基因组 DNA 小量试剂盒提取目标菌株基因
组 DNA，采用 AxyPrep Plasmid Miniprep Kit 试剂盒
提取质粒，具体方法参见说明书。
1.2.2 pgsBCAE 基因的 SEFA-PCR 扩增
1.2.2.1 PCR 扩增引物 本研究所用引物见表 2。
表 2 引物序列
引物名称 引物序列（5-3） 说明
pgsB-S ATGTGGTTACTCATTATAGCCTGTG
pgsB-AS CTAGCTTACGAGCTGCTTAACCT
5SP1 CTCGCCGATATTCGGGCCCTGCG
5SP2 GCATCTGTTCCCGTCGTT
5SP3 CTCGTTACGGTTGACTTNNNNNNN-
NNACCATT
N=A/G/C/T
3SP1 CGGCGAGACGTCAGAACCGATCG
3SP2 GAAATCATGGACGTGCTG
3SP3 TCGGCAATATCCACGGNNNNNNNN-
NACCATT
N=A/G/C/T
pgsBCAE-F GGGGTACCATGTGGTTACTCATTA-
TAGCCT
Kpn I 酶切位点
pgsBCAE-R CGGGATCCGGTTTTGCGCCCGCTG-
TGTCCT
BamH I 酶切位点
1.2.2.2 pgsB 基 因 的 PCR 扩 增 利 用 引 物 pgsB-S
和 pgsB-AS（表 2），以菌株 C1 的总 DNA 为模板扩
增 pgsB 基因片段。PCR 反应条件为 ：94℃ 5 min ；
94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 90 s，32 个循环 ；72℃，
10 min ；10℃，10 min。
1.2.2.3 SEFA-PCR 法扩增 pgsBCAE 的全长基因 根
据已获得的 pgsB 基因序列设计 SEFA-PCR 引物（表
2），上游引物为 5SP1、5SP2 和 5SP3，下游引物为
3SP1、3SP2 和 3SP3，然后利用 SEFA-PCR 法［9］获
得 pgsB 基因的上下游序列，测序后对上下游片段进
行拼接，在 NCBI 网站中进行序列比对，并用 Omiga
软件进行序列分析。SEFA-PCR 扩增体系和反应条
件如下 ：
（1）SEFA-PCR-1 ：只加 SP3 作为引物。
SEFA-PCR-1 体系（30 μL）：2×GC Buffer 15 μL；
dNTP 5 μL ；模 板 DNA 3 μL ；SP3（5SP3 或 3SP3）
1 μL ；LA-Taq 0.5 μL ；ddH2O 5.5 μL。
SEFA-PCR-1 反应程序 ：94℃ 3 min ；94℃ 30 s ；
35℃ 3 min ；0.2℃/s 直到 72℃ ；72℃ 5 min。
（2）SEFA-PCR-2 ：保持 SEFA-PCR-1 最后一步
72℃，加 3 μL SP1（5SP1 or 3SP1）。
SEFA-PCR-2 反应程序 ：94℃ 3 min ；94℃ 30 s ；
56℃ 5 min ；72℃ 5 min ；Go to 2 step 25 cycles ；94℃
30 s ；56℃ 5 min ；72℃ 5 min ；Go to 6 step 1 cycle ；
94 ℃ 30 s ；50 ℃ 30 s ；72 ℃ 5 min ；Go to 6 step 10
cycles ；72℃ 6 min ；10℃ forever ；End。
（3）SEFA-PCR-3 ：以 SEFA-PCR-2 的产物（稀
释 10 倍）为模板，只加 SP2 作为引物。
SEFA-PCR-3 体 系（30 μL）：2×GC Buffer 15
μL ；dNTP 4 μL ； 模 板 DNA 2 μL ；SP3（5SP3 或
3SP3）1 μL ；LA-Taq 0.5 μL ；ddH2O 7.5 μL。
SEFA-PCR-3 反应程序 ：94℃ 3 min ；94℃ 30 s ；
56℃ 5 min ；72℃ 5 min ；Go to 2 step 30 cycles ；72℃
10 min ；10℃ forever ；End。
1.2.3 重组表达载体的构建
1.2.3.1 pgsBCAE 基 因 的 PCR 扩 增 根 据 SEFA-
PCR 测序结果最终拼接的 pgsBCAE 全长基因设计引
物，并在正向和反向引物前分别加入 Kpn I 酶切位点
和 BamH I 酶切位点（表 2）。PCR 扩增产物经纯化、
酶连、转化、阳性转化子验证、质粒提取、序列测定，
最终获得含有质粒 pMD-pgsBCAE 的阳性转化子，并
提取质粒 pMD-pgsBCAE。
PCR 反应体系（50 μL）：5×Prime STAR Buffer
（Mg2+ plus）10 μL ；dNTP 4 μL ；pgsBCAE-F 1 μL ；
pgsBCAE-R 1 μL ；DNA 1 μL ；PrimeSTAR HS DNA
Polymerase 0.5 μL ；ddH2O 32.5 μL。
PCR 反应条件为 ：98℃ 2 min ；98℃ 10 s ；52℃
15 s ；72℃ 3.5 min ；Go to 2 step 30 cycles ；72℃ 10
min ；10℃ forever ；End。
1.2.3.2 DNA 的酶切反应 Kpn I 酶切反应于 37℃过
夜进行，BamH I 酶切反应于 30℃过夜进行。检测型
酶切反应结束后加 10%（V/V）电泳上样缓冲液中
止酶切反应，并进行琼脂糖电泳检测，制备型酶切
2015,31(5) 161王世锋等 ：Bacillus amyloliquefaciens C1 菌株 γ-PGA 合成基因 pgsBCAE 的克隆与表达
反应结束后切胶回收。
（1） 制 备 型 酶 切 反 应 体 系（100 μL）：10 ×
Buffer 10 μL ；质粒 DNA 70 μL ；限制性内切酶 5 μL ；
ddH2O 15 μL。
（2） 检 测 型 酶 切 反 应 体 系（10 μL）：10 ×
Buffer 1 μL ；质粒 DNA 7 μL ；限制性内切酶 1 μL ；
ddH2O 1 μL。
1.2.3.3 目的基因片段的获得 参照制备型酶切体
系，用 Kpn I 和 BamH I 进行分步酶切，电泳检查酶
切效果。对已完全酶切的产物进行切胶回收，溶解
于 50 μL ddH2O 中，核酸定量仪检测 DNA 浓度，立
即酶连或于 -20℃保存备用。
1.2.3.4 表达载体 pET29a 的制备 参照制备型酶切
体系，用 Kpn I 和 BamH I 进行分步酶切，电泳检查
酶切效果。对已完全酶切的产物进行切胶回收，溶
解于 50 μL ddH2O 中，核酸定量仪检测 DNA 浓度，
立即酶连或于 -20℃保存备用。
1.2.3.5 pgsBCAE 重组表达载体的构建 将 B. amyl-
oliquefaciens C1 菌株合成 γ-PGA 完整的基因簇 pgs-
BC-AE 克隆到表达载体 pET29a（+）中，转化至表
达宿主载体 E. coli BL21 感受态细胞中，在 T7 lacZ
启动子的控制下，进行异源表达，以此构建 γ-PGA
合成基因工程菌株。重组表达载体设计路线如图 1
所示。
图 1 重组表达载体 pET29a（+）-pgsBCAE 构建技术路线
LacZ α-peptide
Cloning site
Kpn I 413
Kpn I 239 BamH I 199
KpnI 8 BamH I 3427 BamH I 2996 BamH I 418 Kpn I 439 KpnI 413
BamH I 199
Kpn I 3195
BamH I 418 Kpn I 8 BamH I 2996 PCR Amplification
pgsBCAE-Kpn I/BamH I
3002 bp
T4 clone to pMD19-T vector
Digest by Kpn I and BamH I
LacZ α-peptide partial
Ampicillin resistance gene
pUC origin
pUC origin
T7 terminator
His-Tag coding sequence
T7 promoter
f1 origin
Kan coding sequence
pET29a +
5371 bp lacl coding sequence
Digest by Kpn I and BamH IpBR322 ori
f1 origin
T7 terminator
His-Tag coding sequence
Kan coding sequence
pBR322 origin
pET29a + -pgsBCAE-Kpn I BamH I
8327 bp
pgsBcaE
LacZ α-peptide partial pgsBCAE-Kpn I/BamH IpMD19-T-pgsBCAE-Kpn I/BamH I5694bp
T7 promoter
lacl coding sequence
pgsBCAD-Kpn I/BamH I
3002 bp
T4 Ligation
pMD19-T vector
2692 bp
Ampicillin resistance gene
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5162
2000
DL2000
第一轮
产物
第二轮
产物
3295bp
λ-HindIII
DL2000
第一轮
产物
第二轮
产物
2484 bp
λ-HindIII
bp
M1 1 2 M2 M1 3 4 M2
bp
2313
9716
6557
4361
2322
2027
564
A B
1000
750
500
250
100
M1：DL2000 DNA Marker；1：上游序列第一轮产物；2：上游序列第二轮产物；
3 ：下游序列第一轮产物 ；4 ：下游序列第二轮产物 ；M2 ：λ/Hind III DNA
Marker
图 3 pgsB 基因片段上游（A）、下游（B）序列的 SEFA-
PCR 扩增图
2000
bp
M 1
1000
750
500
250
100
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：pgsB 基因的 PCR 产物
图 2 pgsB 基因的 PCR 扩增产物电泳图
1.2.3.6 酶连、转化 酶连反应于 16℃过夜进行，
酶连产物转化 E.coli DH5α 感受态，挑取验证阳性转
化子后，提取质粒送去测序。将经测序验证正确的
重组质粒再转化至 E.coli BL21 感受态细胞，挑取验
证阳性转化子后，最终获得含有 pET29-pgsBCAE 重
组表达载体的转化子。
1.2.4 pgsBCAE 的 诱 导 表 达 挑 取 E. coli BL21 菌
落， 接 入 3 mL 含 卡 那 霉 素（50 μg/mL） 的 LB 培
养液，37℃培养过夜。取 500 μL 过夜培养物接入
50 mL 含卡那霉素（50 μg/mL）的液体发酵培养液，
37℃振荡培养 2 h 以上，至对数中期（OD600=0.5）。
吸取 1 mL 未经诱导的培养物至微量离心管中，置于
4℃冰箱待用。在剩余培养物中加入 IPTG 至终浓度
1 mmol/L，30℃、180 r/min 继续通气培养。
1.2.5 金 属 离 子 对 pET29-pgsBCAE 转 化 子 合 成
γ-PGA 的影响 配制 0.01 mol/L 的 ZnCl2、0.02 mol/L
MnCl2、0.1 mol/L MgCl2，分别加入 γ-PGA 液体发酵
培 养 基 中， 分 别 使 得 ：Zn2+ 浓 度 为 0、0.1、0.2 和
0.4 mmol/L ；Mn2+ 浓度为 0、0.2、0.4 和 0.8 mmol/L ；
Mg2+ 浓度为 0、1.0、2.0 和 4.0 mmol/L。检测不同金
属离子及其浓度对 pET-pgsBCAE 转化子合成 γ-PGA
的影响。
1.2.6 γ-PGA 的提取纯化 发酵液 15 000×g 离心
20 min 后，取上清，加入 4 倍体积的预冷无水乙醇，
静置过夜，12 000×g 离心，沉淀用去离子水溶解
后，去离子水透析过夜（透析袋截留分子量 9 kD），
冷冻干燥得到固体初提物。初提物用去离子水溶解，
12 000×g 离心，上清加 20 mg/mL 蛋白酶 K，去离
子水透析过夜，再按上述方法离心，取上清冷冻干
燥，得到 γ-PGA 固体纯化样品，-70℃保存。
1.2.7 γ-PGA 的水解 取纯化的 γ-PGA 样品 0.2 g 放
入水解管中，加入 10 mL 6 mol/L 的 HCl，抽真空，
维持 1 min 后封口，110℃水解 12-24 h，冷却后过滤，
再用旋转式蒸发仪除去盐酸浓缩，洗提 3 次，最后
定容到 10 mL。
1.2.8 γ-PGA 的水解产物氨基酸分析 采用 Bioch-
rom 30 专用自动氨基酸分析系统测定所得水解产物
中游离谷氨酸含量，上样量为 20 μL。
2 结果
2.1 pgsB基因的PCR扩增
用常规 PCR 方法扩增出 pgsB 基因片段，测序
结果（图 2）显示其长度为 1 182 bp。经 NCBI 数据
库比对发现该序列与 B. amyloliquefaciens LL3 菌株的
pgsB 基因（登录号 HM034756.1）同源性达到 100%，
同时申请 NCBI 登录号（HQ599194.1）。
2.2 pgsB基因片段上、下游序列的SEFA-PCR扩增
扩增结果如图 3 所示。对上、下游扩增片段（图
3-A3、B3 泳道）进行切胶回收并纯化后，酶连到克
隆载体 pMD19-T 上并转化 E. coli DH5α 感受态，挑
选阳性转化子送测序，结果显示，利用 SEFA-PCR
2015,31(5) 163王世锋等 ：Bacillus amyloliquefaciens C1 菌株 γ-PGA 合成基因 pgsBCAE 的克隆与表达
扩增出的 pgsB 基因上游片段为 3 295 bp，下游片段
为 2 484 bp。
2.3 上、下游序列的拼接与分析
利用 DNAMan 软件对 pgsB 基因上下游序列进
行拼接，并用 OMIGA 软件进行 ORF（open reading
frame）分析。结果（图 4）表明，获得了 γ-PGA 完
整的合成基因，共 4 个 ORF，分别为 pgsB、pgsC、
pgsA 和 pgsE，并在 pgsB 上游发现 750 bp 的非编码
区域，可能是其调控序列。完整的 pgsBCAE 基因
序 列 为 2 995 bp， 与 模 式 菌 株 B. amyloliquefaciens
2.5 pgsBCAE重组表达载体的构建
以菌株 B. amyloliquefaciens C1 的基因组 DNA 为
模板，利用 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶扩增 pgsBC-
AE 基因，并利用引物在其两端分别引入 Kpn I 和
BamH I 酶切位点。将 PCR 产物经末端加 A 尾后酶
连入 pMD19-T vector，经转化后获得 pMD19-pgsBC-
AE。用 Kpn I 和 BamH I 分步单酶切 pMD19-pgsBCAE
及 pET29a（+）。回收双酶切后的 pgsBCAE 片段（3
kb 左右）与 pET29a（+）载体（5.5 kb 左右），将获
得的两片段通过 T4 连接酶催化反应进行连接，连接
产物转化 E.coli TOP10 菌株，转化后的菌株发酵并
提取质粒，筛选阳性克隆。将所得重组质粒测序验证，
FZB42（ 登 录 号 CPOOO560.1）、B. amyloliquefaciens
DSM7（登录号 FN597644.1）的 γ-PGA 合成酶基因
同源性达到了 100 %。
2.4 pgsBCAE基因簇中各基因的验证
按 照 SEFA-PCR 扩 增 出 的 pgsBCAE 序 列 分
别 设 计 PCR 扩 增 pgsBCAE 完 整 基 因 簇 及 单 个 基
因 pgsB、pgsC、pgsA、pgsE 的 引 物， 并 以 菌 株 B.
amyloliquefaciens C1 基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩
增，结果（图 5）显示，能够扩增出 pgsBCAE 以及
pgsB、pgsC、pgsA、pgsE 四个基因。
pgsE
pgsApgsC
3.0 kb2.0 kbpgsB1.0 kb0.0 kb
2000
bpbp
1000
750
500
250
100
2313
pgsBCAD
A B C D E
2995
pgsA
1149
pgsB
1182
pgsC
450
pgsE
162
bp bp bp bp bp
M1 1 M2 2 M2 3 M2 4 M2 5
9716
6557
4361
2322
2027
564
图 4 pgsBCAE 基因序列的 ORF 分析
1 ：pgsBCAE 完整基因簇（2 995 bp）的 PCR 扩增产物电泳图 ；2 ：pgsA 基因（1 149 bp）的 PCR 扩增产物电泳图 ；3 ：pgsB（1 182 bp）的
PCR 扩增产物电泳图 ；4 ：pgsC 基因（450 bp）的 PCR 扩增产物电泳图 ；5 ：pgsE 基因（168 bp）的 PCR 扩增产物电泳图 ；- ：对照组
图 5 SEFA-PCR 结果的验证
并将测序结果正确的重组质粒转化进 E. coli BL21 感
受态中，获得含有重组表达载体 pET29-pgsBCAE 的
基因工程菌株。各步骤的电泳检测图谱见图 6。
2.6 重组子γ-PGA产量分析
对重组子 γ-PGA 合成基因 pgsBCAE 进行 IPTG
诱导表达，并提取其发酵液中 γ-PGA。由图 7 可知，
重组子 E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）在 γ-PGA 发
酵培养基中经 IPTG 诱导培养 48 h 后能够合成 0.14
g/L 的 γ-PGA。说明在 IPTG 诱导下，重组子中 γ-PGA
合成基因能够高效表达。
2.7 金属离子对重组子γ-PGA产量的影响
Zn2+、Mg2+ 和 Mn2+ 对重组子 E. coli BL21（pET-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5164
29a-pgsBCAE）发酵合成 γ-PGA 的产量有显著影响
（图 8）。Zn2+ 浓度为 0.1 mmol/L 时就能够促进重组子
E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）γ-PGA 的 合 成， 此
时 γ-PGA 的产量为 0.27 g/L，随着 Zn2+ 浓度的提高，
其对 E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）γ-PGA 的合成
促进效果越显著，并且在 Zn2+ 浓度为 0.4 mmol/L 达
到最大，此时 γ-PGA 的产量达到 0.66 g/L，相较于
CK 提高了 370%。Mn2+ 显示出与 Zn2+ 类似的促进效
果，并且在 Mn2+ 浓度为 0.8 mmol/L 时，γ-PGA 的产
量达到 0.53 g/L，相较于 CK 提高了 280%。与 Zn2+
和 Mn2+ 不同，Mg2+ 在低浓度（1 mmol/L）条件下对
重组子合成 γ-PGA 的促进作用达到最大（0.49 g/L），
之后随着 Mg2+ 浓度的升高，这种促进作用逐渐减弱，
当 Mg2+ 浓度达到 4 mmol/L 时，反而抑制重组子 γ-PGA
的合成。此时 γ-PGA 的产量仅为 0.08 g/L，相较于
CK 下降了 42.8%。
3 讨论
目 前 对 γ-PGA 合 成 基 因 的 研 究 主 要 集 中 在
B. subtilis。 例 如 Ashiuchi 等［4］ 在 1999 年 发 现 在
B. subtilis IFO 3336 中 有 3 个 基 因（pgsB、pgsC 和
pgsA） 参 与 γ-PGA 的 合 成。2001 年， 他 们 又 在 B.
subtilis（chungkookjang）中将 pgsB、pgsC 和 pgsA 基
因敲除，于是突变株无法合成 γ-PGA，证明这 3 个
基因是 γ-PGA 合成所必需的［5］。而通常对 γ-PGA 合
23130
9716
6557
4361
2322
20272000
bp
M1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M2
bp
1000
750
500
250
100
564
M1 ：DL2000 Marker ；1 ：pgsBCAE ；2 ：pET29a（+）；3 ：pET29a-pgsBCAE ；4 ：
pET29a-pgsBCAE 的 Kpn I 和 BamH I 酶切产物 ；5 ：pET29a-pgsBCAE 的 Kpn
I 酶切产物 ；6 ：pET29a-pgsBCAE 的 BamH I 酶切产物 ；7 ：pET29a 的 Kpn I
酶切产物 ；8 ：pET29a 的 BamH I 酶切产物 ；9 ：pET29a 的 Kpn I 和 BamH I
酶切产物 ；M2 ：λHind Ⅲ Marker
图 6 pET29a-pgsBCAE 重组质粒构建电泳检测图谱
0
230
240
250
260
270
280
290
300
310
320
330
340
350
360
370
380
390
400
m
V
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23ᰦ䰤minщ≘䞨 Ala 19.493䉧≘䞨 Glu
12.620 㕜≘䞨 Val 21.140 Ӟ≘䞨 Leu 25.077 ≘ Amm 40.524
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46
图 7 重组子 E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）合成的 γ-PGA 水解后氨基酸分析图
成基因的研究也仅仅是针对 pgsBCA 三个基因及其
产物 PgsB、PgsC 和 PgsA。PgsB 具有酰胺连接酶活
性，其 N-端有一段疏水区，此区域与 PgsB 和细胞
膜、PgsC、PgsA 的连接紧密相关，被认为是催化合
成 γ-PGA 的主要组分［11］。PgsA 含有与细胞膜结合
的位点，并可在细胞表面定位。PgsA 的功能是从
γ-PGA 的合成酶系中转移合成的 γ-PGA，并使 γ-PGA
的合成酶系稳定地锚定在细胞膜上，因此 PgsA 是
γ-PGA 的运输载体，并对 γ-PGA 的延长十分重要［5］。
PgsC 是 γ-PGA 合成酶系统中可以与细胞膜结合的组
2015,31(5) 165王世锋等 ：Bacillus amyloliquefaciens C1 菌株 γ-PGA 合成基因 pgsBCAE 的克隆与表达
分之一，也是 γ-PGA 的合成所必需［12］。而在 2010
年，Yamashiro 等［13］发现，在 pgsBCA 之后还有一
个 168 bp 的 ORF，能够编码一个由 55 个氨基酸残
基组成的 6.5 kD 大小的蛋白，该蛋白能够促进 B.
subtilis 菌株 γ-PGA 的合成，并且 Zn2+ 能够激活该蛋
白的活性。这个基因即为 pgsE。本研究最初拟根据
报道的 B. subtilis 的 γ-PGA 合成基因为模板设计引
物，扩增 B. amyloliqueficiens C1 菌株 γ-PGA 合成基
因，但是只有 pgsB 能够被扩增出，而 pgsA、pgsC
以及 pgsBCA 全长基因簇始终扩增不出。这可能是
因 为 B. subtilis 与 B. amyloliqueficiens 的 γ-PGA 合
成基因存在差异。Self-Formed Adaptor PCR（SEFA-
PCR）是由王世明博士设计开发的一种新的 PCR 技
术，能够由已知序列扩增其两端未知序列扩增，扩
增片段最长可达 6-8 kb［10］。因此，作者以已扩增
出 的 pgsB 基 因 序 列 为 模 板 设 计 SEFA-PCR 引 物，
扩增 pgsB 基因的上下游片段，测序后拼接获得 B.
amyloliqueficiens C1 菌株合成 γ-PGA 的基因簇全长。
上游序列引物为 ：5SP1、5SP2、5SP3，下游序列引
物为 ：3SP1、3SP2、3SP3。本研究通过 SEFA-PCR
扩增，作者也在 B. amyloliqueficiens C1 菌株 pgsBCA
基因后发现了这个小片段的 ORF。因此后期实验中
主要针对 pgsBCAE 基因簇进行研究。
在 γ-PGA 合成过程中有许多酶类参加反应，而
金属离子在保持酶的活性中心构象以及维持酶活性
有重要的作用［14］。培养基中金属离子浓度对 γ-PGA
的生产具有重要的影响，例如 PgsB 上有 Mg2+/ATP
结合位点［12］。研究发现 Mn2+、Mg2+ 等对 B. subtilis
合 成 γ-PGA 有 影 响［15，16］。 高 浓 度 的 Mn2+ 抑 制 B.
subtilis 的生长，但是却可以延长细胞生存能力进而
提高 γ-PGA 的产量［16，17］。Mn2+、Mg2+ 可能控制着专
一性很强的 D-和 L-多肽合成酶系统。γ-PGA 的聚合
度和 D-/L-构型比率都与金属离子的浓度有密切关
系，不同浓度的 Mn2+ 直接影响 γ-PGA 中 L-谷氨酸、
D-谷氨酸的比例，例如培养基中 Mn 2+ 的浓度也可改
变 B. licheniformis ATCC 9945A 合成 γ-PGA 中 D-谷氨
酸与 L-谷氨酸的比例［18］。本研究发现，Mn2+ 和 Zn2+
能够显著促进重组子 E. coli BL21（pET29a-pgsBCAE）
发酵合成 γ-PGA 的产量，并且这种促进作用随着
Zn2+ 浓度的提高而越加显著。但是 Mg2+ 的作用与
Zn2+ 和 Mn2+ 不同。Mg2+ 在低浓度（1 mmol/L）条件
下对重组子合成 γ-PGA 的促进作用达到最大（0.49
g/L），之后随着 Mg2+ 浓度的升高，这种促进作用逐
渐减弱，当 Mg2+ 浓度达到 4 mmol/L 时，反而抑制重
组子 γ-PGA 的合成。此时 γ-PGA 的产量仅为 0.08 g/L。
因此在以后的发酵培养中，可以通过调节培养基中
金属离子（如 Mn2+、Zn2+、Mg2+）的种类和浓度对发
酵菌株生产 γ-PGA 进行调节。
本研究将重组载体转化入 E. coli BL21 宿主菌
中，在 IPTG 诱导下，使其具有了 γ-PGA 生物合成
能力。但是由于 E. coli 为革兰氏阴性菌，而野生菌
株（B. amyloliqueficiens C1）为革兰氏阳性菌，两者
细胞膜结构不同，且蛋白质分泌系统也存在差异，
可能导致重组表达的 γ-PGA 合成酶系统不能很好地
在细胞膜上定位［19］，因此表达宿主菌 E. coli BL21
（pET29a-pgsBCAE）的 γ-PGA 产量较低。另外，载
体质粒的表达体系的影响也是引起表达量较低的可
能原因之一。后期研究中，为了构建高效 γ-PGA 生
产的基因工程菌，可以从以下几点入手 ：（1）将
γ-PGA 合成酶基因转入芽孢杆菌表达系统中进行表
达 ；（2）在重组质粒 γ-PGA 合成酶基因之间加上强
启动子增强其表达。
4 结论
利用 SEFA-PCR 方法成功克隆出 B. amylolique-
0
1 2 3 4 5༴⨶6 7 8 9 100.20.4γ-PGAӗ䟿/g·L-1 0.6
0.8
1 ：CK ；2 ：Zn2+ 0.1 mmol/L ；3 ：Zn2+ 0.2 mmol/L ；4 ：Zn2+ 0.4 mmol/L ；
5 ：Mg2+ 1 mmol/L ；6 ：Mg2+ 2 mmol/L ；7 ：Mg2+ 4 mmol/L ；8 ：Mn2+ 0.2 mmol/L ；
9 ：Mn2+ 0.4 mmol/L ；10 ：Mn2+ 0.8 mmol/L
图 8 金属离子及其浓度对重组子 pET29a-pgsBCAE 的
γ-PGA 产量的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5166
ficiens C1 合 成 γ-PGA 的 完 整 基 因 簇 pgsBCAE， 并
将其连接到表达载体 pET29a 后转化宿主菌 E.coli
BL21，由此构建的重组菌株 E.coli BL21（pET29a-
pgsBCAE） 具 备 合 成 γ-PGA 的 能 力， 产 量 达 到
0.14 g/L。且发现其 γ-PGA 的合成能力受金属离子的
影响。
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（责任编辑 马鑫）