全 文 ：第 １２卷第 ４期
２０１４年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０４􀆰 ０１７
收稿日期：２０１３－０３－２４
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３ 计划） （２０１３ＣＢ７３３９０４，２０１３ＣＢ７３３５００２，２０１１ＣＢＡ００８０７）；国家高技术研究发展计划（８６３ 计划）
（２０１２ＡＡ０２３４０６）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１３０９３２） ；江苏省高校自然科学基金（１３ＫＪＢ５３０００９）
作者简介：何 　 剑（１９８９—），男，安徽芜湖人，硕士研究生，研究方向：微生物与分子生物学；郑 　 涛（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｅｌｌｏｚｈｅｎｇ＠
ｇｍａｉｌ􀆰 ｃｏｍ
一株 γ 多聚谷氨酸生产菌的分离筛选与鉴定
何　 剑１，雍晓雨１，２，周　 俊１，２，王舒雅１，２，陈怡露１，郑　 涛１，２
（１．南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 ２１１８００； ２．南京工业大学 生物能源研究所，南京 ２１１８００）
摘　 要：从菜园土壤中取样，在含有谷氨酸的筛选培养基上采用梯度稀释涂布、平板划线的方法，以菌落 ／菌液黏稠
度为指示，分离筛选生产 γ 多聚谷氨酸的菌株。 利用氨基酸分析仪测定提取纯化后的 γ 多聚谷氨酸的产量，并
通过形态学、生理生化特征以及 １６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列分析鉴定该菌株，并对其合成 γ 多聚谷氨酸的功能基因进行
ＰＣＲ扩增。 结果表明：筛选到 １株产 γ 多聚谷氨酸的细菌 Ｃ１，其液体摇瓶发酵产量为 １８􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ，相对分子质量为
１􀆰 ８×１０６；该菌株为革兰氏阳性，菌落黏稠、菌体呈杆状、产芽胞、且形成荚膜；主要生理生化特点为能利用葡萄糖和
蔗糖发酵，水解淀粉，Ｈ２Ｏ２酶阳性，产吲哚等；经 １６Ｓ ｒＤＮＡ 鉴定与 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ ２３３５０ 同源性为
１００％，故命名为 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ１，且拥有 γ 多聚谷氨酸合成的相关基因 ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ和 ｐｇｓＣ。
关键词：解淀粉芽胞杆菌；鉴定；分离筛选；γ 多聚谷氨酸
中图分类号：ＴＱ９２２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０４－００８７－０７
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒａｉｎ
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ γ⁃ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ
ＨＥ Ｊｉａｎ１，ＹＯＮＧ Ｘｉａｏｙｕ１，２，ＺＨＯＵ Ｊｕｎ１，２，ＷＡＮＧ Ｓｈｕｙａ１，２，ＣＨＥＮ Ｙｉｌｕ１，ＺＨＥＮＧ Ｔａｏ１，２
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆａｒｍｌａｎｄ． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｇｒａｄｉｅｎｔ
ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｔｅ ｓｔｒｅａｋｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ． Ｔｈｅ γ⁃ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ
ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ γ⁃ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｕｓｉｎｇ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎａｌｙｓｅｒ．
Ｔｈｅｎ， ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ
ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｆｉｎａｌｌｙ， ｔｈｅ ｐｇｓＡ，
ｐｇｓＢ， ａｎｄ ｐｇｓＣ ｇｅｎｅ， ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ γ⁃ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ．Ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，
ｃａｌｌｅｄ ｔｈｅ Ｃ１， ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ γ⁃ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ １８􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ ｉｎ ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．
Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ γ⁃ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓｔｒａｉｎ Ｃ１ ｗａｓ １􀆰 ８×１０６ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＧＰＣ． Ｃ１ ｗａｓ ａ
ｇｒａｍ⁃ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｉｌｌｉ， ｗｈｉｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｂｏｔｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｓｕｃｒｏｓｅ， ｈｙｄｒｏｌｙｓｅｄ ｓｔａｒｃｈ， ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎｄｏｌｅ， ａｎｄ
ｓｈａｒｅｄ １００％ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｏｆ ｉｔｓ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｗｉｔｈ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ ２３３５０， ｔｈｕｓ ｉｔ ｗａｓ
ｃａｌｌｅｄ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ１． Ｉｔ ｗａｓ ｔｅｓｔｉｆｉｅｄ ｔｏ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐｇｓＡ， ｐｇｓＢ， ａｎｄ ｐｇｓＣ ｇｅｎｅｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；γ⁃ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ（γ⁃ＰＧＡ）
　 　 γ 多聚谷氨酸（γ⁃ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，γ ＰＧＡ）
是由微生物利用 Ｄ 和 ／或 Ｌ 型谷氨酸单体通过
α 氨基和 γ 羧基之间的酰胺键聚合而成的一种天
然带负电和的高分子聚合物［１］，最先在炭疽芽胞杆
菌的荚膜中发现［２］。 到目前为止，已发现有多种生
物在代谢过程中能够合成 γ ＰＧＡ，包括古细菌
（Ｎａｔｒｉａｌｂａ ａｅｇｙｐｔｉａｃａ）、细菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ、
Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｈｕｎｇｋｏｎｋｊａｎｇ、 Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
ＡＴＣＣ９９４５、Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ和 Ｂ． ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＷＨ３２０）和
动物（Ｈｙｄｒａ） ［３］，其中以芽胞杆菌类最普遍。 γ
ＰＧＡ及其衍生物在食品、化工、材料和医药等领域
具有极大的开发价值和广阔的应用前景［４］。
γ 多聚谷氨酸结构独特，很难通过化学方法
合成；酶转化法虽然工艺路线简单、周期短，但合
成的 γ ＰＧＡ相对分子质量较小，制约了该方法的
生产实际应用；提取法制备 γ ＰＧＡ的含量不稳定
且副产物多、成本也较高，不利于大规模生产，因
此目前获得 γ ＰＧＡ 最有效的途径是通过微生物
发酵［５］ 。 目前，用于研究 γ 多聚谷氨酸生产的典
型菌株主要有 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ９９４５ａ
（从土壤中分离得到）和 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３３３５
（从豆制品中分离得到） 等［６］ 。 Ｊｅｏｎｇ 等［７］报道了
１ 株 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＫＹ３ 经过 ２４ ｈ 发酵，γ ＰＧＡ产量
达到 ４８．７ ｇ ／ Ｌ，但相对分子质量仅为 ６􀆰 ２×１０４；Ｃａｏ
等［８］报道了 １ 株 Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＬ３，虽经过
４４ ｈ 发酵生产的 γ ＰＧＡ 相对分子质量为 ４􀆰 ７ ×
１０５，但产量仅有 ４􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ；由于菌株产率较低、营
养条件要求苛刻，难以大规模生产，例如 Ａｓｈｉｕｃｈｉ
等［９］发现 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ在含
有 ２００ ｇ ／ Ｌ谷氨酸的培养基中培养 ５ ｄ，γ ＰＧＡ的
产量仅能达到 １３􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，因此，筛选优良的 γ
ＰＧＡ生产菌种尤为重要［１０］ 。 本文旨在从土壤中
自主分离出一株高产 γ ＰＧＡ 的菌种，为 γ ＰＧＡ
的应用提供基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 分离试样
土样采集自江苏省南京市玄武区某菜园土。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基
固体筛选培养基 （ｇ ／ Ｌ）：柠檬酸 １０、谷氨酸 １０、
ＮＨ４Ｃｌ ６、Ｋ２ＨＰＯ４ １、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ５、ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ
０􀆰 ０２、ＣａＣｌ２ ０􀆰 ２、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０５、琼脂 ２０；ｐＨ ７􀆰 ２。
种子液培养基 （ ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０、酵母膏 ５、
ＮａＣｌ １０；ｐＨ ７􀆰 ０。
液体摇瓶发酵培养基 （ｇ ／ Ｌ）：柠檬酸 １３􀆰 ５、谷氨
酸 １０、ＮＨ４Ｃｌ ６􀆰 ８、甘油 ７５、Ｋ２ＨＰＯ４ １、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ
０􀆰 ５、 ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０２、 ＣａＣｌ２ ０􀆰 ２、 ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ
０􀆰 ０５；ｐＨ ７􀆰 ２。
斜面保存培养基 （ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０、酵母膏 ５、
ＮａＣｌ １０、琼脂 ２０；ｐＨ ７􀆰 ０。
以上培养基在 １２１ ℃ 条件下高压蒸汽灭菌
１５～２０ ｍｉｎ。
１􀆰 １􀆰 ３　 主要试剂和仪器
培养基所用试剂（分析纯），上海国药集团化学
试剂有限公司； ｒＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶、 ＤＬ２０００ ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ、ｐＭＤ１９ Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ，宝生物工程（大连）有限公
司；细菌基因组 ＤＮＡ快速提取试剂盒，广州东盛生物
科技有限公司；ＤＮＡ凝胶回收试剂盒、ＰＣＲ清洁试剂
盒，爱思进生物技术（杭州）有限公司；ＰＣＲ 仪，美国
Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ公司；ＣＸ２１光学显微镜，日本奥斯巴林公司；
ＮＤＪ ５Ｓ数字式黏度计，上海垒固仪器有限公司；冷
冻干燥仪，美国 Ｖｉｒｔｉｓ 公司；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ３０ 全自动氨基
酸分析仪，英国 Ｂｉｏｃｈｒｏｍ 公司；色谱工作站为美国
Ａｇｉｌｅｎｔ １２００系统，配置 Ｓｈｏｄｅｘ １０１示差折光检测器；
ＳＢ ８０６Ｍ ＨＱ型凝胶渗透色谱柱，Ｓｈｏｄｅｘ公司。
１􀆰 ２　 菌株筛选
称取土样 １０ ｇ，放入装有 ９０ ｍＬ 无菌水及玻璃
珠的三角瓶内，室温下 １５０ ｒ ／ ｍｉｎ 振荡混匀 ３０ ｍｉｎ
后，沸水浴 ３ ～ ５ ｍｉｎ，再依次制成 １０－１、１０－２、１０－３、
１０－４、１０－５和 １０－６不同稀释度的土壤悬液，涂布于固
体筛选培养基上，最后将平板置于 ３７ ℃ 培养箱中
培养 １～２ ｄ。 从平板上挑选黏度较大，且能够拉丝
的菌落，划线接种到固体筛选培养基上，检查其特
征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查
是否为单一的微生物。 若发现有杂菌，需要再一次
进行分离、纯化，直到获得纯培养。 纯培养菌种划
线接种于斜面保存培养基上，４ ℃ 保存，每隔一个
月转接活化 １次。
１􀆰 ３　 液体发酵液的黏度测定
接种环挑取 １环平板上单菌落接种到种子培养
基中，３０ ℃、１７０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 １６ ｈ，按 ５％接种量接种
８８ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
到液体摇瓶发酵培养基中（１ ／ ５ 装液量），３０ ℃、１７０
ｒ ／ ｍｉｎ 摇床培养 ４８ ｈ 后用 ＮＤＪ ５Ｓ型数字式黏度计
测定发酵液黏度。
１􀆰 ４　 γ ＰＧＡ的提取与纯化
发酵液 １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３０ ｍｉｎ 后，取上清，
加入 ４ 倍体积的预冷的无水乙醇，静置过夜，１２ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ 离心，沉淀用去离子水溶解后，透析过夜，冷
冻干燥得到固体初提物。 初提物用去离子水溶解，
１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心，上清加 ２０ ｍｇ ／ ｍＬ 蛋白酶 Ｋ，去
离子水透析过夜，再按上述方法离心，取上清冷冻
干燥，得到 γ ＰＧＡ固体纯化试样， ７０ ℃ 保存。
１􀆰 ５　 γ ＰＧＡ的水解
取纯化的 γ ＰＧＡ 试样 ０􀆰 ２ ｇ 放入水解管中，
加入 １０ ｍＬ ６ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＨＣｌ，抽真空，维持 １０ ｍｉｎ 后
封口，１１０ ℃ 水解 ２４ ｈ，冷却后过滤，再用旋转式蒸
发仪浓缩，洗提 ３ 次，最后定容到 １０ ｍＬ，每一步均
采用超纯水进行处理，取最终定容的滤液分析游离
谷氨酸含量。
１􀆰 ６　 γ ＰＧＡ水解产物的分析
采用 Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ３０全自动氨基酸分析仪对水解
产物进行分析，上样量为 ２０ μＬ。
１􀆰 ７　 γ ＰＧＡ相对分子质量测定
１）相对分子质量标准曲线的绘制 　 利用凝胶
渗透色谱法（ＧＰＣ）对 γ ＰＧＡ相对分子质量进行测
定。 色谱条件：流动相 ０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｎａ２ＳＯ４，乙酸调节
ｐＨ至 ４􀆰 ０；流速 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ；柱温 ３５ ℃；紫外检测
波长 ２１０ ｎｍ；进样体积 ２０ μＬ。 采用 Ｓｈｏｄｅｘ公司的
葡聚糖标准品，根据出峰时间绘制标准曲线并拟合
出相 对 分 子 质 量 计 算 方 程： Ｙ ＝ － １９ ０１０ ＋
１７３ ２００ ０００ ０００Ｅｘｐ（－０􀆰 ８３１ ５Ｘ），其中 Ｘ 为试样在
紫外检测器上的保留时间，Ｙ 为试样的相对分子质
量。 γ ＰＧＡ相对分子质量标准曲线见图 １。
图 １　 Ｓｈｏｄｅｘ葡聚糖标准品相对分子质量标准曲线
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ
ｏｆ Ｓｈｏｄｅｘ ｓｔａｎｄａｒｄ
２）相对分子质量测定　 取一定量发酵液适当
稀释，经 ０􀆰 ２２ μｍ 微孔滤膜过滤去除菌体，备用。
色谱条件同上。
１􀆰 ８　 生理生化鉴定
菌体形态特征和生理生化特征测定参照文献
［１１］进行。
１􀆰 ９　 菌株 １６Ｓ ｒＤＮＡ鉴定
１）１６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列的 ＰＣＲ 反应　 使用东盛
公司的细菌基因组 ＤＮＡ 快速提取试剂盒提取菌株
Ｃ１的基因组 ＤＮＡ 后，用细菌 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因通用引
物 ２７Ｆ ／ １５４１Ｒ（正向引物 ２７Ｆ： ５′ ＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣ⁃
ＣＴＧＧＣＴＣＡＧ ３′；反向引物 １５４１Ｒ′： ５′ ＡＡＧＧＡＧＧ⁃
ＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＧＣＡ ３′）进行 ＰＣＲ 扩增。 ＰＣＲ 反应
条件：９４ ℃ 预变性 ５ ｍｉｎ，９４ ℃ 变性 ４５ ｓ，５５ ℃ 退火
４５ ｓ，７２ ℃ 延伸 ９０ ｓ，３２ 个循环，再 ７２ ℃ 延伸 １０
ｍｉｎ。 扩增完毕用 ８ ｇ ／ Ｌ琼脂糖凝胶电泳检测产物大
小。 使用爱思进公司的 ＤＮＡ凝胶回收试剂盒对 ＰＣＲ
产物进行清洁回收。
２） １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因序列测序 　 上述提取的含
１６Ｓ ｒＤＮＡ基因的重组质粒经酶切分析后，挑选具有
正确大小插入片段的质粒进行测序，测序委托南京
金斯瑞生物科技有限公司测定。
３）系统发育树的构建　 将目的菌株 １６Ｓ ｒＤＮＡ
测序结果在 ＮＣＢＩ 上进行 ＢＬＡＳＴ，并与 ＧｅｎＢａｎｋ 数
据库做相似性分析，利用 ＭＥＧＡ ４􀆰 ０ 软件采用邻接
法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｊｏｉｎｉｎｇ法） 构建系统发育树图。
１􀆰 １０　 菌株合成 γ ＰＧＡ功能基因的 ＰＣＲ扩增
根据文献 ［１２］合成 γ ＰＧＡ 的功能基因团
ｐｇｓＢＣＡ序列，设计 ３对合成 γ ＰＧＡ的基因引物，见
表 １。
表 １　 基因 ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ和 ｐｇｓＣ的扩增引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｐｇｓＡ，
ｐｇｓＢ， ａｎｄ ｐｇｓＣ
基因 引物 序列 （５′ ３′）
ｐｇｓＡ
上游引物 ＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧ
下游引物 ＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡ
ｐｇｓＢ
上游引物 ＡＴＧＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＴＴＡＴＡＧＣＣＴＧＴＧ
下游引物 ＣＴＡＧＣＴＴＡＣＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＡＣＣＴ
ｐｇｓＣ
上游引物 ＡＴＧＴＴＣＧＧＡＴＣＡＧＡＴＴＴＡＴＡＣＡＴＣＧ
下游引物 ＴＴＡＡＡＴＴＡＡＧＴＡＧＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＴＧＡＴ
　 　 ＰＣＲ 反应体系除所用引物不同外，其他与 １６Ｓ
９８　 第 ４期 何　 剑等：一株 γ 多聚谷氨酸生产菌的分离筛选与鉴定
ｒＤＮＡ基因序列的 ＰＣＲ反应相同。 ＰＣＲ产物用 ８ ｇ ／ Ｌ
琼脂糖凝胶电泳检测产物大小。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 γ ＰＧＡ产生菌的筛选
γ ＰＧＡ是一种生物源的高分子聚合物，其表
观典型特征就是其黏度较大。 因此，进行大量的
初筛菌株时，通常普遍选用的方法是对其菌落和
发酵液的表观现象进行检测。 例如，惠明等［６］采
用该方法筛选出了 ８ 株表观黏度较大的菌种，并
最终通过复筛获得了 １ 株 γ ＰＧＡ 高产菌株
Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｂ５３。 笔者利用选择性培养基从土壤试
样中分离培养出菌落较黏稠且能拉丝的菌株共 ３９
株。 通过液体发酵培养基复筛，选取发酵液黏度
较大的菌株 ７ 株，将这 ７ 株细菌经多次划线纯化
及镜检后，斜面保存。
对保存的 ７ 株细菌进行摇瓶发酵试验，并测定
其发酵液黏度值，结果见表 ２。 由表 ２可知：菌株 Ｃ１
的黏度值为 １５４􀆰 ３ ｍＰａ·ｓ，在所有筛选出的菌种中
最大。 因此，选择 Ｃ１作为进一步研究的对象。
表 ２　 菌株 Ｃ１摇瓶产物的黏度值
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｌａｓｋ
ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｃ１
菌株编号 转速 ／（ ｒ·ｍｉｎ－１）
黏度值 ／
（ｍＰａ·ｓ）
Ｂ１ ６０ ７２􀆰 ５
Ｂ２ ６０ １１５􀆰 ４
Ｂ３ ６０ ７８􀆰 ８
Ｃ１ ６０ １５４􀆰 ３
Ｄ４ ６０ ３４􀆰 ６
Ｄ５ ６０ ５７􀆰 ９
Ｈ１ ４ ６０ ７４􀆰 ６
２􀆰 ２　 菌株 Ｃ１摇瓶发酵 γ ＰＧＡ的产量测定
从 Ｃ１菌株摇瓶发酵液提取纯化得到白色絮状
的 γ ＰＧＡ 纯品，按 １􀆰 ５ 方法将其水解并进行氨基
酸分析，结果见图 ２。 由图 ２ 可知：经纯化后的水解
产物基本上全为游离谷氨酸（１８􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ），占总氨基
酸的 ９６％，其他氨基酸含量可以忽略不计，即 Ｃ１ 菌
株在液体摇瓶培养基中的产量可达到 １８􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ。 且
经过几次传代培养后证明，其产量稳定。 合成 γ
ＰＧＡ的细菌根据培养基中是否需要添加外源谷氨
酸可分为两组，即非谷氨酸依赖性和谷氨酸依赖
性，前者培养基中不需要添加外源谷氨酸，而后者
合成 γ ＰＧＡ严格依赖于培养基中添加的外源谷氨
酸。 Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃｕｎ［１３］、Ｂ􀆰 ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
Ａ３５［１４］和 Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ Ｓ１７３［１５］均为非谷氨酸依赖
性的菌株。 然而，γ ＰＧＡ 产生菌仍以谷氨酸依赖
性居多，如：Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ ３３３５［１６］、Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ
ＡＴＣＣ ９９４５Ａ［１７］、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＭＲ １４１［１８］、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ｓｕｂｓｐ． ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ［９］和 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｆ ２ ０１［１９］。
由上述结果可知，筛选的菌株 Ｃ１ 为 １ 株谷氨酸依
赖性菌株。
图 ２　 菌株 Ｃ１生产的 γ ＰＧＡ水解液
氨基酸分析图谱
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ
γ⁃ＰＧＡ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃ１
不同的菌株合成 γ ＰＧＡ 的能力不同，这不仅
和菌株本身的遗传特性有关，也与培养基的营养成
分有关。 Ｇｏｔｏ 等［１３］发现 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３３３５ 在含有
柠檬酸和谷氨酸的培养基中 γ ＰＧＡ的产量可达到
９􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ。 Ａｓｈｉｕｃｈｉ 等［９］ 发 现 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．
ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ在含有 ２０ ｇ ／ Ｌ 谷氨酸的培养基中培
养 ５ ｄ，γ ＰＧＡ 的产量可达到 １３􀆰 ５ ｍｇ ／ ｍＬ。 惠明
等［２０］发现柠檬酸、甘油和 （ ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４是 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ􀆰 Ｂ５３合成 γ ＰＧＡ比较适宜的 Ｃ源和 Ｎ源，前体
物质 Ｌ 谷氨酸的存在是聚谷氨酸高产所必需的；
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ􀆰 Ｂ５３在优化培养基上产生 γ ＰＧＡ １９􀆰 １２
ｇ ／ Ｌ，比原始基础发酵培养基上的 ８􀆰 ８７ ｇ ／ Ｌ 提高了
１１５􀆰 ５６％。 徐虹等［２１］ 从土壤中筛选出 １ 株高产
γ ＰＧＡ的菌株 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＸ２，其合成 γ ＰＧＡ的产
量可高达 ４１ ｇ ／ Ｌ，但是这种高产量是通过添加 ７０
ｇ ／ Ｌ γ ＰＧＡ的前体物质谷氨酸实现的，发酵成本较
高，但适宜大规模工业化发酵生产需求。 筛选的菌
株 Ｃ１在含有 １０ ｇ ／ Ｌ 的谷氨酸的培养基中，通过摇
瓶发酵 γ ＰＧＡ的产量可达到 １８􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ，成本低且
底物转化率较高，因此具有一定的开发利用潜力，
但后续研究还需确定菌株 Ｃ１ 能否适应高浓度底物
的发酵条件且仍具有较高的底物转化效率。
０９ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
２􀆰 ３　 γ ＰＧＡ相对分子质量的测定
利用凝胶渗透色谱法（ＧＰＣ）检测菌株 Ｃ１ 发酵
生产的 γ ＰＧＡ 的相对分子质量大小，γ ＰＧＡ 的
出峰时间为 １３􀆰 ７８７ ｍｉｎ （图 ３）。 通过相对分子质
量计算方程计算菌株 Ｃ１ 生产的 γ ＰＧＡ 的相对分
子质量为 １􀆰 ８×１０６。 γ ＰＧＡ 相对分子质量分布较
广，通常在 １􀆰 ０×１０４ ～１􀆰 ０ 范围内［２２］。 不同的菌株合
成的 γ ＰＧＡ相对分子质量不同，相同的菌株在不同
的培养基中甚至在不同的生长阶段相对分子质量也
不同。 通常相对分子质量大于 ４􀆰 ０×１０５的γ ＰＧＡ就
可应用于化妆品领域，其吸水保湿性能较好［２３］，菌株
Ｃ１合成的 γ ＰＧＡ相对分子质量为１􀆰 ８×１０６，聚合度
高，应用前景较好。 γ ＰＧＡ 具有多种应用的潜
力［１］，有报道称，决定 γ ＰＧＡ实际应用能力的一个
关键特点是其相对分子质量大小［２４］。 然而，到目前
为止，γ ＰＧＡ的功能和其结构特点（相对分子质量、
Ｄ ／ Ｌ 谷氨酸比例等）的关系及作用机制还没有被报
道［２５］。 因此，有关此方向的研究仍需要更深层次的
开展以更大程度地对 γ ＰＧＡ的应用进行开发。
图 ３　 菌株 Ｃ１发酵生产的 γ ＰＧＡ的 ＧＰＣ检测图谱
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ γ⁃ＰＧＡ ｐｒｏｄｕｃｅｄ
ｂｙ Ｃ１ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＧＰＣ
２􀆰 ４　 菌株 Ｃ１的鉴定
２􀆰 ４􀆰 １　 菌株 Ｃ１的形态鉴定
图 ４为菌株 Ｃ１ 的显微镜及平板拉丝照片。 由
图 ４ 可知：菌株 Ｃ１ 在固体筛选培养基上菌落为圆
形，生长中前期，菌落表面光滑发亮，边缘整齐，中
间突起，无色或略带黄色，半透明到透明，且黏度较
大；生长后期，菌落表面变得不再光滑，且没有亮度
也不再透明，菌落边缘开始出现褶皱，菌落不再突
起。 经镜检发现菌株 Ｃ１ 为革兰氏阳性，细胞形状
为杆状，产芽胞，且形成荚膜。
２􀆰 ４􀆰 ２　 生理生化结果
参照《常见细菌系统鉴定手册》 ［１１］，对菌株 Ｃ１
１—菌株 Ｃ１革兰氏染色；２—菌株 Ｃ１的胞子染色；
３—菌株 Ｃ１的荚膜；４—菌株 Ｃ１的平板拉丝
图 ４　 菌株 Ｃ１的显微镜及平板拉丝效果
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｃ１ ｏｎ ｔｈｅ ｐｌａｔｅ ａｎｄ
ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ
的部分生理生化实验进行了研究，结果见表 ３。
表 ３　 菌株 Ｃ１生理生化实验结果
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｃ１
检测项
反应特点
产酸 产气
检测项 是否反应（生长）
葡萄糖 ＋ ＋ ２０ ｇ ／ Ｌ ＮａＣｌ ＋
乳糖 － ＋ ５０ ｇ ／ Ｌ ＮａＣｌ ＋
半乳糖 － ＋ ７０ ｇ ／ Ｌ ＮａＣｌ ＋
蔗糖 ＋ ＋ １００ ｇ ／ Ｌ ＮａＣｌ ＋
果糖 ＋ ＋ 厌氧生长 －
阿拉伯糖 － ＋ 淀粉水解 ＋
纤维二糖 － ＋ Ｈ２Ｏ２酶试验 ＋
鼠李糖 － ＋ 酪素水解 ＋
甘露糖 － ＋ 酪氨酸水解 －
麦芽糖 － ＋ 柠檬酸盐试验 ＋
山梨糖 － ＋ 石蕊牛奶还原 ＋
甘露醇 － ＋ Ｖ􀆰 Ｐ􀆰 试验 ＋
木糖醇 － ＋ Ｍ􀆰 Ｒ􀆰 试验 －
丙二酸盐 ＋ ＋ 从甘油产生二羟基丙酮 ＋
硝酸盐还原试验 ＋
产生吲哚试验 ＋
明胶液化试验 ＋
ｐＨ ５􀆰 ７营养肉汤上生长 ＋
　 注：＋代表阳性，－代表阴性。
１９　 第 ４期 何　 剑等：一株 γ 多聚谷氨酸生产菌的分离筛选与鉴定
由表 ３可知菌株 Ｃ１ 具有以下特性：葡萄糖产
酸产气，能利用淀粉、蔗糖、果糖、甘露醇和木糖，好
氧，Ｈ２Ｏ２ 阳性，石蕊牛奶还原阳性，硝酸盐还原阳
性，明胶液化，分解酪素，不分解酪氨酸等。 与芽胞
杆菌的生理生化描述一致。 结合菌株 Ｃ１ 的平板上
形态特征及显微镜下形态特征确定菌株 Ｃ１ 为芽胞
杆菌。
２􀆰 ５　 １６Ｓ ｒＤＮＡ鉴定
提取菌株 Ｃ１ 的基因组 ＤＮＡ，经 ＰＣＲ 扩增后回
收测序，所测菌株 Ｃ１的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 核苷酸序列长度
为 １ ４１９ ｂｐ，序列送 ＧｅｎＢａｎｋ 做 ＢＬＡＳＴ分析。 根据
ＧｅｎＢａｎｋ提供的基因序列，依据 １６Ｓ ｒＤＮＡ序列利用
ＭＥＧＡ软件构建进化树进行分析（图 ５）。 由图 ５ 可
知：与菌株 Ｃ１ 同源性最高菌株的是 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ ２３３５０，同源性为 １００％。 因
此，将菌株 Ｃ１ 命名为 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ１，
并将其 １６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列上传到 ＮＣＢＩ的 ＧｅｎＢａｎｋ
数据库，登录号为 ＪＱ９６５９３９。
图 ５　 菌株 Ｃ１基于 １６Ｓ ｒＤＮＡ序列构建的系统发育树
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐａｒｔｉａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃ１ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ
２􀆰 ６　 菌株合成 γ ＰＧＡ功能基因的 ＰＣＲ扩增
根据文献报道，设计 γ ＰＧＡ 合成基因 ｐｇｓＡ、
ｐｇｓＢ和 ｐｇｓＣ 的引物并对菌株 Ｃ１ 的基因组进行
ＰＣＲ 扩增，可以获得同文献报道片段大小一致的
ＰＣＲ条带，结果见图 ６。 由图 ６ 可知：通过测序验
证，ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ 和 ｐｇｓＣ 的片段大小分别为 １ １４３、
１ １８２ 和 ４５０ ｂｐ。 从自然界中筛选的野生菌株合成
γ ＰＧＡ的能力有限，往往不能满足工业发酵生产
的需要，因此，有时需要对筛选的野生菌株发酵条
件进行优化或者对其进行改造。 Ｙｏｏｈ 等［２６］利用分
批补料发酵试验使得地衣芽胞杆菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）合成 γ ＰＧＡ 的能力达到 ３５ ｇ ／ Ｌ。 徐
艳萍等［２７］对地衣芽胞杆菌进行亚硝基胍和６０Ｃｏ 诱
变，获得 １株 γ ＰＧＡ的高产菌株 Ｃ９，γ ＰＧＡ质量
Ｍ—标准 ＤＮＡ； １—ｐｇｓＡ； ２— ｐｇｓＢ； ３—ｐｇｓＣ
图 ６　 ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ和 ｐｇｓＣ基因 ＰＣＲ产物的
琼脂糖电泳图谱
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｍａｇｅｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ
ｐｇｓＡ， ｐｇｓＢ， ａｎｄ ｐｇｓＣ ｏｎ ａｇｒｏｓｅ
２９ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
浓度由 ９􀆰 ４４ ｇ ／ Ｌ 提高到 １９􀆰 ７６ ｇ ／ Ｌ，提高了 １０９％。
随着分子生物学技术在工业发酵微生物改造方面
的应用，基因工程修饰将会更直接高效地提高目标
菌株 γ ＰＧＡ 的发酵产量，本实验室将继续进行该
方面的研究。
３　 结　 论
从土壤中筛选分离到 １ 株产 γ ＰＧＡ 的细菌
Ｃ１，在 ３０ ℃、１７０ ｒ ／ ｍｉｎ 条件下液体摇瓶发酵 ４８ ｈ，
γ ＰＧＡ产量为 １８􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ，相对分子质量为 １􀆰 ８×１０６。
菌株 Ｃ１菌落黏稠，为革兰氏阳性，产芽胞，能利用葡
萄糖、蔗糖发酵，水解淀粉，Ｈ２Ｏ２酶阳性，产吲哚等，经
１６Ｓ ｒＤＮＡ 鉴定为 １ 株解淀粉芽胞杆菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ），并拥有 γ ＰＧＡ 合成的相关功能
基因 ｐｇｓＡ、ｐｇｓＢ和 ｐｇｓＣ。 综上所述，分离筛选的菌株
Ｃ１生产 γ ＰＧＡ产量高、相对分子质量大，且遗传特
性稳定，具有较为广阔的开发应用前景。 在后期工作
中，还需确定菌株 Ｃ１能否适应高浓度底物的发酵条
件且仍具有较高的底物转化效率，并对该菌株进行基
因工程改造，以提高 γ ＰＧＡ的发酵产量。
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（责任编辑　 荀志金）
３９　 第 ４期 何　 剑等：一株 γ 多聚谷氨酸生产菌的分离筛选与鉴定