全 文 ：第 １３卷第 １期
２０１５年 １月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 １
Ｊａｎ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０１􀆰 ００９
收稿日期：２０１３－０９－２２
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３ 计划） （２０１３ＣＢ７３３９０４、２０１３ＣＢ７３３５００２、２０１１ＣＢＡ００８０７）；国家高技术研究发展计划（８６３ 计划）
（２０１２ＡＡ０２３４０６）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１３０９３２）；江苏省高校自然科学基金（１３ＫＪＢ５３０００９）
作者简介：张 　 瑞（１９９０—），女，江苏连云港人，硕士研究生，研究方向：微生物与分子生物学；雍晓雨（联系人），讲师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｏｎｇｘｉａｏｙｕ＠
ｎｊｔｅｃｈ．ｅｄｕ．ｃｎ
产 γ 聚谷氨酸菌株的诱变选育及其种子液工艺优化
张　 瑞１，周　 俊１，２，王舒雅１，２，沈立真１，陈怡露１，郑　 涛１，２，雍晓雨１，２
（１􀆰 南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 ２１１８００；
２􀆰 南京工业大学 生物能源研究所，江苏 南京 ２１１８００）
摘　 要：以已筛选的 １株产 γ 多聚谷氨酸解淀粉芽胞杆菌 Ｃ１为出发菌株，对其进行紫外线 亚硝基胍（ＮＴＧ）复合
诱变，并运用单因素试验和正交试验设计对诱变菌株的种子培养工艺进行优化。 通过复合诱变选育得到 １株能够
稳定遗传的正突变菌株 Ｃ１ ６，其摇瓶发酵生产 γ ＰＧＡ的产量由 １８􀆰 ４ ｇ ／ Ｌ提高到 ２４􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ，增加了 ３１􀆰 ５％，且传
代 ８次后仍能保持稳定。 通过单因子试验筛选到玉米粉和黄豆粉作为 Ｃ１ ６ 生长的 Ｃ 源和 Ｎ 源。 正交试验后，
Ｃ１ ６在成分为 Ｋ２ＨＰＯ４１􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ、ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ、黄豆粉 １５􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ、玉米粉 ５􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ，ｐＨ ６􀆰 ５的培养基中，３７ ℃、装液
量 １ ／ ５（１５０ ｍＬ三角瓶装液 ３０ ｍＬ）的培养条件下可获得较大的生物量，ＯＤ６００达到 ６􀆰 ３１。
关键词：复合诱变；γ 多聚谷氨酸；种子液；正交试验；优化
中图分类号：ＴＱ９２２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０１－００４７－０７
Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｈｉｇｈ γ⁃ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｂｙ
ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ｓｅｅｄｓ ｃｕｌｔｕｒｅ
ＺＨＡＮＧ Ｒｕｉ１，ＺＨＯＵ Ｊｕｎ１，２，ＷＡＮＧ Ｓｈｕｙａ１，２，
ＳＨＥＮ Ｌｉｚｈｅｎ１，ＣＨＥＮ Ｙｉｌｕ１，ＺＨＥＮＧ Ｔａｏ１，２，ＹＯＮＧ Ｘｉａｏｙｕ１，２
（１􀆰 Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ；
２􀆰 Ｂｉｏｅｎｅｒｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ１，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｏｕｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｓ ａ γ⁃ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｅｒ，ｗａｓ
ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ． Ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄ ｓｅｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ
ａｌｓｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ⁃ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ Ｃ１⁃６ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ
ｗｉｔｈ ａ γ⁃ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ２４􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ， ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ３１􀆰 ５％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ
ｓｔｒａｉｎ Ｃ１． Ｃ１⁃６ ｈａｄ ａ ｇｏｏｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｆｔｅｒ ８ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｃｏｒｎ
ｆｌｏｕｒ ａｎｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｃａｋｅ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｆｏｒ Ｃ１⁃６ ｔｈｒｏｕｇｈ
ｓｉｎｇｌｅ⁃ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｌｉｑｕｉｄ
ｓｅｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｗａｓ Ｋ２ＨＰＯ４１􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，ｓｏｙｂｅａｎ ｃａｋｅ １５􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ
５􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ． Ｉｎ １５０ ｍＬ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｏｒｉｇｉｎａｌ ｐＨ ａｎｄ ｍｅｄｉｕｍ ｖｏｌｕｍｅ ｗｅｒｅ ３７ ℃，
ｐＨ ６􀆰 ５ ａｎｄ ３０ ｍＬ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅ ｌａｒｇｅｒ ｂｉｏｍａｓｓ ｉｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｔｈｅ ＯＤ６００ ｉｓ ６􀆰 ３１．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ；γ⁃ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ；ｓｅｅｄｓ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
　 　 γ 聚谷氨酸（γ⁃ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，γ ＰＧＡ）是
由某些微生物利用 Ｄ 和 ／或 Ｌ 型谷氨酸单体聚合
而成的一种水溶性高分子氨基酸聚合物［１］。 γ
ＰＧＡ分子中有大量游离的亲水性羧基，可在分子内
部或分子之间形成氢键，具有增稠、乳化、凝胶、成
膜、保湿和黏接等功能特性，因此 γ ＰＧＡ及其衍生
物在食品、化工、材料和医药等领域，具有极大的开
发价值和广阔的应用前景［２］。
γ ＰＧＡ通过 α 氨基和 γ 羧基之间形成的γ
酰胺键聚合而成［３］，其化学结构独特，很难通过化学
方法合成，因此目前获得 γ ＰＧＡ最有效的途径是通
过微生物发酵［４］。 然而目前国内外研究结果表明，从
自然界中筛选的野生菌株合成 γ ＰＧＡ的产量通常
较低。 例如 Ａｔｓｕｏ 等［５］发现 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３３３５
在含有柠檬酸和谷氨酸的培养基中 γ ＰＧＡ 的产量
仅 为 ９􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ， Ａｓｈｉｕｃｈｉ 等［６］ 发 现 Ｂ􀆰 ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ｓｕｂｓｐ􀆰 ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ在含有质量分数为 ２％谷氨酸的
培养基中培养 ５ ｄ，γ ＰＧＡ 的产量仅能达到 １３􀆰 ５
ｇ ／ Ｌ。 因此选育高产菌种、降低生产成本是解决 γ
ＰＧＡ难以实现大规模工业生产问题的关键。
在微生物诱变育种中，可利用各种物理、化学
诱变因素来处理菌种。 对野生型菌株使用单诱变
因素有时也能取得好的效果，但对既往诱变史复杂
的菌株单一诱变因素重复使用突变的效果不佳，这
时可利用复合诱变因素处理菌种，扩大诱变幅度，
提高诱变效果。
工业中广泛应用的菌株改良的方法是对菌株进
行诱变和选育［７］，其中，常常利用紫外线 （ＵＶ） ［８－９］和
亚硝基胍 （ＮＴＧ） ［１０－１１］对目标菌株进行诱变。
本研究以笔者所在实验室已筛选的产 γ ＰＧＡ
菌株 Ｃ１ 为出发菌株，利用 ＵＶ 和 ＮＴＧ 对其进行复
合诱变，选育出 １ 株遗传稳定的高产γ ＰＧＡ 突变
株，并利用摇瓶试验对突变株的种子液培养条件进
行优化。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 诱变出发菌株
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｃ１，由南京工业大学
生物能源研究所分离和保存。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基
斜面保存培养基 （ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０、酵母膏 ５、
ＮａＣｌ １０、琼脂 ２０；ｐＨ ７􀆰 ０。
ＬＢ液体培养基 （ ｇ ／ Ｌ）：蛋白胨 １０、酵母膏 ５、
ＮａＣｌ １０；ｐＨ ７􀆰 ０。
固体筛选培养基 （ｇ ／ Ｌ）：柠檬酸 １０、谷氨酸 １０、
ＮＨ４Ｃｌ ６、Ｋ２ＨＰＯ４ １、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ５、ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ
０􀆰 ０２、ＣａＣｌ２ ０􀆰 ２、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０５、琼脂 ２０；ｐＨ ７􀆰 ２。
液体摇瓶发酵培养基 （ ｇ ／ Ｌ）：柠檬酸 １３􀆰 ５、谷
氨酸 １０、ＮＨ４ Ｃｌ ６􀆰 ８、甘油 ７５、Ｋ２ ＨＰＯ４ １、 ＭｇＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ５、ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０２、ＣａＣｌ２ ０􀆰 ２、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ
０􀆰 ０５；ｐＨ ７􀆰 ２。
Ｃ源筛选基础培养基 （ｇ ／ Ｌ）：（ＮＨ４）２ ＳＯ４ ２􀆰 ０、
ＮａＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ５、 Ｋ２ＨＰＯ４ ０􀆰 ５、 ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ２、
ＣａＣｌ２ ０􀆰 １。
Ｎ 源筛选基础培养基 （ ｇ ／ Ｌ）：ＫＨ２ ＰＯ４ １􀆰 ３６、
Ｎａ２ＨＰＯ４ ２􀆰 １３、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ２、ＣａＣｌ２ ０􀆰 １、 ＦｅＳＯ４·
７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０００ ５、葡萄糖 １０。
１􀆰 １􀆰 ３　 主要试剂
培养基所用试剂（分析纯）：国药集团上海化学
试剂有限公司。 亚硝基胍 （以配制 １０ ｍｇ ／ ｍＬ 的
ＮＴＧ为例）：称取 ２０ ｍｇ ＮＴＧ 于 ５ ｍＬ灭菌的离心管
中，滴加 １ ｍＬ丙酮使 ＮＴＧ 充分溶解，再加入 １ ｍＬ、
ｐＨ ６􀆰 ０的 ０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ磷酸缓冲液，充分混匀。
１􀆰 １􀆰 ４　 主要仪器
ＥＮＰ ９０８０ＢＳ Ⅱ型隔水式恒温培养箱，上海
新苗医疗器械制造有限公司；ＳＷ ＤＪ ２ＦＤ型超净
工作台，苏州安泰空气技术有限公司；ＮＤＪ ５Ｓ 数字
式黏度计，上海精密仪器有限公司；５８１０Ｒ型高速冷
冻离心机，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 公司； ＨＹＧ Ｃ 型恒温振动培
养器，太仓市实验设备厂；ＤＫ ８Ｄ 型电热恒温水
槽，上海森信实验仪器有限公司；Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ ３５ Ｌ
型冷冻干燥仪，美国 ＶＩＲＴＩＳ 公司；ＥＹＡＬＡ ＤＳＢ
２０００型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；
Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ３０ 全自动氨基酸分析仪，英国 Ｂｉｏｃｈｒｏｍ公
司；单人单面紫外诱变台（垂直）超净工作台，济南
杰康净化设备厂。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 出发菌株生长曲线的测定
出发菌种接种于 ＬＢ液体培养基中，在 ３０ ℃下
１７０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 ４８ ｈ，每隔 ２ ｈ（培养 ３２ ｈ 后每隔
４ ｈ）用分光光度计于 ６００ ｎｍ 波长下测定其 ＯＤ６００，
以灭菌的 ＬＢ培养基为空白对照。
１􀆰 ２􀆰 ２　 菌悬液的制备
离心收集对数生长期的菌体，用无菌生理盐水
洗涤、离心 ３ 次，再将菌体悬浮于无菌生理盐水中，
８４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
加入玻璃珠振荡 １５ ｍｉｎ，使菌体分散并使成单细胞，
菌悬液浓度约为 １×１０８ 个 ／ ｍＬ。
１􀆰 ２􀆰 ３　 紫外致死率
打开紫外灯（功率 １５ Ｗ、波长 ２５４ ｎｍ）预热 ２０
ｍｉｎ。 向直径为 ９０ ｍｍ培养皿中加入 １０ ｍＬ菌株 Ｃ１
的菌悬液，将培养皿置于距紫外线光源 ３０ ｃｍ（垂直
距离）的磁力搅拌器上，照射 １ ｍｉｎ 后打开培养皿，
同时磁力搅拌器搅拌，并开始计算时间。 处理时间
分别设置为 １０、２０、３０、４０、６０ 和 １００ ｓ，照射结束后
于黑暗处静置 ０􀆰 ５ ｈ。 以未经紫外处理的菌液为对
照。 将处理和对照的菌液用无菌生理盐水适当稀
释后，涂布于 ＬＢ培养基平板上，每个稀释度 ３ 个重
复，３０ ℃避光静置培养 ２４ ～ ３６ ｈ，统计观察菌落数。
计算不同诱变剂量的致死率，制作存活曲线。 致死
率在 ９０％左右的紫外照射时间作为随后复合诱变
的剂量。 存活率 ＝诱变后的菌数 ／诱变前的菌数×
１００％；致死率＝ １－存活率。
１􀆰 ２􀆰 ４　 亚硝基胍（ＮＴＧ）致死率
准确吸取菌悬液 ２ ｍＬ，加入已灭菌的试管中，
按 Ｖ（菌悬液） ∶ Ｖ（ＮＴＧ）＝ １ ∶ １的比例进行混合，使
混合液中 ＮＴＧ 的质量浓度分别为 ０􀆰 １、０􀆰 ２、０􀆰 ４、
０􀆰 ６、０􀆰 ８ 和 １ ｍｇ ／ ｍＬ，将试管置于摇床中，在 ３０ ℃
下 １００ ｒ ／ ｍｉｎ 处理 ３０ ｍｉｎ。 处理结束后，将菌悬液
６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，弃上清液，用灭菌的生理盐
水洗涤菌体 ３ 次，终止反应。 以灭菌的生理盐水适
当稀释各处理的菌液，涂布于选择性培养基平板
上，３０ ℃培养 ２４ ～ ３６ ｈ，统计观察菌落数。 同时以
不加 ＮＴＧ为对照。 培养数天后，平板计数法计算各
处理组的存活率和致死率，致死率在 ９０％左右的
ＮＴＧ浓度作为随后复合诱变的剂量。
１􀆰 ２􀆰 ５　 复合诱变初筛
复合诱变实验设计思路参照文献 ［１２］，处理方
法见表 １。 ＵＶ处理和 ＮＴＧ处理见 １􀆰 ２􀆰 ３和 １􀆰 ２􀆰 ４。
表 １　 诱变的因素及剂量
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｍｕｔａｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｏｓａｇｅｓ
组别 紫外照射时间 ／ ｓ
ρ（ＮＴＧ） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ＮＴＧ处理
时间 ／ ｍｉｎ
１ ４０ ０􀆰 １０ ２０
２ ２０ ０􀆰 １５ ６０
３ ３０ ０􀆰 ２０ ４０
４ ２０ ０􀆰 １５ ６０
５ ３０ ０􀆰 ２０ ２０
６ ４０ ０􀆰 １０ ４０
　 　 诱变处理后，将菌悬液 ６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，
弃去上清液，用灭菌的生理盐水洗涤菌体 ３次，终止
反应。 以灭菌的生理盐水适当稀释各处理的菌液，
涂布于选择性培养基平板上，３０ ℃培养 ２４ ～ ３６ ｈ，
从平板上挑选黏度较大的菌落，划线接种到固体筛
选培养基上，检查其特征是否一致，直到获得纯培
养。 将获得的突变株接种于斜面培养基上，４ ℃保
存，每隔 １个月转接活化 １次。
１􀆰 ２􀆰 ６　 液体发酵液黏度测定
从接种环挑取一环斜面保存的菌种接种到 ＬＢ
液体培养基中，在 ３０ ℃下 １７０ ｒ ／ ｍｉｎ 培养 １６ ｈ，按
５％接种量接种到液体摇瓶发酵培养基中，３０ ℃、
１７０ ｒ ／ ｍｉｎ摇床培养 ４８ ｈ 后用 ＮＤＪ ５Ｓ 型数字式黏
度计测定发酵液黏度，以出发菌株黏度值为标准，
挑选黏度较大的突变株。
１􀆰 ２􀆰 ７　 γ ＰＧＡ提取与纯化
发酵液 １０ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ３０ ｍｉｎ后，取上清液，
加入 ４ 倍体积的预冷无水乙醇，静置过夜，１２ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ 离心，沉淀用去离子水溶解后，去离子水透析
过夜，冷冻干燥得到固体初提物。 初提物用去离子
水溶解，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心，上清加 ２０ ｍｇ ／ ｍＬ 蛋白
酶 Ｋ，去离子水透析过夜，再按上述方法离心，取上
清液冷冻干燥，得到 γ ＰＧＡ固体纯化样品，－７０ ℃
保存。
１􀆰 ２􀆰 ８　 产物水解
取纯化的 γ ＰＧＡ 样品 ０􀆰 ２ ｇ 放入水解管中，
加入 １０ ｍＬ ６ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＨＣｌ，抽真空，维持 １ ｍｉｎ 后
封口，１１０ ℃水解 ２４ ｈ，冷却后过滤，再用旋转式蒸
发仪浓缩，洗提 ３ 次，最后定容到 １０ ｍＬ，每一步均
采用超纯水进行处理。 取最终定容的滤液分析游
离谷氨酸含量。
１􀆰 ２􀆰 ９　 水解产物氨基酸分析
采用 Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ３０全自动氨基酸分析系统对水
解产物进行分析。 将水解产物过滤浓缩到 １０ ｍＬ，
测其中游离谷氨酸含量，即可认为是 γ ＰＧＡ 的
产量。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 菌株 Ｃ１的生长曲线
选择对数生长期的细胞进行诱变处理，因为此
阶段菌体繁殖较旺盛，可以提高诱变效率，同时保
证诱变处理时具有一定的细胞浓度以增加变异细
胞总数。 菌株 Ｃ１生长曲线如图 １ 所示。 由图 １ 可
９４　 第 １期 张　 瑞等：产 γ 聚谷氨酸菌株的诱变选育及其种子液工艺优化
知，菌株 Ｃ１ 在 ＬＢ 液体培养基中培养 ８ ～ ２０ ｈ 时，
ＯＤ６００迅速增大，表明菌体进入对数生长期，菌体生
长活跃，ＤＮＡ复制旺盛，因此选用 １２ ｈ 的菌体制备
菌悬液进行诱变处理。
图 １　 Ｃ１菌株的生长曲线
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｃ１
２􀆰 ２　 菌株 Ｃ１紫外诱变存活曲线
图 ２为菌株 Ｃ１ 紫外诱变存活曲线。 由图 ２ 可
以看出：紫外线对 Ｃ１ 的致死率很高，在紫外照射
６０ ｓ后，Ｃ１ 的致死率几乎达到 １００％。 一般认为致
死率在 ８０％～９０％左右，即存活率为 １０％～２０％左右
的诱变处理下，可保证菌体获得最大程度的正突
变，因此选择紫外照射时间 ２０、３０ 和 ４０ ｓ 为复合诱
变的诱变剂量。
图 ２　 菌株 Ｃ１紫外线照射存活率曲线
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｃ１ ｂｙ
ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｌｉｇｈｔ
２􀆰 ３　 菌株 Ｃ１亚硝基胍诱变存活曲线
ＮＴＧ是烷化剂类诱变剂，在合适的条件下，它
导致细胞死亡率低而诱变突变率高，对细胞具有诱
发 １次至多次突变的效力，有超级诱变剂之称。 图
３为菌株 Ｃ１亚硝基胍诱变存活曲线。 由图 ３ 可知：
当 ＮＴＧ质量浓度大于 ０􀆰 ２ ｍｇ ／ ｍＬ 时，Ｃ１ 的致死率
超过了 ９７％；当 ＮＴＧ质量浓度达到 １ ｍｇ ／ ｍＬ 时，致
死率为 １００％。 所以选择 ０􀆰 １、０􀆰 １５ 和 ０􀆰 ２ ｍｇ ／ ｍＬ
ＮＴＧ为复合诱变的诱变剂量。
图 ３　 Ｃ１菌株 ＮＴＧ存活率曲线
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｃ１ ｂｙ ＮＴＧ ｉｎｄｕｃｅ
２􀆰 ４　 菌株 Ｃ１复合诱变后 γ ＰＧＡ产量
经复合诱变处理后，共从平板上挑选黏度较大
的菌株 １８０株，分别对这些菌株进行液体发酵实验，
测定其发酵液黏度，并以出发菌株的发酵液黏度为
标准，从中筛选出 ９株黏度较大的菌株 Ｃ１ １、Ｃ１
２、Ｃ１ ３、Ｃ１ ４、Ｃ１ ５、Ｃ１ ６、Ｃ１ ７、Ｃ１ ８ 和
Ｃ１ ９，分别测定其 γ ＰＧＡ产量，进行下一步筛选，
结果见图 ４。
图 ４　 Ｃ１及其各突变株生产 γ ＰＧＡ的产量
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｙｉｅｌｄ ｏｆ γ⁃ＰＧＡ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃ１ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｕｔａｎｔ
由图 ４ 可知：与出发菌株 Ｃ１ 相比，Ｃ１ ６ 和
Ｃ１ ９这 ２株突变株 γ ＰＧＡ发酵产量明显提高，分别
达到 ２４􀆰 ２和 ２３􀆰 １ ｇ ／ Ｌ，产量分别提高 ３１􀆰 ５％和 ２５􀆰 ５％，
因此选择这 ２株菌进行遗传稳定性实验，结果见表
２。 由表 ２可知：虽然 Ｃ１ ６ 和 Ｃ１ ９ 的γ ＰＧＡ发
酵产量获得提高，但是其遗传稳定性不同。 Ｃ１ ６
菌株在传代 ８ 次后，产量仍然能保持在 ２３􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ 的
水平，而 Ｃ１ ９ 传代 ８ 次后，产量下降到 １７􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ，
说明 Ｃ１ ６ 突变后的遗传稳定性较高，因此选择
Ｃ１ ６突变株进行下一步实验。
在微生物诱变育种中，利用复合因素来扩大诱
变幅度，可以提高诱变效果。 梁金忠等［１３］采用紫外
０５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
诱变技术对 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｂ １ 进行反复诱变，得
到 １株能够利用玉米原料生产 γ ＰＧＡ的优良高产
菌株 Ｂ １１５，摇瓶发酵 γ ＰＧＡ的产量由原菌株的
１２􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ提高到 １９􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ。 徐艳萍等［１４］对 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ 进行亚硝基胍和６０Ｃｏ诱变，获得 １株γ
ＰＧＡ的高产菌株 Ｃ９，γ ＰＧＡ产量由 ９􀆰 ４４ ｇ ／ Ｌ 提高
到 １９􀆰 ７６ ｇ ／ Ｌ，提高了 １０９％。 本研究中，笔者采用
物理和化学 ２ 种因素（分别为紫外线和亚硝基胍）
对出发菌株 Ｃ１ 进行复合诱变，获得了 １ 株正突变
菌株，且遗传性能稳定。
表 ２　 突变株遗传稳定性试验结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ Ｃ１⁃６ ａｎｄ Ｃ１⁃９
菌株传代次数 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８
Ｃ１ ６菌株 γ ＰＧＡ产量 ／ （ｇ·Ｌ－１） ２４􀆰 ２ ２４􀆰 ９ ２３􀆰 ８ ２４􀆰 １ ２３􀆰 ２ ２３􀆰 ６ ２２􀆰 ８ ２３􀆰 ８
Ｃ１ ９菌株 γ ＰＧＡ产量 ／ （ｇ·Ｌ－１） ２３􀆰 １ ２２􀆰 ６ ２２􀆰 ３ ２０􀆰 ７ １８􀆰 ９ １９􀆰 ３ １６􀆰 ４ １７􀆰 ２
２􀆰 ５　 Ｃ源对 Ｃ１ ６生长的影响
种子液培养基中分别添加 １０ ｇ ／ Ｌ 的葡萄糖、蔗
糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、麦麸、谷氨酸和米
糠作为 Ｃ源，其他条件相同，结果见图 ５。 由图 ５ 可
知：葡萄糖作为 Ｃ 源时，Ｃ１ ６ 菌株生物量最大，但
是在工业生产中，选用葡萄糖成本较高，因此选用
玉米粉这种廉价的成分替代葡萄糖。 当玉米粉作
为 Ｃ１ ６的 Ｃ源时，其种子液 ＯＤ６００达到 ４􀆰 ８。
１—葡萄糖；２—蔗糖；３—麦芽糖；４—可溶性淀粉；
５—玉米粉；６—麦麸；７—谷氨酸；８—米糠
图 ５　 Ｃ源对 Ｃ１ ６生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃ１⁃６
２􀆰 ６　 Ｎ源对 Ｃ１ ６生长的影响
种子液培养基中分别添加 １０ ｇ ／ Ｌ 的蛋白胨、牛
肉膏、酵母膏、黄豆粉、尿素、 （ＮＨ４ ） ２ＳＯ４、ＮＨ４Ｃｌ、
ＮＨ４ＮＯ３ 和谷氨酸作为 Ｎ源，其他条件相同，结果见
图 ６。 由图 ６可知：酵母膏作为 Ｎ源时，Ｃ１ ６ 种子
液生物量最大，但是在工业生产中，选用酵母膏成
本较高，因此选用黄豆粉替代酵母膏。 当黄豆粉作
为 Ｃ１ ６的 Ｎ源时，其种子液 ＯＤ６００达到 ４􀆰 ５。
２􀆰 ７　 无机盐浓度对 Ｃ１ ６生长的影响
无机盐对菌株 Ｃ１ ６ 生长的影响结果见图 ７。
１—蛋白胨；２—牛肉膏；３—酵母膏；４—黄豆粉；５—尿素；
６—（ＮＨ４） ２ＳＯ４；７—ＮＨ４Ｃｌ；８—ＮＨ４ＮＯ３；９—谷氨酸
图 ６　 Ｎ源对 Ｃ１ ６生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃ１⁃６
由图 ７ 可知：低浓度的 Ｋ２ＨＰＯ４（ ＜１ ｇ ／ Ｌ）和 ＭｇＳＯ４
（＜０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ）对 Ｃ１ ６ 的生长有促进作用，而 ＭｎＳＯ４
在低浓度条件下对 Ｃ１ ６的生长表现出抑制作用。
２􀆰 ８　 培养基初始 ｐＨ对 Ｃ１ ６生长的影响
考察培养基的初始 ｐＨ（５􀆰 ０、６􀆰 ０、６􀆰 ５、７􀆰 ０、７􀆰 ５、
８􀆰 ０和 ９􀆰 ０）对 Ｃ１ ６ 生长的影响，结果见图 ８。 由
图 ８可知：初始 ｐＨ对 Ｃ１ ６生长有着显著的影响，
当初始 ｐＨ为 ６􀆰 ５时，对 Ｃ１ ６生长最为有利。
２􀆰 ９　 温度对 Ｃ１ ６生长的影响
将 Ｃ１ ６ 分别置于 ３０、３３、３７、４０ 和 ４５ ℃下 １７０
ｒ ／ ｍｉｎ培养２４ ｈ，考察不同温度对Ｃ１ ６生长的影响，结
果见图 ９。 由图 ９可知，Ｃ１ ６最适生长温度为 ３７ ℃。
２􀆰 １０　 装液量对 Ｃ１ ６生长的影响
在 １５０ ｍＬ三角瓶中分别加入 ２０、３０、４０和 ５０ ｍＬ
培养基，考察不同装液量对 Ｃ１ ６种子液生物量的影
响，结果见图 １０。 由图 １０可知：装液量为 ２０ ｍＬ（１ ／
７􀆰 ５）和 ３０ ｍＬ（１ ／ ５）条件下 Ｃ１ ６ 种子液生物量较
大，考虑到实际生产中的效率，选用 ３０ ｍＬ装液量。
１５　 第 １期 张　 瑞等：产 γ 聚谷氨酸菌株的诱变选育及其种子液工艺优化
图 ７　 无机盐（Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＳＯ４和ＭｎＳＯ４）对
Ｃ１ ６突变株生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｓａｌｔｓ （Ｋ２ＨＰＯ４，ＭｇＳＯ４，
ａｎｄ ＭｎＳＯ４） ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ Ｃ１⁃６
图 ８　 培养基起始 ｐＨ对 Ｃ１ ６突变株生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ Ｃ１⁃６
２􀆰 １１　 正交试验设计优化种子液培养基配方
综合上述单因素实验结果，选择 Ｋ２ＨＰＯ４、
ＭｇＳＯ４、黄豆粉和玉米粉为因素，以 Ｃ１ 生物量
（ＯＤ６００）为指标，设计四因素三水平的正交试验。 因
素水平表和正交试验结果如表 ３和表 ４所示。 发酵
图 ９　 培养温度对 Ｃ１ ６突变株生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 ９　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ
ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ Ｃ１⁃６
图 １０　 装液量对 Ｃ１ ６突变株生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 １０　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｎ
ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ Ｃ１⁃６
条件为培养基 ｐＨ ６􀆰 ５、培养温度 ３７ ℃和装液量 ３０
ｍＬ（１ ／ ５）。 结果表明，４个因素对 Ｃ１ 种子液生物量
影响的主次顺序为黄豆粉、ＭｇＳＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、玉米
粉，且发酵的最佳工艺条件为 Ｋ２ ＨＰＯ４ １􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ、
ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ、黄豆粉 １５􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ和玉米粉 ５􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ。
表 ３　 正交试验因素水平及结果
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｒ ｏｆ
ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
试验号
ρ（因素） ／ （ｇ·Ｌ－１）
Ｋ２ＨＰＯ４ ＭｇＳＯ４ 黄豆粉 玉米粉
生物量
（ＯＤ６００）
１ １（０􀆰 ５） １（０􀆰 ２） １（５􀆰 ０） １（５􀆰 ０） ２􀆰 ６６４
２ １ ２（０􀆰 ５） ２（１０􀆰 ０） ２（１０􀆰 ０） ４􀆰 ２６７
３ １ ３（１􀆰 ０） ３（１５􀆰 ０） ３（１５􀆰 ０） ６􀆰 ２８５
４ ２（１􀆰 ０） １ ２ ３ ３􀆰 ４８８
５ ２ ２ ３ １ ６􀆰 ３０９
６ ２ ３ １ ２ ２􀆰 ５０９
７ ３（２􀆰 ０） １ ３ ２ ４􀆰 ４８５
８ ３ ２ １ ３ ２􀆰 ５５７
９ ３ ３ ２ １ ３􀆰 ３８４
２５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
表 ４　 误差分析
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｅｒｒｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｋ１ ａ １３􀆰 ２１６ １０􀆰 ６３７ ７􀆰 ７３０ １２􀆰 ３５７
Ｋ２ １２􀆰 ２６６ １２􀆰 ９１４ １１􀆰 １３９ １１􀆰 ２６１
Ｋ３ １０􀆰 ４２６ １２􀆰 １７８ １７􀆰 ０７９ １２􀆰 ３３０
ｋ１ ｂ ４􀆰 ４０５ ３􀆰 ５４６ ２􀆰 ５７７ ４􀆰 １１９
ｋ２ ４􀆰 ０８９ ４􀆰 ３０５ ３􀆰 ７１３ ３􀆰 ７５４
ｋ３ ３􀆰 ７４５ ４􀆰 ０５９ ５􀆰 ６９３ ４􀆰 １１０
Ｒｃ ０􀆰 ６６０ ０􀆰 ７５９ ３􀆰 １１６ ０􀆰 ３６５
　 注：ａ—Ｋｉ 表示每个因素 ３ 个水平 ３ 次实验的生物量总和；ｂ—ｋｉ
为其平均数；ｃ—Ｒ为平均数的极差。
工业生产中还需要降低生产成本，故本研究对
突变株 Ｃ１ ６ 的种子液发酵工艺进行了优化，为其
筛选了廉价的 Ｃ源（玉米粉）和 Ｎ 源（黄豆粉）。 玉
米中质量分数为 ６８％以上的成分是淀粉［１５］，因此，
利用玉米原料供应微生物生长需要有效地开发和
利用玉米中的淀粉。 黄豆粉也是一种优良的蛋白
质原料，其中含有大量的不饱和脂肪酸，并含有钙、
铁、锌、磷、镁、维生素 Ｂ 等营养成分，是能够被微生
物利用的 Ｎ源。 因此，选用玉米粉和黄豆粉为种子
液原料，可大大降低生产成本。
除此以外，还可以通过优化发酵培养基和改进
发酵工艺等方法提高微生物的发酵产量。 惠明
等［１６］发现柠檬酸、甘油和 （ ＮＨ４ ） ２ＳＯ４ 是 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ􀆰 Ｂ５３合成 γ ＰＧＡ比较适宜的 Ｃ源和 Ｎ源，在优
化培养基上产生 γ ＰＧＡ １９􀆰 １２ ｇ ／ Ｌ，比原始基础发
酵培养基上的 ８􀆰 ８７ ｇ ／ Ｌ 提高了 １１５􀆰 ５６％。 Ｙｏｏｎ
等［１７］ 利 用 分 批 补 料 发 酵 试 验 使 得 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｍｉｓ合成 γ ＰＧＡ 的能力达到 ３５ ｇ ／ Ｌ。 因
此，可以在本研究的基础上，进一步对 Ｃ１ ６突变株
的液体发酵的培养基和发酵工艺进行优化，以获得
更高的 γ ＰＧＡ产量。
３　 结论
以已筛选的 １株产 γ ＰＧＡ的解淀粉芽胞杆菌
Ｃ１为出发菌株，通过复合诱变选育到 １ 株能够稳定
遗传的正突变菌株 Ｃ１ ６，其摇瓶发酵生产 γ ＰＧＡ
的产量为 ２４􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ，且传代 ８ 次后仍能保持稳定。
同时对 Ｃ１ ６的种子液发酵工艺进行了优化。 通过
正交试验设计可知，Ｃ１ ６ 在成分为 Ｋ２ＨＰＯ４ １􀆰 ０
ｇ ／ Ｌ、ＭｇＳＯ４０􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ、黄豆粉 １５􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ、玉米粉 ５􀆰 ０
ｇ ／ Ｌ，ｐＨ ６􀆰 ５的培养基中，３７ ℃、装液量 ３０ ｍＬ 的培
养条件下可获得较大的生物量。
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（责任编辑　 荀志金）
３５　 第 １期 张　 瑞等：产 γ 聚谷氨酸菌株的诱变选育及其种子液工艺优化