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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病）是由布鲁
氏菌（Brucella）引起的人畜共患传染病，主要感染
反刍动物和人类［1］。对易感动物和人群进行减毒活
疫苗接种是目前预防和控制布鲁氏菌病传播的最有
效的途径。常用的布病疫苗免疫时间短、疫苗保护
效率低、毒力不稳定，因此有感染接种动物的危险，
限制了布病疫苗的使用［2］。开发布病基因工程疫苗，
如 DNA 疫苗和可食疫苗，可能提供解决上述问题的
方法。而转基因植物可食性疫苗因具有安全性高、
可食用性、能诱导全身免疫、成本低等诸多优点备
受关注。
转基因植物可食疫苗在胃酸和消化道各种酶类
收稿日期 ：2013-03-26
基金项目 ：内蒙古自治区自然科学基金项目（00511702）
作者简介 ：王晶妍，女，硕士，讲师，研究方向 ：免疫基因工程 ；E-mail ：wangjingyan79@163.com
通讯作者 ：王建英，男，博士，教授，研究方向 ：人畜共患疾病的分子生物学 ；E-mail ：jianyw1945@163.com
布鲁氏菌外膜蛋白 OMP31 基因克隆及番茄转化
王晶妍1，2  王建英1，2  玉花1  赵宏宇1，2  赵亮1  辛翠花1，2  王彬1
（1. 内蒙古科技大学数理与生物工程学院，包头 014010 ；2. 内蒙古科技大学生物工程与技术研究所，包头 014010）
摘 要 ： 作为发展可食性疫苗的第一步，将猪源布鲁氏菌蛋白 OMP31 的编码基因转入番茄，获得了转基因番茄。利用不依
赖于连接反应的克隆方法（ligation-independent cloning，LIC）构建了 pJG045-Omp31 植物表达载体，将此表达载体通过三亲融合法
转入农杆菌 AGL-0 中，用农杆菌介导的植物叶盘转化法转化番茄，并通过对再生植株的基因组中 OMP31 的编码基因扩增测序，最
终筛选出 5 株转基因番茄。
关键词 ： 布鲁氏菌 蛋白 OMP31 编码基因 转基因番茄
Gene Cloning and Transfer into Tomato of Brucella Outer Membrane
Protein OMP31
Wang Jingyan1，2 Wang Jianying1，2 Yu Hua1 Zhao Hongyu1，2 Zhao Liang1 Xin Cuihua1，2 Wang Bin1
（1. School of Mathematics，Physics and Biological Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010 ；
2. Institule of Bioengineering Technology，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010）
Abstract:  Transgenic tomato carrying Brucella suis membrane protein OMP31 gene was constructed for the development of edible
vaccine. In the experiment, the Omp31 gene was inserted into a plant expression vector pJG045 using ligation-independent cloning or LIC ；the
recombinant plasmid was transferred into Agrobacterium tumefaciens AGL-0 by triparental cross ；then the transformed Agrobacterium was used
to infect tomato cotyledons discs, and transgenic seedlings were identified by antibiotics resistance screening and PCR ；5 transgenic tomato
plants were obtained.
Key words:  Brucella Coding gene of protein OMP31 Transgenic tomato
存在的不利环境下能够稳定存在，并在植物细胞壁
的保护下表达的抗原安全到达小肠后，在小肠内被
缓慢释放，不仅诱导机体全身免疫反应而且还诱导
肠胃黏膜系统产生免疫反应［3］。这与注射给药相比
明显提高了免疫效率。试验已经证明布鲁氏菌外膜
蛋白 OMP31 不仅可以引起保护性体液免疫，同时
还能诱导细胞免疫［4］。本试验将猪源布鲁氏菌蛋白
OMP31 的编码基因转入番茄，获得转基因番茄，旨
在为制备预防布病的可食性疫苗做准备。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 菌株 ：大肠杆菌 DH5α、农杆菌
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期120
AGL-0、帮助菌 HB101，均为作者实验室所收藏 ；
猪源布氏杆菌病活疫苗 S2 株，购自中牧实业股份
有限公司兰州生物药厂。质粒 ：植物表达载体质粒
pJG045，为作者实验室所收藏。番茄种子（Lycopersi-
con esculentum L.），从包头农研所购买。PCR 引物均
为上海生物工程技术服务有限公司合成。
1.1.2 试剂 LB 培养基 ；植物组织培养中各培养基
配方如下。
1/2×MSO：MS（Sigma M5519）（2.2 g/L）+ 蔗糖
（30 g/L）+ 琼 脂 粉（0.8 g/L），pH5.8， 高 温 灭 菌
15 min。
D1 ：MS（Sigma M5519）（4.4 g/L）+ 蔗 糖（30
g/L）+ 琼脂粉（0.8 g/L）+ 反玉米素核苷（Sigma Z-
3541）（1 mg/L），pH5.8，高温灭菌 15 min。
2Z ：MS（Sigma M5519）（4.4 g/L）+ 蔗 糖（20
g/L）+ 肌醇（100 mg/L）+ 叶酸（0.5 mg/L）+ 琼脂粉
（0.8 g/L）+ 反玉米素核苷（Sigma Z3541）（2 mg/L）+
特美汀（200 mg/L），pH5.8，高温灭菌 15 min。
1Z ：MS（Sigma M5519）（4.4 g/L）+ 蔗 糖（20
g/L）+ 肌醇（100 mg/L）+ 叶酸（0.5 mg/L）+ 琼脂粉
（0.8 g/L）+ 反玉米素核苷（Sigma Z3541）（1 mg/L）+
特美汀（200 mg/L），pH6.0，高温灭菌 15 min。
MSSV：MS（Sigma M5519）（4.4 g/L）+ 蔗糖（30
g/L）+ 叶酸（0.5 mg/L）+ 琼脂粉（0.8 g/L）+ 吲哚
乙酸（0.5 mg/L）+ 特美汀（200 mg/L），pH6.0，高
温灭菌 15 min。
卡那霉素 ；利福平 ；反玉米素核苷 ；特美汀 ；
吲哚乙酸 ；乙酰丁香酮 ；细菌基因组提取试剂盒（上
海，天根）；DNA 纯化回收试剂盒（上海，天根）。
1.1.3 仪器 高速冷冻离心机（德国，Eppendorf）；
PCR 仪（美国，Gene 公司）；智能人工气候箱（浙
江，宁波海曙赛福实验仪器厂）；凝胶成像仪（美国，
Gene 公司）；低压电泳仪（美国，Bio-Rad）。
1.2 方法
1.2.1 构 建 植 物 表 达 载 体 根 据 NCBI 中 提 供 的
编 码 OMP31 蛋 白 基 因 的 序 列（GenBank 编 号 为，
GI16611662）利用 Primer-Premier5.0 软件设计引物。
上 游 引 物（Sense primer）P1 ：5-CGACGACAAGAC
CGTACCATGAAGTCCGTAATTTTGGCGTC-3；下游引
物（Antisense primer）P2 ：5-GAGGAGAAGAGCCG
TTAGAACTTGTAGTTCAGACCGACG-3。用天根细菌
基因组提取试剂盒提取布鲁氏菌全基因组。以基因
组 DNA 为模板，引物 P1、P2 对目的基因进行 PCR
扩增。反应条件为 ：94℃预变性 5 min ；94℃ 30 s，
59℃ 40 s，72℃ 90 s，进行 35 个循环 ；72℃终延
伸 10 min。反应结束后，用 DNA 纯化回收试剂盒纯
化 PCR 扩增的 DNA 片段。用 SDS 碱裂解法［5］制备
质粒 pJG045，Apa Ⅰ酶切线性化载体。然后，用 T4
DNA 聚合酶处理目的基因片段与载体 ；并将处理后
产物各 5 μL，70℃，10-20 min，接着 22℃，30-40
min，进行连接。连接产物转化大肠杆菌 DH5α。对
阳性菌落进行 PCR、酶切鉴定及测序分析。
1.2.2 三亲融合法转化农杆菌 在超净工作台中，
分别挑取活化农杆菌（AGL-0）、供体菌（含 pJG-
045-Omp31 重组质粒的 DH5α）、帮助菌（HB101）3
种菌的单菌落，接种于 200 μL LB 培养基中，并用
Parafilm 封口，置于 28℃静止培养 48 h。然后，取 6
μL 融合后的菌液涂板（含 50 μg/mL Kan、50 μg/mL
Rif 的 LB 平板），置于 28℃培养 48 h，再对长出的
单菌落进行菌落 PCR 筛选阳性克隆子。
1.2.3 转化番茄 外植体的准备 ：将灭菌的种子
种于 1/2×MSO 培养基中，置于人工气候箱培养室
6-10 d 后，将刚刚伸展的子叶切成小段，并正面朝
上置于 D1 培养基进行预培养 ；农杆菌介导的番茄
转化 ：将含有重组质粒的农杆菌单菌落接种于 5 mL
LB 液体培养基（含 50 mg/L Kan，50 mg/L Rif）中，
28℃，240 r/min，振荡培养过夜。然后，将上述培
养液按 1∶50 的比例转接到 100 mL LB 培养基中，
28℃，240 r/min 培养到 OD600=0.6-0.7，室温下 6 000
r/min 离心 10 min，收集菌体 ；用 MS 液体培养基重
悬菌体稀释到 OD600=0.3-0.4，并加入终浓度为 375
μmol/L AS（乙酰丁香酮）用于侵染。将预培养 2 d
后的番茄子叶倒入上述菌液中浸染，期间不断晃动
以便充分接触，10 min 后吸去多余的菌液并将子叶
背面朝上置于新的 D1 培养基中暗培养；培养 2 d 后，
将子叶转到 2Z 培养基，背面朝上，24℃，每天 16 h
光照和 8 h 黑暗条件下，在培养室培养 10 d 后，转
移子叶到新的 2Z 培养基上，之后每 2-3 周换一次
新的 2Z 培养基直到再生芽出现。将再生芽转移到
2013年第9期 121王晶妍等 ：布鲁氏菌外膜蛋白 OMP31 基因克隆及番茄转化
1Z 培养基上，2 周后将其切下并转到 MSSV 生根培
养基上。2-3 周后，将生根的植株转移到营养钵温
室生长。然后，再提取再生植株的基因组 DNA 进行
PCR 阳性鉴定，筛选转基因阳性苗。
2 结果
2.1 构建重组载体
将载体片段和目的基因扩增片段通过不依赖于
连接反应的克隆方法（ligation-independent cloning，
LIC）进行连接后，连接产物转化大肠杆菌 DH5α，
并对阳性菌落进行 PCR、酶切鉴定及测序分析。
从图 1 可见菌落 PCR 得到的片段在 755 bp，与
OMP31 基因长度相符，此菌落即为含有重组质粒
pJG045-Omp31 的阳性菌落。
M1110987654321オ
755
500
bpbp
空 ：空白对照 ；1-11 ：菌落 PCR 产物 ；M ：100 bp Marker
图 1 菌落 PCR 鉴定
5 4 3 2 1 M
2155
bp
1000
bp
1 ：重组质粒 ；2，3 ：单酶切后的重组质粒 ；4，5 ：双酶切后的
重组质粒 ；M ：1kb DNA Marker
图 2 酶切鉴定
5 6 7 84321M
500
bp bp
755
可用于侵染番茄。
M ：100 bp Marker ；1-8 ：农杆菌菌落 PCR 产物
图 3 转化农杆菌菌落 PCR 鉴定电泳图
对阳性菌落含有的质粒进行酶切鉴定（图 2）
显示，用 EcoR Ⅰ对阳性菌落提取的质粒进行单酶
切电泳后只出现一条条带，表明此质粒为重组质粒，
若为载体本身会出现两条条带。用 EcoR Ⅰ和 Pst Ⅰ
对阳性菌落提取的质粒进行双酶切，电泳后出现一
条约 2 155 bp 的目的条带与重组载体酶切后含目的
基因的小片段长度相符。并对其质粒进行测序，结
果与 GenBank 中公布的猪种 S2 株 OMP31 基因序列
完全相符。即此菌落为含有重组质粒 pJG045-Omp31
的阳性菌落。
2.2 番茄的转化与组织培养
构建的 pJG045-Omp31 植物表达载体通过三亲
融合法转入农杆菌 AGL-0 中，对转化的农杆菌单菌
落进行菌落 PCR 鉴定阳性菌。结果（图 3）显示，
PCR 产物为 755 bp，与 OMP31 基因长度相符，此农
杆菌为含有重组质粒 pJG045-Omp31 的阳性农杆菌
通过农杆菌介导植物转化法转化番茄，并培育
转基因番茄（图 4-图 6）。图 4-A 为番茄种子的萌
芽，此过程要对种子进行消毒，以防在培养种子时
染菌。图 4-B 为子叶预培养，降低其褐化率，增加
其外植体的成活率。之后将阳性农杆菌和番茄子叶
共培养，为了增加农杆菌转化效率，农杆菌侵染时
加乙酰丁香酮（AS）。图 4-C 为诱导的愈伤组织。在
愈伤组织诱导再生植株过程中，培养基中一直含有
特美汀，原因为特美汀不仅可抑制农杆菌的生长，
而且对植物的影响很小。此诱导过程中，使用的细
胞分裂素是反玉米核苷，其对番茄的愈伤组织分化
效果更好（图 5）。再生植株诱导生根（图 6）。过程
中，使用的培养基的无机盐浓度减半，这样更有利
于生根。并在生根过程中不更换培养基，以利于不
定根的生长。在生根培养基中加有吲哚乙酸，促进
其生根。
2.3 转基因植物PCR鉴定结果
为了检测编码布鲁氏菌外膜蛋白的 OMP31 基因
是否整合到转基因番茄基因组中，对 10 棵潮霉素抗
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期122
A，B ：再生植株新生长的根 ；C ：生根后的小苗
图 6 再生植株诱导生根
A B
C D
E F
A ：诱导 6-8 周后的愈伤组织 ；B，C ：形成的抗性小芽 ；D ：抗性小芽培养
1 周后 ；E ：完整的再生植株 ；F ：诱导生根
图 5 愈伤组织诱导再生植株
A
C
B
M：100 bp Marker；正：pJG045-Omp31 质粒（阳性对照）；负：未转化的番茄（阴
性对照）；空 ：空白对照 ；1-10 ：转化 pJG045-Omp31 质粒的番茄
图 7 转基因植物 PCR 鉴定
↓オ䍏 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 M
755
500
bpbp
A ：种子萌芽 ；B ：子叶预培养 ；C ：诱导愈伤
图 4 转基因番茄愈伤组织
A
B
C
性的转基因植株进行 PCR 扩增，其中有 5 株扩增出
755 bp 的目的基因片段（图 7）。图 7 显示第 3、4、7、
8、9 株植株为阳性转基因番茄植株。
3 讨论
3.1 试验材料的选择
本试验中选择番茄为转基因受体植物。主要是
因为番茄是茄科中的模式生物之一，在获得转基因
植物过程中遇到问题时，有一定参考依据 ；果实可
以直接食用不需要分离、纯化等复杂的操作 ；不受
地域限制。
本试验选择布鲁氏菌外膜蛋白 OMP31 作为抗原
蛋白，是因为试验结果表明布鲁氏菌 OMP31 蛋白不
仅可以引起保护性体液免疫，同时还能诱导细胞免
2013年第9期 123王晶妍等 ：布鲁氏菌外膜蛋白 OMP31 基因克隆及番茄转化
疫。它的较强免疫保护作用和高度保守性，可以作
为生产高效的人畜共用疫苗的抗原蛋白。
3.2 阳性转基因苗转化率
本试验在植物组织培养过程中，虽然得到的阳
性苗较少，但阳性率却比较高。原因是试验初始阶
段采用了高浓度的潮霉素，并且在诱导愈伤组织过
程中采用了反玉米素核苷所造成，从而降低了假阳
性率。但是使用潮霉素筛选阳性苗时，虽然阳性率
较高，但是会抑制细胞分裂，导致愈伤组织分化受
抑制，得到的小苗数量少。其次，高浓度的反玉米
素核苷会抑制细胞分裂，从而得到的再生小苗比含
有 6-BA 和 IAA 或者 NAA 的培养基少。
3.3 展望
布鲁氏菌病属于人畜共患病，近几年发病率有
明显上升趋势，不仅给畜牧业造成了巨大的损失，
而且威胁着人类的健康。布鲁氏菌病的预防主要是
通过接种疫苗来实现。近年来，对布病疫苗的研究
主要集中在筛选弱毒苗，构建突变株以及寻找亚单
位疫苗等方面。现有的疫苗种类有减毒活疫苗、灭
活疫苗、布鲁氏菌基因缺失疫苗、核酸疫苗、重组
亚单位疫苗、联合疫苗、特异性分子标记疫苗［6］。
随着布鲁氏菌基因组测序工作的完成，人类对布鲁
氏菌各种功能基因的认识也越来越清晰，研制新型
的基因工程疫苗已成为疫苗研制的重要领域之一。
目前，植物基因工程疫苗的研制尚处于初级阶
段，还未培养出成熟的植物转基因疫苗品种，但相
关研究已取得较大进展［7］。植物系统生产的抗原疫
苗可保持天然免疫原的形式，使大规模生产抗原疫
苗成为可能。利用植物作为生物反应器生产可食疫
苗已逐渐体现出独特的优势与可观的应用前景［8］，
具有广阔的现实意义和发展潜力。因此研制布鲁氏
菌转基因植物疫苗不仅对防治布病有着深远的意义
和作用，而且推动了整个疫苗研制的发展。
4 结论
通过农杆菌介导的植物叶盘转化法，将猪源布
鲁氏菌蛋白 OMP31 的编码基因整合到番茄基因组
中，并对再生植株进行抗生素筛选、PCR 鉴定，最
终筛选出 5 株转基因番茄。
参 考 文 献
［1］ 金宁一 , 胡仲明 , 冯书章 , 等 . 新编人兽共患病学［M］. 北京 ：
科学出版社 , 2007 ：493-512.
［2］ 玉花 , 陈敏洁 , 王晶妍 , 等 . 布鲁氏菌免疫保护抗原与抗病疫苗
的研究进展［J］. 广东农业科学 , 2011, 38（24）：102-104.
［3］ Streatfield SJ. Mucosal immunization using recombinant plant-based
oral vaccines［J］. Methods, 2006, 38（2）：150-157.
［4］ Estein SM, Cheves PC, Fiorentino MA, et al. Immunogenicity of
recombinant Omp31 from Brucella melitensis in rams and serum
bactericidal activity against B. ovis［J］. Vet Microbiol, 2004, 102
（3-4）：203-213.
［5］ 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 DW. 分子克隆实验指南［M］. 第 3 版 . 北
京 ：科学出版社 , 2002 ：27-30.
［6］ 邓丽芳 , 黄亚宁 , 罗雯 . 布鲁菌病疫苗研制进展［J］. 陕西农
业科学 , 2012, 4 ：130-134.
［7］ 周岩 , 赵茜 , 何男男 , 袁重要 . 转基因植物疫苗的最新研究进
展［J］. 生物技术 , 2013, 40（1）：61-65.
［8］ 郭应琳 . 转基因植物疫苗的研究进展［J］. 四川畜牧兽医 ,
2010, 2 ：35-37.
（责任编辑 马鑫）