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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第7期
收稿日期 ：2013-02-22
基金项目 ：高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（200801260002）
作者简介 ：陈宇杰，女，硕士，讲师，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：462762127@qq.com
通讯作者 ：哈斯阿古拉，男，博士，教授，研究方向 ：植物分子生物学及基因工程 ；E-mail ：hasind@sina.com
甜瓜乙烯受体基因 Cm-ETR1 cDNA 的克隆及
表达特性分析
陈宇杰1，2  陈明1  乌兰巴特尔1  郝金凤1  高峰1  哈斯阿古拉1
（1. 内蒙古大学生命科学学院 内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，呼和浩特 010021 ；
2. 内蒙古民族大学生命科学学院，通辽 028000）
摘 要 ： 乙烯感知和信号转导的初始成分是乙烯受体，为探明甜瓜乙烯受体基因 Cm-ETR1 在甜瓜果实成熟过程中的作用，
以甜瓜品种河套蜜瓜为材料，根据 GenBank 中登录的甜瓜乙烯受体基因 Cm-ETR1 的 cDNA 序列（登录号为 AF054806），设计合成
特异性引物，采用 RT-PCR 技术克隆得到 Cm-ETR1 基因全长 cDNA 序列，提交到 GenBank 中（登录号为 EF495185）。序列分析表
明，序列长度为 2 256 bp，编码区为 2 223 bp，编码 740 个氨基酸，与已报道的 cantalupenis 甜瓜 ETR1 基因的 cDNA 序列完全一
致。Cm-ETR1 蛋白的系统进化树分析结果表明，该乙烯受体蛋白在各物种间高度保守，与黄瓜乙烯受体蛋白相似性最高，一致性
为 99%，与龙眼乙烯受体蛋白相似性最低，一致性为 86%。定量 PCR 分析结果显示，随着甜瓜果实内源乙烯合成量和成熟程度的
增加，Cm-ETR1 基因的表达量同步增加，在果实乙烯跃变期，Cm-ETR1 的表达量也达到最高值，内源乙烯合成量与 Cm-ETR1 基
因表达量间呈显著正相关，表明 Cm-ETR1 基因在甜瓜果实成熟过程中可能具有重要的作用。
关键词 ： 甜瓜 乙烯受体 Cm-ETR1 果实成熟 基因表达
Cloning and Expression Characterization of Ethylene Receptor Gene
Cm-ETR1 from Melon（Cucumis melo L.）
Chen Yujie1，2 Chen Ming1 Wulan Bateer1 Hao Jinfeng1 Gao Feng1 Hasi Agula1
（1. Inner Mongolia Key Laboratory of Herbage ＆ Endemic Crop Biotechnology，College of Life Sciences，Inner Mongolia University，
Hohhot 010021 ；2. School of Life Sciences，Inner Mongolia University for the Nationalities，Tongliao 028000）
Abstract:  Ethylene receptor is the initial composition of ethylene perception and signal transduction. In order to investigate the
function of melon ethylene receptor gene Cm-ETR1 during fruit ripening in melon, a pair of gene specific primers was designed based on the
cDNA nucleotide sequence of Cm-ETR1 gene from melon（accession number ：AF054806）in GenBank. The full-length cDNA of Cm-ETR1
was cloned by RT-PCR from ripening fruit of melon（Cucumis melo L. cv. Hetao）, and was submitted to GenBank（accession number ：
EF495185）. Sequence analysis showed that the cloned cDNA was 2 256 bp long, contained an 2 223 bp ORF that encoded a polypeptide
of 740 amino acids, and the cDNA sequence was consistent with that of reported melon variety cantalupenis ETR1 cDNA. Cm-ETR1 protein
phylogenetic tree analysis show that the ethylene receptor protein is highly conserved in all species, and Cm-ETR1 is highest similarity
with cucumber ethylene receptor protein by 99% consistency, and lowest similarity of longan ethylene receptor protein by 86% consistency.
Quantitative PCR analysis indicated that the expression level of Cm-ETR1 gene was increased, which coincided with the raise of the melon fruit
ethylene production and fruit ripening process, and peaked at ethylene climacteric stage. The amount of endogenous ethylene had a positive
correlation with the expression of Cm-ETR1 gene. It reveals that Cm-ETR1 gene may play an important role in fruit ripening.
Key words:  Melon Ethylene receptor Cm-ETR1 Fruit ripening Gene expression
2013年第7期 55陈宇杰等 ：甜瓜乙烯受体基因 Cm-ETR1 cDNA 的克隆及表达特性分析
乙烯作为一种重要的植物激素，在植物生长发
育、成熟衰老等诸多生理过程中起着极为重要的作
用［1］。乙烯受体是乙烯信号转导途径中的一个关键
因子，研究表明乙烯受体的存在是乙烯应答顺利进
行所必需的［2］。编码乙烯受体的基因属于多基因家
族，在拟南芥乙烯受体基因家族中已发现 5 个成员
ETR1、ERS1、ETR2、ERS2 和 EIN4［3］， 根 据 其 结
构特征，将乙烯受体家族成员分成两个亚家族，亚
家族Ⅰ包括 ETR1 和 ERS1，亚家族Ⅱ包括 ETR2、
ERS2 和 EIN4。目前，人们已经从番茄［4］、梨［5］等
多种果实中克隆到了乙烯受体基因 ETR1。1999 年，
Sato-Nara 等［6］从甜瓜品种 FuyuA 和 Natsu4 中克隆
到 Cm-ETR1 cDNA 序列，基因表达分析结果表明，
Cm-ETR1 在完全膨大期果实果皮有少量表达，在成
熟早期和后期的果皮中的表达逐渐增强。但目前尚
不了解该基因在甜瓜果实成熟及呼吸跃变过程中的
确切功能。
本研究以典型的呼吸跃变型甜瓜品种河套蜜瓜
为研究对象，从成熟果实中克隆 Cm-ETR1 cDNA 全
长序列，分析果实不同发育时期内源乙烯生成规律，
并应用定量 PCR 技术分析该基因在甜瓜果实发育成
熟过程中的表达特性，为阐明 Cm-ETR1 基因在甜瓜
果实成熟及呼吸跃变过程中的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
甜瓜品种河套蜜瓜（Cucumis melo L. cv Hetao）
原种，由本实验室保存。选取大田种植的 9 个成熟
果实，取中果皮组织于液氮速冻，用于基因克隆。
从授粉后 0 d 开始，每隔 5 d 采摘果实，直至果实完
全成熟变软，取中果皮组织于液氮速冻，用于基因
表达分析。为保证数据的准确性和可靠性，每天上
午 9 时采摘果实，重复 3 次。
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 由本实验室
保存。反转录试剂盒为 Invitrogen 公司产品 ；克隆载
体 pMD19-T、限制性内切酶、PrimeSTARTM HS DNA
聚 合 酶、dNTPs、 氨 苄 青 霉 素、 DNA marker 以 及
SYBR® Premix Ex TaqTM 定量 PCR 试剂盒等为大连宝
生物公司产品 ；PCR 产物纯化试剂盒为上海生工生
物工程有限公司产品 ；其余试剂为进口或国产分析
纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 RNA 提取 采用乙酸钾 - 氯化锂方法［7］提
取甜瓜果实总 RNA。由于甜瓜果皮富含多糖，多糖
能够与核酸形成复合物并共沉淀下来，影响下一步
的反转录 PCR 扩增，本试验利用乙酸钾将水相中的
多糖选择性的沉淀出来，达到了除去多糖的目的。
1.2.2 引物设计与合成 根据 GenBank 中登录的
甜瓜乙烯受体基因 Cm-ETR1 cDNA 序列（登录号 ：
AF054806），设计合成 RT-PCR 引物，上游引物 P1
序 列 为 ：5-CTACTCTAGATTGCCATGGAGAACTGT-
T-3，下游引物 P2 序列为 ：5-TGACGGATCCGATA-
TCTCTCTGTCTACT-3。根据所克隆的 Cm-ETR1 基因
cDNA 序列，设计合成该基因的定量 PCR 检测引物，
上游引物 P3 为 ：5-GCAACTGCCCTTATGCTTGT-3，
下游引物 P4 为：5 -CTTGAGTACGAATGAGTCCC-3，
扩增片段大小为 121 bp。以甜瓜甘油醛 -3-磷酸脱氢
酶（GAPDH） 基 因（ 登 录 号 ：AB033600） 为 定 量
PCR 检测内参基因，上游引物 GP1 为 ：5-ATCAT-
TCCTAGCAGCACTGG-3，下游引物 GP2 为 ：5-TT-
GGCATCAAATATGCTTGACCTG-3，扩增片段大小为
278 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.3 PCR 扩增和克隆 取 5 μg 河套蜜瓜总 RNA 做
模板，加 50 μmol/L Oligo（dT）20 引物 1 μL，加 10
mmol/L dNTP 2 μL，灭菌无 RNase 水 5 μL，65℃变性
5 min，迅速放在冰上 5 min；然后依次加入 5×cDNA
合成缓冲液 4 μL、0.1 mol/L dTT 1 μL、15 U/μL 反转
录酶 M -MLV 1 μL、40 U/μL RNase-out 1 μL。反应条
件 ：50℃，50 min ；60℃，10 min ；70℃，10 min ；
85℃，5 min ；4℃，5 min。反应结束后，加 2 U/μL
RNase H 1 μL，37℃保温 30 min，-20℃保存备用。
以合成的 cDNA 第一链为模板，建立常规的
PCR 反应体系，采用 PrimeSTARTM HS DNA 聚合酶
扩增 Cm-ETR1 基因全长 cDNA 。PCR 反应条件为 ：
94℃预变性 2 min ；94℃变性 50 s，50℃退火 40 s，
68℃延伸 2 min ；35 个循环，68℃延伸 10 min。PCR
产物进行 1.0% 琼脂糖凝胶电泳。
PCR 产物经纯化后与经 Sma Ⅰ酶切的 pUC19
载体连接，转化大肠杆菌 DH5α，在含有 Amp（100
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期56
mg/L） 的 LB 平 板 上 筛 选 阳 性 克 隆， 经 Xba Ⅰ 和
BamH Ⅰ双酶切鉴定，分别从 3 个独立 PCR 产物的
重组克隆中各选取 1 个克隆，进行序列分析。将所
得序列结果与已报道的 cantalupenis 甜瓜 ETR1 基因
cDNA 进行 BLAST 序列相似性分析，用 DNAMAN6.0
软件进行序列比较分析。
1.2.4 在 GenBank 中进行 Cm-ETR1 蛋白 BLAST 比
对，搜索到一批相似性很高的蛋白，从中选出 9 个
相似性最高的 ETR 蛋白，利用 DNAMAN6.0 软件对
这些蛋白序列进行相似性比对分析，采用 MEGA4.02
软件的邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统进
化树，并进行 1 000 次 Bootstrap 检验。
1.2.5 果实内源乙烯含量的测定 从授粉后第 15 至
30 d 每隔 5 d，以及第 30 d 后每隔 1 d，采摘甜瓜果实，
并立即从果实内腔中采集气体样品，水封法保存于
小玻璃瓶内，用气相色谱仪测定乙烯含量，为保证
数据的准确性和可靠性，采样在每天上午 9 时进行，
重复 3 次。
1.2.6 定 量 PCR 分 析 基 因 表 达 特 性 用 SYBR®
Premix Ex TaqTM 定量 PCR 试剂盒进行定量 PCR 检测。
反应体系为 ：反转录产物 1 μL，SYBR Premix Ex Taq
（2×）12.5 μL，上游引物（5 μmol/L）1 μL，下游引
物（5 μmol/L）1 μL，加无菌超纯水至总体积为 25
μL，混匀。用 Opticon 3 Real-time PCR System（Bio-
Rad 公司）进行分析，PCR 扩增条件为 ：95℃预变
性 10 s ；95℃变性 5 s，60℃退火延伸 20 s，共进行
40 个循环。数据采用 2-ΔΔCT 方法进行分析，授粉后
0 d 的甜瓜果实基因表达量设定为 1，标准误差（SEs）
来自 3 个重复样本。
2 结果
2.1 Cm-ETR1 cDNA的 RT-PCR扩增
以反转录产物为模板，PCR 扩增后得到约 2.2
kb 的特异性条带（图 1），与预期大小相符。
2.2 Cm-ETR1 cDNA的克隆及序列分析
将 PCR 扩增得到的特异性条带进行克隆，对重
组克隆进行双酶切鉴定（图 2）。为避免由于 PCR 扩
增和序列分析造成的误差，对 3 个独立 PCR 扩增产
物的重组克隆进行测序，并对其进行对比分析，获
得了 Cm-ETR1 cDNA 序列（图 3）。结果表明，克隆
的 cDNA 核苷酸序列长度为 2 256 bp，编码区长度为
2 223 bp，编码 740 个氨基酸组成的蛋白，其核苷酸
序列（登录号为 EF495185）和推断的氨基酸序列与
已报道 cantalupenis 甜瓜的相应序列完全相同。
2322
bp
M 1
2027
M ：λDNA/Hind Ⅲ分子量标准 ；1 ：PCR 扩增产物
图 1 PCR 扩增产物
2322
bp
1 M
2027
1 ：BamH Ⅰ和 Xba Ⅰ酶切的重组质粒 ；M ：λDNA/Hind Ⅲ分子量标准
图 2 重组质粒的酶切鉴定
2.3 Cm-ETR1与其他植物乙烯受体蛋白的相似性
及系统进化树分析
对 Cm-ETR1 与 9 个相似性最高的其他植物乙
烯受体蛋白进行了序列比对分析。结果表明，Cm-
ETR1 与黄瓜乙烯受体蛋白的相似性最高（为 99%），
与龙眼乙烯受体蛋白的相似性最低（为 86%）。系
统进化树分析表明（图 4），这 10 个乙烯受体蛋白
首先聚类形成两个分支，其中一个小分支由同属的
甜瓜和黄瓜乙烯受体蛋白组成，而大的分支则由龙
眼、草莓、李、巴旦木、西洋梨、沙梨、苹果和枇
杷的乙烯受体蛋白组成。进行 Bootstrap 检验发现，
除巴旦木及李的分支与西洋梨等的分支的 Bootstrap
值较低外，其他分支的 Bootstrap 值均大于 90，说明
应用 MEGA4.02 软件的 NJ 法构建的系统进化树较为
可靠。
2013年第7期 57陈宇杰等 ：甜瓜乙烯受体基因 Cm-ETR1 cDNA 的克隆及表达特性分析

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图 3 Cm-ETR1 基因 cDNA 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第7期58
2.4 甜瓜果实内源乙烯含量测定
Excel 软件分析在甜瓜果实不同发育阶段内源乙
烯含量变化。结果（图 5）显示，在授粉后第 40-41 d
出现了一个呼吸高峰，表现在乙烯含量的急剧增加。
而乙烯峰值出现前后的发育阶段乙烯释放量较少，
且变化幅度较小。河套蜜瓜果实这种乙烯合成方式
符合典型的呼吸跃变型果实的内源乙烯合成规律。
Cm-ETR1 基因转录水平较低且变化较小，在授粉后
第 35 d，即果实内源乙烯生成高峰前期，表达量显
著增加。在授粉后第 40 d，Cm-ETR1 基因的表达水
平达到最高值，约为授粉后第 0 d 的 5 倍。随后，
Cm-ETR1 基因表达水平显著下降。
3 讨论
研究表明，乙烯受体基因家族的各成员在蛋白
结构和基因时空表达上各有其特点［8］。对拟南芥
的研究表明，随着乙烯合成能力的增强，ETR1 的
mRNA 水平下降［9］ 。在番茄中 ETR1 是组成型表达
的，其 mRNA 水平不受乙烯合成的影响［10］。在乙
烯信号转导过程中，乙烯受体各成员在功能上存在
冗余性，但各成员对乙烯信号转导的调控能力不同。
拟南芥 ETR1 功能丧失突变体 ert1-7 对乙烯更加敏
感而且乙烯反应更强烈，表明在乙烯信号转导过程
中 ETR1 比其他乙烯受体发挥着更重要的作用［11］。
拟 南 芥 ETR1 和 ERS1 基 因 双 突 变 体 etr1-9 ；ers1-3
的研究表明，与亚家族Ⅱ的 3 个成员相比，亚家族
Ⅰ的 ETR1 和 ERS1 两个成员在乙烯信号转导过程中
具有更强烈的调控作用［12］。本研究从甜瓜品种河套
蜜瓜成熟果实中克隆了乙烯受体亚家族Ⅰ成员 ETR1
基 因 Cm-ETR1 的 全 长 cDNA， 对 Cm-ETR1 基 因 在
甜瓜果实发育成熟过程中的表达特性进行了分析，
Cm-ETR1 基因的表达在授粉后第 40 d 达到最高值，
与乙烯峰几乎同时出现，表明 Cm-ETR1 基因可能在
乙烯诱导的甜瓜果实成熟及呼吸跃变过程中发挥重
要作用。
4 结论
从典型的呼吸跃变型甜瓜品种河套蜜瓜中克隆
㾯⌻ỘPyrus communisAAL66207.1
⋉ỘPvrus pvrifoliaBAD61001.1㤩᷌Malus×domesticaAAW69924.1
ᶷ㋁Eriobotrva iaponicaAGE15303.2
ᐤᰖᵘPrunus persicaEMJ26422.1
ᵾPrunus domesticaCAI64505.1
㥹㧃Fraqaria vescaXP 004288086.1嗉⵬Dimocarpus longanACL81480.3
哴⬌Cucumis sativusXP_004152848.1
⭌⬌Cucumis meloABP68413.1100
100
99
66
99
99
97
0.01
图 4 甜瓜 Cm-ETR1 蛋白的系统进化树分析
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
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15 20 25 30
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35 40 45
图 5 甜瓜果实内源乙烯含量
2.5 甜瓜果实不同发育成熟阶段Cm-ETR1基因的
表达特性分析
定量 PCR 结果（图 6）显示，在果实发育初期，
7
6
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25 35 45 504030
图 6 甜瓜果实发育成熟过程中 Cm-ETR1 基因的表达
2013年第7期 59陈宇杰等 ：甜瓜乙烯受体基因 Cm-ETR1 cDNA 的克隆及表达特性分析
了乙烯受体基因 Cm-ETR1 cDNA，其核苷酸序列及
推断的氨基酸序列与 cantalupenis 甜瓜的相应序列完
全一致。在该甜瓜果实发育和成熟过程中，内源乙
烯合成和 Cm-ETR1 基因的表达均呈单峰曲线，前者
的峰值出现在授粉后第 40-41 d，而后者的峰值出现
在授粉后第 40 d。Cm-ETR1 基因的表达与果实发育
成熟进程及乙烯合成呈显著正相关。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）