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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第3期
黄 鳝（Monopterus albus） 隶 属 于 合 鳃 目
（Synbranchiformes）合鳃科（Synbranchidae）黄鳝属
（Monopterus），在我国，除青藏高原外，各地都有
分布。由于市场上黄鳝需求量大，价格高，逐渐出
现黄鳝养殖热潮。然而，随着黄鳝养殖集约化的发
展，疾病也在逐渐增多，已报道的细菌性病原有嗜
水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）［1-3］、产碱假单
胞菌（Pseudomonas alcaligenes）［4］、温和气单胞菌（A.
sobria）［5，6］、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）［7］。
2012 年 9 月中旬，合肥市某养殖场的黄鳝出现
了爆发性死亡，其临床症状为病鳝全身出血，部分
收稿日期 ：2013-09-22
基金项目 ：农业部行业（农业）科研专项（201003076），安徽省农科院黄鳝创新团队项目（12c0501），安徽省科技攻关项目（12010302056）
作者简介 ：陈红莲，女，博士，助理研究员，研究方向 ：水生动物疾病防治 ；E-mail ：hlchen76@163.com
通讯作者 ：江河，男，硕士，高级工程师，研究方向 ：水产良种选育与水生动物病害防控 ；E-mail ： jianghe@sohu.com
黄鳝病原性维氏气单胞菌温和生物变种的分离与鉴定
陈红莲 江河 胡王 凌俊 段国庆
（安徽省农业科学院水产研究所，合肥 230031）
摘 要 ： 从养殖患出血病黄鳝（Monopterus albus）的肝脾肾中分离到大量菌落形态和色泽一致的细菌。16S rRNA 序列分析
证实随机挑选的 5 个分离株为同一种细菌，其中一株编号为 HS120920 进一步鉴定。结合细菌的形态特征，生理生化特征及 16S
rRNA 和 gyrB 序列分析结果，鉴定该菌为维氏气单胞菌温和生物变种（Aeromonas veronii biovar sobria）。该菌对黄鳝的半致死浓度
约为 5.79×107 CFU/mL。药敏试验结果显示，菌 HS120920 对 7 种喹诺酮类，5 种氨基糖苷类等 17 种抗菌药物高度敏感，对其他 3
种抗菌药物低敏，或有抗性。
关键词 ： 黄鳝 出血病 维氏气单胞菌 16S rRNA 基因 gyrB 基因
Isolation and Identification of Pathogenic Aeromonas veronii Biovar
Sobria from Monopterus albus
Chen Honglian Jiang He Hu Wang Ling Jun Duan Guoqing
（Fisheries Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031）
Abstract: Large colonies with the same morphology and color were isolated from liver, spleen and kidney of diseased mud eel, Monopterus
albus. 5 isolates randomly selected were proved to be the same bacteria by 16S rRNA sequence analysis. Further research of one strain named
HS120920 among them was developed. According to morphology, physiological and biochemical characteristics, analysis of their 16S rRNA and
gyrB sequences, the strain was identified as Aeromonas veronii biovar sobria, the LD50 was 5.79×10
7 CFU/mL. The susceptibility test showed
that the strain was highly sensitive to 17 drugs such as seven quinolones, five aminoglycosides, but showed low sensitivity or resistance to
other 3 drugs.
Key words: Monopterus albus Hemorrhagic disease Aeromonas veronii 16S rRNA gene GyrB gene
病鳝身体上出现褪色斑或整个尾部褪色，腹部肿胀，
肛门红肿，解剖可见肠道出血，部分病鳝有黄色或
红色腹水。本研究对从现场取回濒死黄鳝，进行病
原菌的分离、鉴定及药敏试验，旨在找出引发此次
黄鳝出血病的病原，并为该病的防治提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
病鳝取自安徽省合肥市花岗镇某养殖场，体重
约 50-100 g。人工感染的健康黄鳝购于安徽省益水
渔业科技有限公司，体重约 40-100 g。
2014年第3期 131陈红莲等 ：黄鳝病原性维氏气单胞菌温和生物变种的分离与鉴定
胰胨大豆琼脂（TSA）、胰酶大豆肉汤（TSB）、
MH 琼脂、琼脂、LB 肉汤（LB）为青岛海博生物技
术有限公司产品 ；革兰氏染色液、芽孢染色液、微
量生化管、20 种抗菌药敏纸片购于杭州天和微生物
试剂有限公司 ；Ezup 柱式细菌基因组 DNA 抽提试
剂盒（批号 ：SK8255）购于上海生工生物工程股份
有限公司，PCR 引物也由该公司合成 ；PCR 相关试
剂、TaKaRa MINIBEST agarose gel DNA extraction kit
（D823A）、pMD18-T 购于 TaKaRa 公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离纯化 取濒死病鳝 5 尾，无菌取样
肝、脾和肾，接种于 TSA、含 5% 绵羊血 TSA 平板，
28℃培养 24 h，随机挑取 5 个菌落重复划线分离，
直至得到纯培养。
1.2.2 回归感染试验
1.2.2.1 组织滤液感染试验 用 10 倍无菌生理盐
水稀释病鳝的肝脾肾匀浆液，10 000 r/min 离心 10
min，经 0.22 μm 滤膜过滤，胸腔注射 10 尾健康黄鳝，
每尾注射 0.2 mL，对照组黄鳝肌肉注射等量的无菌
生理盐水，每天记录黄鳝的发病、死亡情况，连续
观察 30 d。
1.2.2.2 细菌感染试验 用 0.65% 无菌生理盐水洗
下 28℃培养 18-24 h 的菌 HS120920，制成菌悬液，
结合平板计数和光电比浊计数法（波长 625 nm）测
定菌液中细菌浓度，并将菌液浓度调至 4×109 CFU/
mL，然后 10 倍系列稀释至 106 CFU/mL。取暂养 1 周
的健康黄鳝，随机分为 5 组，每组 10 尾，1-4 组每
尾胸腔注射菌悬液 0.2 mL ；第 5 组每尾注射等量生
理盐水。试验期间水温变化为 25-28℃。感染后连
续观察 14 d，记录试验鳝的发病和死亡情况。并按
照 Reed-Muench 法［8］计算黄鳝的半数致死量（LD50）。
从濒死鳝的肝、脾和肾分离病原菌，并对其生理生
化特征进行鉴定。
1.2.3 病原菌鉴定
1.2.3.1 生 理 生 化 鉴 定 参 照《 常 见 细 菌 系 统 鉴
定 手 册 》［9］ 和《Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology》［10］所述方法对菌 HS120920 进行革兰
氏染色、芽孢染色和生理生化测定。生理生化测定
在相应的微量生化管里进行。
1.2.3.2 16S rRNA 和 gyrB 基因序列测定和系统发育
学分析 取 5 株分离菌的过夜培养液，用 Ezup 柱式
细菌基因组 DNA 抽提试剂盒提取 DNA 作为 PCR 模
板。16S rRNA 基因 PCR 扩增的引物为 27 F（正向
引 物 ）：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ；1492 R
（反向引物）：5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。
gyrB 基因 PCR 扩增的引物为 F ：5-GAAGTCATCAT
GACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3 ；R ：
5-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCN
GCRTCNGTCAT-3。PCR 反应体系：无菌蒸馏水 37.8
μL，10×PCR 缓 冲 液 5 μL（ 含 1.5 mmol/L MgCl2），
4×dNTP 混 合 物 4 μL（2.5 μmol/L）， 引 物 各 1.0
μL（40 μmol/L），Taq DNA 聚 合 酶 0.2 μL（5.0×106
U/L），模板 DNA 1 μL。PCR 反应条件 ：94℃预变性
4 min，接下来 35 个循环（94℃变性 1 min，55℃复
性 1 min，72℃延伸 2 min），72℃温育 10 min。5 株
分离菌 16S rRNA 阳性 PCR 产物直接送上海生工生
物有限公司测序。代表菌株 HS120920 的 16S rRNA
和 gyrB 基因的阳性 PCR 产物经 TaKaRa MINIBEST
agarose gel DNA extraction kit 试 剂 盒 纯 化 回 收， 与
pMD18-T 连 接， 然 后 转 化 感 受 态 DH5α， 接 着 涂
布于含氨苄青霉素（100 μg/mL）的 LB 琼脂平板，
37℃培养过夜，阳性克隆增菌后送上海生工生物有
限公司测序。
将菌 HS120920 的 16S rRNA 和 gyrB 基因序列通
过 NCBI 的 Blast 检索系统进行序列同源性分析。参
与系统发育学分析的细菌有气单胞菌属 14 个种，包
括嗜水气单胞菌，异常嗜糖气单胞菌（A. allosaccha-
rophila），动物气单胞菌（A. bestiarum），豚鼠气单胞
菌（A. caviae），鳗鱼气单胞菌（A. encheleia），嗜矿
泉气单胞菌（A. eucrenophila），简达气单胞菌（A.
jandaei），中间气单胞菌（A. media），波波夫气单
胞菌（A. popoffii），杀鲑气单胞菌（A. salmonicida），
舒氏气单胞菌（A. schubertii），温和气单胞菌，脆
弱气单胞菌（A. trota），维氏气单胞菌（A. veronii）
维罗纳生物变种和温和生物变种（gyrB 基因进化
树中 CECT4246 株为非参考株），及鳗弧菌（Vibrio
anguillarim）（ 作 为 外 群 ）。 使 用 Clustal X2 软 件 将
这些细菌参考株的 16S rRNA 和 gyrB 基因序列进行
多序列匹配排列，使用 MEGA 5.1 软件采用邻接法
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期132
（Neighbor joining method）构建系统发育树，并通过
1 000 次的自举分析（Bootstrap）进行置信度检测。
1.2.4 药敏试验 试验采用纸片扩散法，操作及结
果判断均参考 CLSI 的 M100-S23 号文件标准执行［11］。
挑取一些新鲜培养细菌溶于 0.65% 的生理盐水中，
调节浓度至约 108 CFU/mL，用棉拭子反复均匀涂布
于 MH 琼脂平板上，用无菌镊子将 20 种抗菌药敏纸
片贴于培养基表面，28℃培养 24 h 后，观察记录抑
菌环的直径（包括药敏片）。
2 结果
2.1 细菌分离
28℃培养 24 h，TSA 培养基上长出大量大小和
色泽一致的菌落，菌落圆形、边缘整齐、灰白色、
中间隆起，大小为 1-2 mm ；含 5% 绵羊血 TSA 培养
基上生长的菌落呈 β 溶血（不完全溶血）。
2.2 回归感染试验
组织滤液注射感染健康黄鳝，30 d 内没有发
生病变或死亡，表明该病不是由病毒感染引起。菌
HS120920 回归感染试验的结果见表 1，对黄鳝的半
致死浓度约为 5.79×107 CFU/mL。人工感染黄鳝的
患病症状与自然感染黄鳝的症状一致。从濒死黄鳝
的肝、脾和肾分离细菌的各理化指标与原分离菌的
相应指标相同，表明菌 HS120920 对黄鳝具有致病性。
表 1 菌株 HS120920 对黄鳝的感染试验
组别
菌液浓度
（CFU/mL）
试验鱼数量
（尾）
试验鱼死亡数量
（尾）
死亡率
（%）
试验组 4×109 10 10 100
4×108 10 8 80
4×107 10 4 40
4×106 10 1 10
对照组 生理盐水 10 0 0
2.3 生理生化鉴定
菌 HS120920 的革兰氏染色、芽孢染色结果显
示细菌为革兰氏阴性菌，两端钝圆，短杆状，无芽
孢。菌 HS120920 的另 31 个理化特性鉴定结果见表 2，
其中 27 个特征均与 2 个维氏气单胞菌生物变种的相
应特征相符，而其水杨苷、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸
双水解酶和七叶草特征检测分别为阴性、阴性、阳
性和阴性，与维氏气单胞菌温和生物变种的相应特
征相符，与维罗纳生物变种的相应特征不符。
表 2 菌株 HS120920 生理生化特征
特性 HS120920
维氏气单胞菌
维罗纳生物变种 *
维氏气单胞菌
温和生物变种 *
特性 HS120920
维氏气单胞菌
维罗纳生物变种 *
维氏气单胞菌
温和生物变种 *
氧化酶 + + + 尿素 - - d
接触酶 + + + 丙二酸盐 - - -
O-F 试验 F F f DNA 酶 + d d
运动性 + + + V-P 试验 + + +
吲哚 + + + 明胶 + + +
棉籽糖 - - - O/129（R） + + +
纤维二糖 - d d 葡萄糖 ：产气 + d d
麦芽糖 + + + 鸟氨酸脱羧酶 - + -
木糖 - - - 赖氨酸脱羧酶 + + +
鼠李糖 - - -
精氨酸双水解
酶
+ - +
阿拉伯糖 - - d
西蒙氏枸橼酸
盐
+ + d
阿拉伯醇 - - - 硝酸盐还原 + + +
甘露醇 + + + 七叶草 - + -
山梨醇 - - - H2S 产生 - d d
肌醇 - - - KCN 生长 - - d
水杨苷 - + -
“＋”为阳性 ；“-”为阴性 ；d 为阳性或阴性 ；“*”指表中数据取自文献［10］
2014年第3期 133陈红莲等 ：黄鳝病原性维氏气单胞菌温和生物变种的分离与鉴定
2.4 16S rRNA和gyrB基因序列测定和系统发育学
分析
5 株分离菌经 16S rRNA 扩增、测序，序列分
析被证明为同一种细菌。代表菌株 HS120920 16S
rRNA 和 gyrB 基因的 PCR 扩增产物的电泳结果见
图 1，克隆后测序获得序列长度分别为 1 467 bp，
1 168 bp， 在 NCBI 上 的 登 录 号 分 别 为 KF543779，
KF543780。在 NCBI 上同源性搜索发现，与该菌 16S
rRNA 和 gyrB 序列同源性高的已知细菌均为气单胞
菌属成员，序列同源性分别达 99% 以上和 95% 以上，
其中 16S rRNA 序列与多株维氏气单胞菌相应序列
同源性达 100%。16S rRNA 和 gyrB 基因系统进化树
（ 图 2） 均 显 示 HS120920 与 2 个 维 氏 气 单 胞 菌 生
物变种聚集，置信度分别达 99，97。结合细菌生
理生化特征、16S rRNA 和 gyrB 序列分析，确定菌
HS120920 为维氏气单胞菌温和生物变种。
2000
bp
M M1 2
1000
750
500
250
100
M. DNA Marker ；1. 16S rRNA ；2. gyrB
图 1 菌 HS120920 的 16S rRNA 和 gyrB 基因扩增结果
Aeromonas bestiarum CIP 7430 X60406
Aeromonas salmonicida NCIMB 1102 X60405
Aeromonas encheleia CECT 4342 HQ832414
Aeromonas popoffii LMG 317541 AJ224308
Aeromonas eucrenophila ATCC 23309T X74675
Aeromonas media ATCC 33907 X60410
Aeromonas hydrophila ATCC 7966 X60404
Aeromonas sobria NCIMB 12065 X60412
Aeromonas allosaccharophila CECT 4199 S39232
Aeromonas schubertii ATCC 43700 X60416
Aeromonas jandaei ATCC 49568 X60413
Aeromonas veronii bv. veronii ATCC 35624 X60414
Aeromonas veronii bv. sobria ATCC 9071 AF410949
Aeromonas trota ATCC 49657 X60415
Aeromonas caviae ATCC 15468T X74674
Aeromonas encheleia CECT 4342 AF417635
Aeromonas salmonicida ATCC 33658 AY294485
Aeromonas popoffii LMG 17541 JN711769
Aeromonas bestiarum ATCC 51108 AF417623
Aeromonas eucrenophila ATCC 23309 AF417629
Aeromonas media ATCC 33907 AF417627
Aeromonas schubertii ATCC 43700 AF417628
Aeromonas caviae ATCC 15468T AJ868400
Aeromonas hydrophila ATCC 7966 AF417622
Aeromonas trota ATCC 49657 AF417633
Aeromonas jandaei ATCC 49568 AF242651
Aeromonas allosaccharophila CECT 4199 AF417634
Aeromonas veronii bv. veronii ATCC 35624 AF417626 HS120920
HS120920
99
99
99
93
67 82
50
28
36
66
51
79
97
99
74
49
33
37
38
98
59
A
B
55
68
48
58
99
32
99
Aeromonas veronii bv. sobria CECT 4246 AY101775
Aeromonas sobria CIP 7433 AF417631
Vibrio anguillarum ATCC 19264 AB373053
Vibrio anguillarum ATCC 19264 X16895
图 2 16S rRNA（A）和 gyrB（B）序列构建的系统进化树
2.5 药敏试验
菌 HS120920 对 20 种抗菌药物中 7 种喹诺酮类、
5 种氨基糖苷类、2 种头孢菌素类、2 种四环素类药
物及复方新诺明敏感 ；对麦迪霉素中度敏感 ；对克
林霉素和新生霉素耐药（表 3）。
3 讨论
本研究将患出血病黄鳝的组织匀浆过滤液做
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期134
回归感染试验，证明疾病不是由病毒引起，但从病
鳝的肝、脾、肾中分离到大量细菌，16S rRNA 序
列分析证实随机挑选的 5 株菌为同一种，代表菌
株 HS120920 感染健康黄鳝证实其为黄鳝出血病的
病原。本研究鉴定菌 HS120920 时采用理化特征测
定和分子生物学分析（16S rRNA 和 gyrB 基因）相
结 合 的 方 式。 依 据《Bergey’s manual of systematic
bacteriology（second edition Part B）》， 菌 HS120920
的理化特性与维氏气单胞菌温和生物变种的相应特
性一致 ；16S rRNA 和 gyrB 基因的同源性及进化树分
析显示菌 HS120920 与气单胞菌属中 2 个维氏气单
胞菌生物变种的亲缘关系最高。结合理化特性、16S
rRNA 和 gyrB 基因分析，菌 HS120920 被鉴定为维氏
气单胞菌温和生物变种。
理化特性鉴定、16S rRNA 序列分析已成为细菌
种属鉴定和分类的标准方法［9，12］。编码促旋酶 B 亚
单位基因的 gyrB 基因存在于大多数细菌中，并且不
会发生频繁的水平转移，也常被用于近缘种和菌株
基因系统发育学分析［13，14］。从本研究的试验结果可
以看出，gyrB 基因与 16S rRNA 基因发育树的拓扑
结构不一致，尽管 2 个发育树中菌 HS120920 均与
2 个维氏气单胞菌生物变种聚集，但前者各节点处
的置信值总体高于后者的。因此，gyrB 基因发育树
的拓扑结构被认为更加可信。Yáñez 等［15］和 Küpfer
等［16］认为 16S rRNA 基因适合属间的系统发育分析，
gyrB 基因适合用于气单胞菌属种间及株间系统发育
分析。
维氏气单胞菌又名维隆气单胞菌、凡隆气单胞
菌，隶属于 γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）气单
胞菌目（Aeromonadales）气单胞菌科（Aeromonada-
ceae）气单胞菌属（Aeromonas）［10］。该菌分布广泛，
是一种新型的人 -鱼共患条件致病菌。人因患一些慢
性疾病导致机体抵抗力下降时，继发感染维氏气单
胞菌温和生物变种引发一些疾病，如腹泻［17］、败血
症［18］、胆管炎［18，19］、坏死性筋膜炎［20-22］等。维
氏气单胞菌（多为温和生物变种）曾引发国内外非
洲鲶、银无须魮、露斯塔野鲮、厚唇鲅、乌鳢、长
吻鮠、乌鳢患溃疡综合症［23-25］，华鲮烂尾［26］，中
华鳖［27］、异育银鲫［28］、泥鳅［29］、框镜鲤［30］、鳗鲡［31］
患出血病，青虾患软壳综合症［32］，西伯利亚鲟患病［33］
等，导致这些水生动物大批量死亡。本研究首次报
道维氏气单胞菌温和生物变种感染黄鳝，导致其发
病大量死亡。究其原因，我们认为本试验取病鳝的
鱼塘已养殖黄鳝多年，水体及肠道定植了一些对其
易感的病原菌，且减少动物饵料投喂、高密度养殖
等因素导致黄鳝机体免疫力下降，给病原入侵创造
了机会。
菌 HS120920 对 20 种 抗 菌 药 物 中 17 种 敏 感，
其中对喹诺酮类抗菌药物的敏感性最高，其次为头
孢类和氨基糖苷类。该试验结果对本次疾病的防治
有一定的指导意义。考虑到不同地域鱼塘的用药史
不同，及细菌对抗菌类药物耐药性频繁变异的特征，
该药敏试验结果不适合用于其他地域同种病原引发
疾病的防治，但能为取样地域该菌耐药规律研究提
供一些数据。
表 3 药敏试验结果
药物种类 抗菌药物 抑菌圈直径（mm） 敏感性 药物种类 抗菌药物 抑菌圈直径（mm） 敏感性
香豆素 新生霉素 11 R
四环素
四环素 23 S
大环内酯 麦迪霉素 14 I 强力霉素 20 S
林可酰胺 克林霉素 6 R
头孢
头孢氨苄 28 S
喹诺酮
依诺沙星 39 S 头孢他啶 34 S
氧氟沙星 41 S
氨基糖苷
新霉素 28 S
氟罗沙星 40 S 妥布霉素 24 S
恩诺沙星 39 S 卡那霉素 23 S
萘啶酸 38 S 庆大霉素 27 S
诺氟沙星 40 S 链霉素 22 S
洛美沙星 42 S 磺胺 复方新诺明 25 S
S ：高度敏感 ；I ：中度敏感 ；R ：耐药
2014年第3期 135陈红莲等 ：黄鳝病原性维氏气单胞菌温和生物变种的分离与鉴定
4 结论
从养殖患出血病的黄鳝中分离到大量细菌，16S
rRNA 分析证实 5 株随机挑选的细菌为同一种，编
码其中一株为 HS120920 进一步鉴定。结合生理生
化特征测定以及 16S rRNA 和 gyrB 基因序列分析，
证实菌株 HS120920 为维氏气单胞菌温和生物变种
（Aeromonas veronii bv. sobria）， 其 对 黄 鳝 半 致 死 量
LD50 为 5.79×10
7 CFU/mL。药敏试验表明该菌对 20
种抗菌药物中 7 种喹诺酮类、5 种氨基糖苷类、2 种
头孢菌素类和 2 种四环素类药物，及复方新诺明敏
感 ；对麦迪霉素中度敏感 ；而对克林霉素和新生霉
素耐药。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）