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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
丁酸乙酯是一种无色透明液体，有菠萝香味，
广泛应用于香精、食品、化学、医药和能源等工
业。近年来，由于国际石油价格的剧烈波动、传统
化工造成环境的严重污染以及石油资源的不可再生
性，生物燃料，特别是微生物发酵法生产乙醇、丁
醇引起了广泛关注。有研究表明，除了乙醇，酯类
也是很有效的汽油混合添加剂，并有望成为化石燃
收稿日期 ： 2014-06-12
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21276093），广东省科技计划项目（2011A08040322）
作者简介 ：张舍熹，女，硕士研究生，研究方向 ：发酵工程 ；E-mail ：shexizhang@126.com
通讯作者 ：王菊芳，女，教授，博士生导师，研究方向 ：生物能源和生物基化学品 ；E-mail ：jufwang@scut.edu.cn
丁酸发酵液萃取-酯化偶联合成丁酸乙酯的研究
张舍熹 陈少沛 杨晶 王菊芳
（华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006）
摘 要： 丁酸乙酯是一种广泛应用于食品、香精、化学、医药和能源等工业的短链酯类。为实现利用丁酸发酵液合成丁酸乙酯，
通过络合萃取丁酸发酵液并在萃取相中直接进行脂肪酶催化丁酸和乙醇发生酯化反应，实现了丁酸发酵液萃取-酯化偶联合成丁酸
乙酯。首先，确定了三辛胺（TOA）-环己烷为合适的萃取剂和酯化反应的反应溶剂。其次，对反应条件进行优化，在最优反应条件下，
萃取相中 Novozym 435 催化合成丁酸乙酯反应 5 h 基本达到平衡，酯化率为 81.42%，体积产率为 65.96 mmol/（L·h）；酶在该体系
中重复利用 6 次，酯化率仍未见明显降低，维持在 85.40%-87.83% 之间。100 mL 丁酸发酵液通过萃取-酯化后，丁酸乙酯相对于
丁酸的得率为 0.65 mol/mol。利用丁酸发酵液萃取-酯化偶联合成丁酸乙酯的工艺具有工业应用价值。
关键词 ： 丁酸乙酯 丁酸发酵液 萃取 酯化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.035
Study on Synthesis of Ethyl Butyrate by Butyric Acid Fermentation
Broth Extraction Coupling with Esterification
Zhang Shexi Chen Shaopei Yang Jing Wang Jufang
（School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006）
Abstract: Ethyl butyrate is one of the short chain ester, which is widely used in food, flavor, chemical, medicine and energy industry.
In order to synthesize ethyl butyrate using butyric acid fermentation broth, butyric acid extraction from fermentation broth and estrification
catalyzed by Novozym 435 in the extractive phase was studied. Tri-n-octylamine（TOA）+ cyclohexane were adopted as extractive agent and
esterification reaction medium. Under the optimum conditions, the esterification reaction in the extractive phase had approached equilibrium in
5 h, the corresponding esterification yield was 81.42% and productivity was 65.96 mmol/（L·h）. Good operational stability of Novozym 435
in this reaction system was observed. Ethyl butyrate yield relative to butyric acid was 0.65 mol/mol, which ethyl butyrate was synthesized by
100 mL butyric acid fermentation broth extraction-esterification coupling. These results suggest that synthesis of ethyl butyrate by butyric acid
fermentation broth extraction-esterification coupling could realize the scale-up industrial production.
Key words: Ethyl butyrate Butyric acid fermentation broth Extraction Esterification
料的替代物［1］。乙酸乙酯、丙酸乙酯和丁酸乙酯是
均质压燃（Homogeneous charge compression ignition，
HCCI）引擎的合适燃料［2］。丁酸酯类具有和生物
丁醇相近的能量值和性能而优于生物乙醇 ：基本不
溶于水，具有比乙醇低蒸发热，高闪点等优点［3-5］。
丁酸酯类可以通过微生物发酵廉价底物生产的丁酸
与醇进行酯化反应获得，且比生物丁醇更易生产。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期208
因此，丁酸酯类有望成为新型的生物能源。目前，
已有大量利用廉价底物（纤维素或半纤维素生物质）
发酵生产丁酸和乙醇的研究，可以建立简单的一步
低能耗、低成本方法将发酵产生的天然丁酸和乙醇
在天然催化剂——脂肪酶的作用下进行酯化反应合
成丁酸乙酯，从而满足目前市场对天然调味品和液
体生物燃料的需求。
丁酸乙酯目前工业化大量生产的方法主要是利
用化学合成法，而酶法合成丁酸乙酯的工业工艺并
不成熟。Yang［6］发明的专利提出了一种生产酯类的
方法——将发酵产生的有机酸提取到萃取溶剂中，
然后直接和醇在催化剂的作用下转化为酯，使得发
酵、萃取和酯化偶联在一起。最后，有机酯通过在
蒸馏塔中蒸发与萃取剂分离，从而使得萃取溶剂再
生并循环用于萃取过程。未反应的醇也可以在此过
程中得到收集。该专利提供了利用脂肪酶合成有机
酯类进行大规模生产的工艺流程，从而使得酶促合
成酯类更具有产业价值，但未见任何文献报道有利
用此方法生产丁酸乙酯。其中，丁酸发酵-萃取偶联
的研究中以 Wu［7］的丁酸产量最高，为 301.0 g/L。
Wu 采用中空纤维膜萃取 -FBB（纤维床生物反应器）
固定化发酵耦合生产丁酸，萃取剂 Alamine 336（10%
V/V）-油醇对悬浮液中的游离细胞有毒性，对 FBB
固定化细胞无毒。而丁酸萃取-酯化偶联目前尚未见
有详细的研究报道。萃取-酯化偶联的关键在于选
择合适的有机溶剂作为萃取剂的同时又可以作为酯
化反应的反应溶剂，在萃取相中直接进行酯化反应，
实现萃取-酯化的偶联。
本研究对丁酸发酵液进行络合萃取，并在萃取
相中直接进行脂肪酶催化丁酸和乙醇发生酯化反应，
实现丁酸发酵液萃取-酯化偶联合成丁酸乙酯，旨在
为丁酸发酵-萃取-酯化的一体化生产工艺提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
Novozym 435（来源于 Candida antarctica，10 000
U/g）购自 Novozymes A/S（Bagsvaerd，Denmark）。三
辛胺购于阿达玛斯试剂（上海）有限公司，其他试
剂均为阿拉丁试剂（上海）有限公司的分析纯或色
谱纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 丁酸发酵液的制备及预处理 丁酸发酵液按
照文献［8］中的以葡萄糖为底物 FBB 固定化细胞
补料分批发酵模式制备。发酵液中的葡萄糖浓度不
再降低时结束发酵试验，收集发酵液。发酵液经
15 000×g 离心 50 min，去除菌体及其他不溶物杂质，
收集上清。然后用加酸沉淀法去除可溶性蛋白质，
盐酸调节 pH 值为 3，离心收集上清液以备萃取用。
1.2.2 发酵液萃取 一定量的络合剂 TOA（三辛胺）
和稀释剂混合，形成一定 TOA 浓度的萃取剂，将其
与等体积的预处理后的丁酸发酵液混合加入具塞三
角瓶中，于 25℃、180 r/min 的条件下在恒温振荡器
中震荡 3 h，再将混合液离心 10 min，使两相快速分
离平衡。取上相（有机相）和下相（水相）进行分
析测定萃取前后丁酸和乙酸的浓度。一般情况下，
萃取过程中上下相的体积变化忽略不计。分配系数
（distribution coefficient）定义为萃取后有机相中目标
物浓度与萃取后水相中目标物浓度的比值。萃取得
率（extraction yield）定义为萃取后有机相中目标物
浓度与萃取前发酵液中目标物浓度的百分比。
1.2.3 萃取剂中酯化反应 称取一定量的丁酸和乙
醇，用一定 TOA 浓度的萃取剂（TOA+ 环己烷）定
容，从而得到含有一定底物浓度的反应体系。酯化
反应在具塞三角瓶中进行，通过恒温振荡器控制反
应的温度和转速，初始反应条件为 ：0.6 mol/L 丁酸，
醇酸摩尔比为 1∶1，TOA 与丁酸的摩尔浓度比为
1∶1，酶添加量为 0.08 g，总体积为 10 mL，40℃，
180 r/min，10 h，具体试验条件根据需要作出调整。
丁酸乙酯酯化产率（esterification yield）定义为酯化
反应中丁酸乙酯的实际生成量（mol）与理论生成量
（mol）的百分比。
1.2.4 萃取相中酯化反应 预处理后的丁酸发酵液
与等体积的萃取剂（TOA+ 环己烷）混合进行萃取，
萃取平衡后用移液器移取上相（即为萃取相），用
于后续的酯化反应的反应溶剂。萃取相中酯化反应
的初始反应条件为 ：萃取时 TOA 与发酵液中丁酸
的摩尔浓度比为 2∶3，酯化反应体系中醇酸摩尔比
为 2∶1，酶添加量为 0.08 g，分子筛添加量为 0.4 g，
总体积为 10 mL，40℃，180 r/min，10 h，具体试验
2014年第12期 209张舍熹等：丁酸发酵液萃取-酯化偶联合成丁酸乙酯的研究
条件根据需要作出调整。
1.2.5 酶的重复利用 在最优反应条件下（萃取剂
中 TOA 与发酵液中丁酸的摩尔浓度比 2∶3，萃取
相中醇酸摩尔比为 2∶1，酶添加量为 8 g/L，分子筛
添加量为 40 g/L，总体积为 50 mL，40℃，180 r/min）
萃取相中进行酯化反应 24 h 后，先将分子筛取出，
通过抽滤将固定化酶 Novozym 435 和反应体系分离。
为了除去酶表面残留的底物和水分，Novozym 435 用
环己烷洗涤 3 次，然后置于 40℃恒温箱干燥 12 h，
再用于新的反应体系中催化合成丁酸乙酯。
脂肪酶的酯合成活力定义为 ：每分钟合成 1
μmol 丁酸乙酯所需要的酶量为一个活力单位 Us，其
测定方法为 ：测定酯化反应过程初始一段时间内（1
h）的样品中的丁酸乙酯的浓度，其计算公式为 ：䞟ਸᡀ⍫࣋ б䞨҉䞟⎃ᓖ mol/L ×৽ᓄփ〟 L ×106৽ᓄᰦ䰤 min
1.2.6 分析方法 采用 Agilent 7890A 气相色谱仪检
测发酵液中、萃取后水相和有机相、以及酯化反应
体系中乙酸、丁酸、乙醇、丁酸乙酯的浓度。分析条件：
DB-FFAP（123-3233）（30 m×320 μm×0.50 μm），
FID 检测器 ；载气为氮气，恒压模式（20 psi）；进
样量 ：0.2 μL，分流比 ：10∶1 ；进样器温度 230℃，
检测器温度 250℃，柱温采用程序升温 ；H2 流量 50
mL/min，空气流量 ：400 mL/min，尾吹流量（N2）：
30 mL/min ；采用内标法，内标物（internal standard）
为丙酸。
2 结果
2.1 萃取剂中稀释剂的选择
丁酸萃取多为络合萃取，所用的萃取剂大多是
胺类和磷氧类。一般来说，胺类的萃取效果较磷氧
类好，而胺类萃取剂中叔胺使用最多。本研究选择
了以三辛胺（TOA）为络合剂，考察了异戊醇、2-
辛醇、油醇、正己烷、正庚烷、环己烷、甲基异丁
基甲酮、甲基叔丁基醚 8 种不同稀释剂对发酵液中
丁酸和乙酸萃取的影响（图 1），以及对酶催化合成
丁酸乙酯的影响（表 1）。稀释剂一方面能够调节萃
取剂的密度、黏度、极性及界面张力等，减缓乳化
现象而影响萃取 ；另一方面其极性大小直接影响脂
肪酶的催化效果［9］、底物在溶剂中的溶解度以及酯
化反应的反应平衡［10-12］。从图 1 和表 1 中可知，兼
顾丁酸分配系数和萃取得率高，乙酸分配系数和萃
取得率低以及酯化率高的稀释剂为环己烷，环己烷
的价格也相对较低，沸点与目的产物丁酸乙酯相差
很大（80.7℃ vs. 121.5℃），便于后续的丁酸乙酯蒸
馏纯化及萃取剂的再回收利用，因此后续的研究中
萃取剂中的稀释剂采用环己烷。
0
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A+
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1
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50
60
70
80distribution coefficient
extraction yield
90
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0.1
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0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
A
B
distribution coefficient
extraction yield
图 1 不同稀释剂对发酵液中丁酸（A）和乙酸（B）萃取
的影响
2.2 TOA浓度对丁酸萃取和酯化反应的影响
2.2.1 TOA 浓度对发酵液中丁酸萃取的影响 由于
萃取剂 TOA+ 环己烷萃取丁酸为络合萃取，碱性的
TOA 将会与酸性的丁酸形成酸-胺络合物，所以丁
酸的分配系数直接 TOA 浓度有关。由图 2 可知，当
TOA 浓度增大时，丁酸的分配系数和萃取得率越大；
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期210
当 TOA 浓度增加到 0.6 mol/L 后，丁酸的分配系数增
大幅度减小 ；当 TOA 浓度增加到 0.4 mol/L 后，丁
酸的萃取得率变化不大，所以 TOA 浓度选择 0.4-0.6
mol/L 较为合适，此时 TOA 与发酵液中丁酸的摩尔
浓度比为 2∶3-1∶1。
应速度，但过高的温度易引起酶失活。考察不同温
度对萃取剂中酶催化酯化反应的影响，结果（图 4）
显示，随着温度的升高，酯化率先升高后降低，在
温度为 40℃时，酯化率达到最大。
表 1 不同稀释剂对丁酸乙酯酯化产率的影响
稀释剂 Log Poct 酯化产率（%）
异戊醇 1.28 3.69 ± 0.31
2-辛醇 2.90 12.04 ± 0.49
油醇 7.10 9.84 ± 0.74
正己烷 3.50 66.13 ± 1.24
正庚烷 4.00 63.76 ± 1.18
环己烷 3.20 67.65 ± 0.53
甲基异丁基甲酮 1.31 43.90 ± 1.49
甲基叔丁基醚 1.06 48.23 ± 1.06
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
TOA Concentration mol/L 12 0
50
60
70
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75
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9
10 distribution coefficient
extraction yield
图 2 TOA 浓度对发酵液中丁酸萃取的影响
2.2.2 TOA 浓度对萃取剂中酯化反应的影响 为确
定合适的络合剂浓度，进一步考察了 TOA 浓度对萃
取剂中酯化反应的影响，结果（图 3）显示，TOA
浓度明显影响酯化反应，随着 TOA 浓度增加，酯化
反应的酯化产率显著下降。这可能是因为 TOA 的碱
性基团能和酸反应生成离子对复合物，该复合物会
减少自由酸的数量导致较低的转化率和起始速度 ；
加入 TOA 会抑制酸的酸性，导致脂肪酶活性降低 ；
高浓度的 TOA 会改变溶剂的性质，进而改变反应物
的溶解度。因此，合适的 TOA 浓度为 0.4 mol/L，即
萃取时 TOA 与发酵液中丁酸的摩尔浓度比为 2∶3。
2.3 萃取剂中酯化反应的优化
2.3.1 反应温度 一般来说，温度升高可以加快反
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0
0.0-0.2 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
TOA Concentration mol/L 1020 1.230
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100
图 3 TOA 浓度对萃取剂中酯化产率的影响
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3025 35 40 45 50 55ᓖ ć 1020 6030
40
50
60
70
80
90
100
图 4 反应温度对萃取剂中酯化产率的影响
2.3.2 酶添加量 酶量增加有利于酶分子与底物之
间发生有效碰撞，从而加快反应速度，而增加到一
定值后，反应体系中底物几乎全部被酶饱和，甚至
会出现传质的困难。考察酶添加量对对萃取剂中酶
催化酯化反应的影响，结果如图 5 所示。在一定范
围内（0.02-0.08 g），随着酶添加量的增加，酯化率
明显迅速增大，当酶添加量超过 0.08 g 时，酯化率
开始下降，但下降相对缓慢很多，所以最优酶添加
量应为 0.08 g（即 8 g/L）。
2.3.3 醇酸摩尔比 由于底物乙醇的成本低，以及
在本研究的生产丁酸乙酯工艺中，使用原料是丁酸
发酵液，所以丁酸为本研究的限制性底物。适当提
2014年第12期 211张舍熹等：丁酸发酵液萃取-酯化偶联合成丁酸乙酯的研究
高乙醇的添加量，有助于反应平衡向生成丁酸乙酯
的方向移动。醇酸摩尔比对反应的影响（图 6）表
明，醇酸摩尔比为 2∶1 时，酯化率最高。
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Y
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0
0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
Amount of Novozyme 435 g 102030
40
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60
70
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100
图 5 酶添加量对萃取剂中酯化产率的影响
Es
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Y
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%
1:1 2:1 3:1 4:1 5:1
Substrate Molar Ratio ethanol:butyric acid 405060
70
80
90
100
图 6 醇酸摩尔比对萃取剂中初始反应速度及酯化率的影响
2.4 萃取相中酯化反应
2.4.1 分子筛添加量对萃取相中丁酸乙酯合成的影
响 萃取相是和水相充分接触后的有机相，而且酯
化反应会产生水，水的存在影响酶的稳定性和活性，
一方面微量的水是有利于酶分子处于催化作用所必
须的构象状态，另一方面过量的水不利于反应平衡
向酯化反应方向移动［13］。所以控制该体系中的含水
量十分关键。分子筛由于其成本低、易回收等优点，
目前应用最为广泛。3 Å 分子筛添加量对萃取相中
丁酸乙酯合成的影响结果如图 7 所示，3 Å 分子筛
的添加量为 0.4 g（即 40 g/L）时，酯化率最高。
2.4.2 萃取相中 Novozym 435 催化合成丁酸乙酯的
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100
图 7 3 Å 分子筛添加量对萃取相中酯化率的影响
动力学 在最优反应条件下（萃取剂中 TOA 与发酵
液中丁酸的摩尔浓度比 2∶3，萃取相中丁酸浓度为
0.41 mol/L，醇酸摩尔比为 2∶1，酶添加量为 8 g/L，
分 子 筛 添 加 量 为 40 g/L， 总 体 积 为 10 mL，40 ℃，
180 r/min），考察萃取相中 Novozym 435 催化合成丁
酸乙酯的动力学。结果（图 8）表明，该反应条件下，
Novozym 435 催化合成丁酸乙酯在反应 5 h 时基本达
到平衡，酯化率为（81.42±1.37）%，体积产率为
65.96 mmol/（L·h）；反应从 5 h 到 12 h，产物浓度
增加幅度不大，12 h 时酯化率为（85.70±0.74）% ；
12 h 到 97 h，产物浓度变化不显著，也没有减少的
趋势，说明该反应体系也适用于固定化脂肪酶的长
期催化，反应也没有向逆反应方向进行。
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0.3
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0.8
0.9
1.0 butyric acid
Esterification Yield
ethyl butyrateethanol
Time h 4 6 8 10 12 24 48 72 96
图 8 最优条件下萃取相中 Novozym 435 催化合成丁酸乙
酯的动力学
2.4.3 Novozym 435 的重复利用 考察 50 mL 萃取相
中最优条件下 Novozym 435 的重复利用对丁酸乙酯
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期212
合成的影响，为扩大工业化生产奠定基础。结果表
明固定化酶 Novozym 435 的酯合成活力在重复利用 6
次后降为初始活力的 54.61%，而酯化率未见明显降
低，维持在 85.40%-87.83% 之间。6 个批次后，酶
的酯合成活力下降而酯化率未见明显下降，可能是
由于酶催化合成丁酸乙酯达到平衡时间延缓，但 24
h 内仍可以达到平衡，并且对酯化率影响不大。说
明了在该体系中，Novozym 435 能够保持良好的稳定
性和重复利用性，从而降低了生产成本，为工业化
生产奠定了良好基础。
2.5 反应的初步扩大
采用以上各因素优化条件，100 mL 丁酸发酵
液萃取-酯化偶联合成丁酸乙酯的结果（表 2）表
明，丁酸乙酯相对于发酵液中丁酸的得率为 0.65
表 2 100 mL 丁酸发酵液萃取-酯化偶联合成丁酸乙酯的结果
发酵液中丁酸浓度（mol/L） 丁酸分配系数 丁酸萃取得率（%） 酯化率（%） 丁酸乙酯得率（mol/mol）
0.53 ± 0.02 5.12 ± 0.08 79.63 ± 2.31 86.40 ± 0.61 0.65 ± 0.00
mol/mol，说明该工艺具有工业应用价值。
3 讨论
酶催化合成酯类可以在低温、低压条件下进行，
这样得到的产品比用化学方法更纯，并且已被认为
是“天然”的［14，15］。因此，丁酸乙酯的酶催化合
成法比化学合成法更具有吸引力。丁酸乙酯的酶法
合成主要利用固定化脂肪酶，因其能够高效、专一、
反应温和，且能够进行分离回收利用，多次重复利
用，具备贮存稳定性高、操作可控、工艺简便等优点，
这些均是游离酶所不具备的［16］。固定化酶催化丁酸
和乙醇合成丁酸乙酯的优化试验中，转化率可高达
98%［17］，这些体系中大部分的高转化率是因为反应
时间过长或者底物浓度很低，所以并不能将体系按
比例扩大应用于工业生产。高底物浓度时，酯化率
最高为 85%，体积产率为 595 mmol/（L·h）［18］。本
研究中，萃取相中酯化反应的酯化率 5 h 即可达到
（81.42±1.37）%，体积产率为 65.96 mmol/（L·h），
已达到较好的水平。最重要的是，本研究首次利用
丁酸发酵液通过萃取-酯化偶联合成丁酸乙酯，而不
是纯试剂丁酸。
4 结论
萃取剂 TOA-环己烷可以有效地萃取分离发酵液
中的丁酸，并且可用于后续酶促酯化反应合成丁酸
乙酯的反应溶剂。TOA 浓度增加时，丁酸分配系数
和萃取得率也增加，但丁酸乙酯的酯化产率下降 ；
合适的 TOA 浓度为 0.4 mol/L，即萃取时 TOA 与发
酵液中丁酸的摩尔浓度比为 2∶3。对影响酯化反应
的关键因素进行优化，获得最优条件为反应温度为
40℃，酶添加量为 8 g/L，醇酸摩尔比为 2∶1，分子
筛添加量为 40 g/L。利用以上优化条件，萃取相中
Novozym 435 催化合成丁酸乙酯在反应 5 h 即可达到
平衡，并且反应 96 h 也一直没有向逆反应——水解
反应方向进行的趋势 ；Novozym 435 在该体系中重复
利用 6 次，酯化率未见明显降低，维持在 85.40%-
87.83% 之间 ；100 mL 丁酸发酵液通过萃取-酯化后，
丁酸乙酯相对于丁酸的得率为 0.65 mol/mol。以上说
明了利用丁酸发酵液萃取-酯化偶联合成丁酸乙酯的
工艺具有工业应用价值。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）