全 文 ：面包酵母催化羰基不对称还原合成手性醇的研究
黄 和，杨忠华，姚善泾!
（浙江大学 化学工程与生物工程学系，杭州 !"##$%）
摘 要：以 $&辛酮和 ’&氯乙酰乙酸乙酯（()*+）为模型底物分别考察了酵母细胞对直链甲基酮和!&羰基酯中的羰基
不对称还原情况。实验发现不对称还原 $&辛酮的产物主要是 ,型的 $&辛醇，且对映体选择性很高。不对称还原
()*+生成的主要是 ,（-）&型产物，反应 ()*+的转化率、光学选择性都比较高。同时发现 ()*+的浓度和产物对不
对称还原都有一定负面的影响。
关键词：不对称还原；手性合成；手性醇；面包酵母；全细胞生物催化；,&$&辛醇；,&’&氯&!&羟基丁酸乙酯
中图分类号： ./"’01 文献标识码： 2 文章编号： "3%$&!3%/（$##’）#$&##4$&#’
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生物催化羰基化合物的不对称还原合成手性醇
已成为手性合成的一个重要方法［" W !］。纯化的酶
用于不对称有机合成的进行，已有许多报道［’］。微
生物全细胞含有许多具有立体选择性的酶，也常被
用于不对称合成，这除了省去复杂的酶分离和纯化
步骤外，微生物还含有一些在胞内具有催化活力而
在胞外极容易失活的酶。更重要的是，生物催化羰
基的不对称还原需要还原型的辅酶 72-（X）5 参
与，具有生物活性的完整细胞在催化过程中可以利
用其代谢过程再生还原型辅酶，这就可以比较方便
地解决辅酶再生问题，有利于该类反应的进行并易
于实现产业化。
面包酵母（*AQ9E’M N9AMF，!"##$"%&’(#)* +)%),-*-.
")）价廉易得，容易处理，以及能安全用于医药和食
! 收稿日期：$##’&#!&"$
基金项目：国家自然科学基金资助项目（7)0$#$%3#34）
作者简介：黄 和（"1%’&），男，湖南湘乡人，博士，讲师，现在湖南科技大学化学与化工学院工作，研究方向：生物化工。
联系人：姚善泾，+&GACJ：NA=MBY I<90 OB@ 0 9K@0 I>
ZAN $##’
·4$·
生 物 加 工 过 程
(9M9 [=@E>AJ =H *C=DE=I9MM +>?C>99EC>?
第 $卷第 $期
$##’年 4月
万方数据
品添加剂的合成，能不对称催化酮和不饱和双键的
还原，直接得到具有重要应用前景的手性化合物。
但过去这方面的研究主要集中在乙酰乙酸乙酯和含
各种环的酮类化合物中羰基的还原［!］。本文以 "#
辛酮和 $#氯乙酰乙酸乙酯（%&’(）为模型底物分别
考察了酵母细胞对直链甲基酮和!#羰基酯中的羰基
不对称还原情况。"#辛酮是简单直链酮的理想模型
底物，同时其相应的手性 "#辛醇是合成多种手性抗
生素、昆虫信息素以及高档液晶的重要手性前体。
当前手性 "#辛醇的获得主要是通过化学方法或脂
肪酶的拆分［)］。$#氯乙酰乙酸乙酯能很好地做为!#
羰基酯被微生物细胞还原的模型底物，更重要的是
因为其对应的!#羟基酯引入了一个活泼的氯原子，
故其要比一般的乙酰乙酸乙酯对应的手性醇具有更
广泛的应用。据报道相应的 *#和 +#$#氯#!#羟基丁
酸乙酯（%,’(）是许多单一对映体药物的重要手性
砌块。
! 材料与方法
-.- 实验材料
-.-.- 酵母
面包干酵母，由广东梅山酵母有限公司生产。
-.-." 试剂
"#辛酮、"#辛醇、%&’(，（+）#%,’(，（*）#%,’(购
自 /%*&+ 公司，分析纯。正癸烷，购自 +012/ 公
司，分析纯。乙酸乙酯等其它化学试剂购自中国医
药（集团）上海化学试剂公司，分析纯。盐酸、葡萄糖
为市售分析纯。3456、酵母浸膏为 ’57 ’8695 0:9. 产
品。
!"# 实验方法
-.".- 面包干酵母的活化
在 ";; <= 的活化液中，含有葡萄糖 )>、
（?,$）"+&$ ; @ ">、A",B&$ ; @ ->、%8+&$ ; @ ->，柠檬
酸 ;.->，加入 C @ ) D干面包酵母粉在摇床中以 -C)
4 E <5:转速和 !; F下恒温活化 - G。
-."." 还原反应
活化或培养的菌体通过 H ;;; 4 E <5: I -; <5:离
心收集。离心后的菌体再以 ;.;) <7J E = K, C.; 的
3456#,%J缓冲液洗涤两次。得到的菌体保存于 $ F
的冰箱中备用。
取 $.; D的湿菌体（菌体干湿比为 ;.") D 干菌
体 E - D湿菌体），悬浮于含 ); <= ;.;) <7J E = 3546#,%J
缓冲液（K, C.)）的 -); <=的锥形瓶中，再向缓冲液
中加入一定量的 "#辛醇或 %&’(和 ;.) D的葡萄糖，
在恒温摇床中 -C) 4 E <5:反应一定时间。
-.".! 产物的分离与检测
取反应一定时间后的混合液 ") <=，用乙酸乙
酯萃取 ;.) G，离心分层。上清液以无水 ?8"+&$ 干
燥后用气相色谱分析产物和未反应底物的浓度。以
正癸烷为内标物来定量。色谱装有以 AL#- 为固定
相、膜厚 ;.!"<、内径 ;.") <<、柱长 !; <的毛细管
柱，L0M检测器。"#辛酮还原液分析的色谱条件为：
柱温 -"; F、气化和检测温度 ""; F、?" 为载气，柱
前压 ;.- 2B8、进样量为 ;.""=分流比 "; N -。"#辛
酮和 "#辛醇的保留时间分别为 H.! <5:和 H.O <5:。
%&’(还原分析的色谱条件为：柱温初温 O; F维持
$ <5:、"; F E <5:升温、终温 -P; F维持 ! <5:，气化
和检测温度均为 "); F，载气为 ?"，柱前压 ;.-
2B8，进样量为 ;.! "=，分流比 -;; N -。%&’( 和
%,’(的保留时间分别为 C.CO <5:和 P."$ <5:。利
用旋光仪（QRR#"+数字式自动旋光仪）测定萃取产
物的旋光值，旋光管长度为 ";.; 9<，进而计算出对
映体过量值 ! . ! .，方法参照何成等的文献［H］。
用转化率（"#$!）来定量表示底物的转化情况。
计算式分别为："#$!S
"# T "!
"#
I -;;>，式中 "#、"!
分别为反应起始、结束后底物的浓度。反应的光学
选择性以产物的对映体过量值（ ! . ! .）表示。定义
为：! % ! % S
"& T "’
"& U "’
，其中 "& 和 "’ 分别为 +和 *#产
物的浓度。
# 结果与讨论
酵母中含有多种氧化还原酶，如醇脱氢酶、M#和
=#!#羟基酯还原酶、脂肪酸合成酶（L/+）等，可以催
化羰基的不对称还原，生成相应的具有光学活性的
手性醇［!，C，P］。这些酶催化还原反应需作为电子传
递的辅酶 ?/M（B）,参与。但酵母细胞中 ?/M（B）,
的量很少，相当于 - D干重的细胞中约含 -;;"D的
?/M（B）,［O］。因此在这类反应中必须再生辅酶
?/M（B）,才能使反应顺利进行下去。活性细胞可
以利用葡萄糖或其它碳源，在代谢过程中产生还原
反应所必需的 ?/M（B）,，使这两种反应在细胞中进
行耦合。这就解决反应所需辅酶的再生问题。在实
";;$年 )月 黄 和等：面包酵母催化羰基不对称还原合成手性醇的研究 ·)!·
万方数据
验中我们使用葡萄糖作辅助底物用来再生辅酶
!"#（$）%。
&’( 面包酵母催化脂肪酮的不对称还原
实验以 &)辛酮为甲基脂肪酮的模型底物，利用
面包酵母对其进行不对称还原。通过分析发现反应
后的主要产物为 &)辛醇，构型为 * 型其 ! ’ ! ’ 为
+,-，同时旋光仪所测得的旋光值为正值，这与 %./)
0123［4］的结果一致。这表明面包酵母不对称还原直
链甲基酮遵循 $5.167规则。每隔一段时间取样分析
测得的反应时间进程曲线如图 (所示。从曲线中可
以看出在反应过程中前 (& 8的 &)辛酮转化速率比
较快，&9 8后反应的速度已经很慢，94 8后底物量基
本保持不变，而产物的浓度有一定的下降。通过计
算反应进程曲线前段的斜率，可以得到反应的初速
度为 4’&:!;61 < 7（干重）·8。在 =5/>>/?等
［(@］报道的
在己烷为溶剂的有机相反应中，利用面包酵母不对
称催化苯乙酮还原为")苯乙醇，反应的初始速率约
为 (9!;61 < 7（干重）·8。可以发现对于这两类简单
甲基酮的还原其反应速率相当。从图 ( 中可以看
出，反应系统中产物和反应物的和小于反应开始时
底物的量。这说明在酵母不对称还原 &)辛酮的同
时还能存在分解 &)辛酮和产物 &)辛醇的副反应。我
们通过改变辅助底物葡萄糖的加入量来进一步考
察，从转化率和收率来说发现不加辅助底物时反应
效果明显没有加入葡萄糖时好。
&’& 面包酵母催化#)羰基酯的不对称还原
同时以 ABCD为#)羰基酯的模型底物，利用面
包酵母对该类羰基化合物进行不对称还原。通过对
反应后萃取液的分析发现，反应的产物为 A%CD，产
物中 *（#）型对映异构体占优。经旋光仪测定其旋
光度小于零。在我们先前的实验中以邻苯二甲酸二
丁酯作反应介质，得到的产物主要是 E型，E)A%CD
的对映体过量值为 FG-左右。可以看出反应介质
的不同对面包酵母催化羰基不对称还原的立体选择
性影响很大，!2H2;I52等［((］以苯为反应介质利用面
包酵母催化")羰基酯不对称还原时也发现这种现
象。可能是有机介质抑制了催化 * 型产物酶的活
性。
每隔一定时间从反应系统中取样分析，得到图
&的反应进程曲线。可以看出面包酵母对 ABCD还
原的催化活性较高，反应速度较大。通过反应进程
曲线开始阶段的求导得到的反应速度为 &’, ;;61 <
（7·8）。& 8左右反应进行完全。反应结束后产物的
浓度略小于初始底物浓度，说明在反应的过程中存
在一定程度的副反应。这主要是 ABCD在水相体系
中会存在小量的水解，尤其在碱性条件下这种副反
应更明显，同时酵母细胞中含有少量的能催化酯水
解的酯酶和脂肪酶，这会使扩散进酵母细胞中的
ABCD或 A%CD存在少量的分解副反应。
—!—&)BJK2?6?. —"—&)BJK2?61
图 ( 反应的时间进程曲线（,’4 ;;61 < L &)BJK2?6?.，:@ M，
N% ,’G）
O/7P( A6I53. 6> 5.0IJK/6? &)6JK2?6?. K6 &)6JK2?16 QR R.23K 2K
,’4 ;;61 < L &)6JK2?6?.，:@ M，N% ,’G
—!—ABCD —#—A%CD
图 & 反应的时间进程曲线（G@ ;;61 < L ABCD，:@ M，N%
,’G）
O/7P & A6I53. 6> 5.0IJK/6? ABCD K6 A%CD QR R.23K 2K G@
;;61 < L ABCD，:@ M，N% ,’G
反应时不同底物的浓度可能会对酵母催化不对
称还原反应具有一定的影响。因此实验考察了在反
应系统中加入不同量的 ABCD对反应的影响，其初
始浓度分别为 (9’4、&G’@、G@’@、,G’@和 (@@’@ ;;61 <
L，ABCD 在水中的最大溶解浓度为 (,F’G ;;61 < L。
底物浓度对反应的影响如图 :所示。可以看出当浓
度小于 G@’@ ;;61 < L时，浓度对反应的转化率和收
率影响不大。但当浓度大于 G@’@ ;;61 < L 时，随着
底物浓度的增大反应的转化率和收率显著下降。产
·G9· 生物加工过程 第 &卷第 &期
万方数据
生这种现象的主要原因可能是底物对反应的抑制作
用。对于反应的选择性从图 !中可以看出，在很低
的底物浓度下以 "型产物为主（ ! # ! # $ %），随着底
物浓度的增大 &型产物越来越过量。产生这种现象
的原因是在酵母中含有催化!’羰基酯分别生成 (
型和 )型产物的酶，同时这两类酶具有不同的 "#、
$*+,值。当底物浓度不同时催化生成的 (和 )型产
物的速度就不一样，因而 ! # ! # 值也不一样。
为了考察产物 -./0 对反应是否具有抑制作
用，我们在 1% 2234 5 )的 -6/0反应体系中分别加入
不同量的（ 7）-./0，使其在反应体系中的浓度分别
为 8#9、9:#;、;<#1、:;#<、89#: 2234 5 )。实验结果如
图 : 所示。转化率和产物的 ! # ! # 值都随加入的
-./0浓度的增大而降低。表明产物对还原反应具
有较高的抑制作用。
—!—%&’( —"— ! ) !
图 ! 底物浓度对酵母细胞转化 -6/0的影响（!% =，>.
8#1，反应 ; ?）
@ABC ! 0DDE*, 3D FGHF,I+,E *3J*EJ,I+,A3J 3J ,?E *3JKEIFA3J 3D
-6/0 HL LE+F, *E44F +, !% =，>. 8#1，D3I ; ?
—!—%&’( —"— ! ) !
图 : 产物对酵母细胞转化 -6/0的抑制作用，（-6/0 1%
2234 5 )，!% =，>. 8#1，反应 ; ?）
@ABC: MJ?AHA,A3J 3D >I3NG*, 3J ,?E *3JKEIFA3J 3D -6/0 HL LE+F,
*E44F +, 1% 2234 5 ) -6/0，!%=，>. 8#1，D3I ; ?
! 结语
酵母催化 ;’辛酮的不对称还原的结果表明，该
微生物能催化直链脂肪酮的不对称还原反应，生成
以 &型为主的直链脂肪醇，且反应具有较高的立体
选择性。但实验发现在酵母还原时还存在较大的副
反应。同时这类脂肪酮在水中溶解度都很低，因此
在反应开始时底物的浓度很小，这就为后面产物的
提取带来了困难。为了提高反应物的浓度和简化产
物的分离可以考虑使用两相反应体系或有机相溶剂
作反应介质。
面包酵母催化 -6/0不对称还原的实验结果表
明，该微生物能催化!’羰基酯的不对称还原反应，在
水相体系中生成以 &（(）型产物为主的!’羟基酯。
这与在有机介质中使用该微生物催化 -6/0的立体
选择性相反。虽然反应获得了较高的立体选择性，
但通过对酵母的热处理和添加一些酶抑制剂也许还
可以进一步提高反应的立体选择性。我们将对此进
行更深入的研究。
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