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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(10):140-148
小桐子（Jatropha curcas L.）属大戟科（Euphor-
biaceae）麻疯树属（Jatropha）植物［1，2］，原产美洲，
现广布于世界各热带地区及我国南方诸省［3］。作为
重点开发的油料植物，其种子含油量高，可提取加
工成生物柴油。根、茎及树皮乳汁中富含多种药用
成分，可用作生物医药及生物农药的药源。另外，
加工后的油饼蛋白质含量高，脱毒后可直接用于动
物饲料，因此小桐子具有广阔的开发利用前景［4］。
赤霉素（Gibberellins，GAs）是一种重要的植
物激素，目前发现有 100 多种，但只有部分形式具
收稿日期 ：2015-03-02
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31260064，31460059，31160169，31460179）
作者简介 ：王海波，男，博士研究生，研究方向 ：植物逆境生物学 ；E-mail ：bocai0406@163.com
通讯作者 ：龚明，男，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：植物逆境生物学 ；E-mail ：gongming63@163.com
小桐子赤霉素 20 氧化酶的基因克隆及低温下表达分析
王海波1，2  邹竹荣1  龚明1
（1. 云南师范大学生命科学学院 生物能源持续开发利用教育部工程研究中心 云南省生物质能与环境生物技术重点实验室，昆明 650500 ；
2. 曲靖师范学院生物资源与环境科学学院，曲靖 655011）
摘 要 ： 赤霉素 20 氧化酶是植物赤霉素生物合成的限速酶，决定有生物活性的 GA1 与 GA4 的合成量。基于先前获得的小桐
子低温锻炼转录组数据，以小桐子幼苗的根为材料，采用 RT-PCR 技术克隆到小桐子赤霉素 20 氧化酶基因 JcGA20ox 的 cDNA 序列
（GenBank 登录号 KJ670150.1）。该 cDNA 全长 1 307 bp，含有完整的开放阅读框（1 131 bp），编码 376 个氨基酸，分子量为 43 kD，
理论等电点为 6.7。其推导蛋白属于 2-ODD 家族，包含 2-酮戊二酸双加氧酶结构域（Fe2OG_OXY）。半定量 RT-PCR 表达分析显示，
JcGA20ox 在小桐子各组织中都有表达，但表达水平具有组织特异性，在茎中表达量较高，且受低温诱导表达最显著，而在叶中表
达量相对较低。
关键词 ： 小桐子 ；赤霉素 20 氧化酶 ；2-酮戌二酸双加氧酶结构域 ；低温诱导
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.10.023
Gene Cloning and Cold-induced Expression Analysis of the Gene
Encoding Gibberellin 20 Oxidase from Jatropha curcas
Wang Haibo1，2 Zou Zhurong1 Gong Ming1
（1. School of Life Sciences，Yunnan Normal University，Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass
Energy，Ministry of Education，Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Province，Kunming 650500 ；
2. College of Biological Resource and Environmental Science，Qujing Normal University，Qujing 655011）
Abstract:  Gibberellin（GA）20 oxidase, a rate-limiting enzyme in GA biosynthesis, determines the amount of active GA forms, GA1
and GA4. Based on our previous transcriptome data of chilling-hardened Jatropha curcas, a new gene encoding gibberellin 20 oxidase（named
JcGA20ox）was cloned by RT-PCR from the root of J. curcas seedlings（GenBank accession number ：KJ670150.1）. The full-length cDNA
of JcGA20ox was 1 307 bp, containing an entire open reading frame（ORF）of 1 131 bp. This ORF encoded a polypeptide of 376 amino
acids with the molecular weight of 43 kD and the pI value of 6.7. Bioinformatics analysis showed that the JcGA20ox protein contained a Fe2+
and 2-oxoglutarate dioxygenase domain（Fe2OG_OXY）, belonging to the 2-ODD family. Semi-quantitative RT-PCR analysis revealed that
JcGA20ox expressed differently in different tissues, with abundant and remarkably cold-induced expression in stem, but scarcely in leaves.
Key words:  Jatropha curcas ；gibberellin 20 oxidase ；2-oxoglutarate dioxygenase domain ；cold induction
2015,31(10) 141王海波等：小桐子赤霉素 20 氧化酶的基因克隆及低温下表达分析
有生物学活性，在高等植物整个生命周期的种子萌
发、茎的伸长及花的发育等方面都起着重要作用［5］。
作为一种四环二萜羧酸，其合成从牻牛儿牻牛儿基
焦磷酸（Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）开始，
经 历 了 贝 壳 杉 烯（Ent-kaurene）、GA12- 醛（GA12-
aldehyde） 等 关 键 中 间 分 子。 赤 霉 素 20 氧 化 酶
（Gibberellin 20 oxidase）是从 GA12- 醛到各种有活性
GAs 的关键限速酶［6］。自从 1994 年利用蛋白质抗体
技术，从南瓜胚乳表达文库中筛选到编码赤霉素 20
氧化酶的 cDNA 以来，目前已经从拟南芥［7］、小麦［8］、
板栗［9］、甘蔗［10］等许多植物中克隆到了该基因，
但关于小桐子的 GA20ox 还未见报道。本研究利用
本课题组前期获得的小桐子低温锻炼转录组和数字
基因表达谱数据［11，12］，克隆获得小桐子 JcGA20ox
基因的全长 cDNA 序列，并对其进行生物信息学分
析及低温下表达分析，旨在为研究小桐子通过调节
内源性赤霉素生物合成对各种逆境因子的应答机制
研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 供试小桐子种子取自云南省楚雄
州元谋县。
1.1.2 菌株与主要试剂 大肠杆菌 Trans1-T1（DH5α）
菌 株 由 本 实 验 室 保 存 ；TransZol Up、DNase I、
TransStart Taq DNA Polymerase、Amp、X-gal、IPTG、
2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）、TransScript Two-
Step RT-PCR SuperMix、EasyPure Quick Gel Extraction
Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、pEASY-T1
Cloning Kit、pEASY-E1 Expression Kit、Trans 2K Plus
II DNA Marker 购自北京全式金生物技术有限公司 ；
引物合成和测序由深圳华大基因有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 材料处理 选取饱满的小桐子种子，用 1.5%
CuSO4 消毒 20 min，无菌水漂洗 5 次，于 26℃的恒
温培养箱中吸涨 24 h［13］。将吸涨的种子在无菌水中
漂洗 3 次，播于垫有 5 层用无菌水湿润滤纸的白磁
盘（24 cm×16 cm） 中， 于 相 对 湿 度（RH）75%、
26/20℃、16/8 h 光周期的恒温培养箱中萌发 5 d。将
发芽的种子播于消毒的培养土中并于同样恒温培养
箱中生长 15 d 至第二片真叶展开，每天用无菌水润
湿培养土。将生长 15 d 的小桐子幼苗置于相对湿度
（RH）75%、12℃、16/8 h 光周期的低温培养箱中进
行低温处理，分别取低温锻炼 12、24 和 48 h 与对
照（正常培养）的根、茎及第二片真叶，用铝箔纸
包好，液氮速冻后保存于 -80℃冰箱中以用于 RNA
的提取。
1.2.2 引物的设计 利用与小桐子同属大戟科的蓖
麻（Ricinus communis）的 GA20ox 基因全长 mRNA 序
列（XM_002510827.1），以我们测序得到的小桐子低
温锻炼转录组（GenBank 登录号 GAHK00000000.1）
的 45 251 条 Unigenes 为数据库，进行本地 Blast，检
索到与蓖麻 GA20ox 基因相似性最高的 Unigene 序列
Unigene12450_JC-CK_1A（1 417 bp），以此序列设计
基因全长扩增引物及半定量表达分析引物 ；同时根
据 18S rRNA（GenBank 登 录 号 AY823528） 设 计 内
参引物进行基因表达的半定量分析。实验中用到的
引物序列，见表 1。
表 1 实验中用到的引物
引物名称 引物序列（5-3）
JcGA20ox 全长 cDNA 扩增引物 F ：TGTAAAGCAGTTATGGCA
R ：TTTGAACAAGATTCCCGT
JcGA20ox 半定量表达分析引物 F ：TTAGCAACGCCTCTGTCC
R ：GAATCGCTCTTCTCATCG
18S rRNA 内参引物 F ：AGAAACGGCTACCACATC
R ：CCAAGGTCCAACTACGAG
1.2.3 总 RNA 的提取及 cDNA 第一链的合成 利用
TransZol Up 试剂提取小桐子对照与 12℃低温锻炼
12、24 和 48 h 的根、茎及叶片的总 RNA，并利用
DNase I 消化 RNA 中的残余基因组 DNA，得到纯化
的总 RNA。分别取 3 μg 总 RNA，以 Anchored Oligo
（dT）18 为 逆 转 录 引 物， 利 用 TransScript Two-Step
RT-PCR SuperMix 合成第一链 cDNA。
1.2.4 小桐子 JcGA20ox 基因全长 cDNA 的克隆
以小桐子 12℃低温锻炼 24 h 根提取总 RNA 并反转
录的 cDNA 为模板，使用热启动双封闭 DNA 聚合酶
TransStart Taq DNA Polymerase 进行 PCR 扩增，扩增
条件为 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，51.6℃ 30 s，72℃
1.5 min，35 个循环 ；72℃ 20 min。扩增完成后用 1%
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10142
的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，利用 EasyPure
Quick Gel Extraction Kit 从 琼 脂 糖 凝 胶 回 收 目 的 基
因条带（1 307 bp）。将目的基因片段与克隆载体
pEASY-T1 连接，转化大肠杆菌 Trans1-T1 感受态细
胞，涂布 LB 抗性平板（LB-Amp ＋＋ IPTG ＋ X-gal），
过夜生长，进行蓝白斑筛选。菌落 PCR 验证的阳性
克隆，取名为 pEASY-T1-JcGA20ox，送深圳华大基
因公司利用 pEASY-T1 质粒上的 M13F 与 M13R 通用
引物进行双向测序。
1.2.5 小桐子 JcGA20ox 基因的生物信息学分析 利
用 Spidey 软件进行克隆 cDNA 序列与基因组序列
（ 小 桐 子 基 因 组 数 据 库 http ：//www.kazusa.or.jp/
jatropha/）比对以确定基因的内含子与外显子结构。
利用 BioEdit 软件将克隆 cDNA 序列翻译成氨基酸序
列，利用在线工具 ProtParam 计算蛋白质的理论分
子量、等电点等基本参数。利用 SignalP3.0 Server 分
析蛋白质信号肽序列，接着利用在线工具 TMHMM
与 Proscale 检测其跨膜结构与亲水 / 疏水特性。利
用 Prosite 与 NCBI CDD 工具进行结构域与功能元件
的鉴定。从 NCBI 下载其它物种的 GA20ox 氨基酸
序列，利用 ClustalX 进行序列相似性比对，然后用
MEGA4.0 软件通过邻接法构建系统进化树，并采用
泊松法进行检验。利用 Phyre2 进行蛋白质三维结构
的同源建模，利用 VMD 软件显示其三维空间结构，
并结合 Ramachandram 图验证其准确性。
1.2.6 半 定 量 RT-PCR 表 达 分 析 利 用 1.2.3 中 制
备的各组织及低温锻炼条件下的 cDNA 为模板，以
18S rRNA 为 内 参， 进 行 JcGA20ox 的 RT-PCR 扩
增。18S rRNA 的扩增条件为 ：94℃ 5 min ；94℃ 30
s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，26 个循环 ；72℃ 10 min。
JcGA20ox 的 扩 增 条 件 为 ：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，
51℃ 30 s，72℃ 1 min，28 个循环 ；72℃ 10 min。反
应完毕后取 5 μL 进行 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测。
以 18S rRNA 为内参进行 JcGA20ox 基因表达差异性
的分析。
2 结果
2.1 小桐子JcGA20ox基因全长cDNA的克隆
以小桐子 12℃低温锻炼 24 h 的根提取总 RNA，
并反转录 cDNA 为模板，利用全长扩增引物，扩增
JcGA20ox 基因的全长 cDNA。结果表明，扩增得到
的产物约 1.3 kb（图 1-A），与预期大小一致。将目
的条带切胶回收后与 T/A 克隆载体 pEASY-T1 连接，
转化大肠杆菌，菌落 PCR 验证阳性克隆（图 1-B），
对阳性克隆提取重组质粒 pEASY-T1-JcGA20ox（图
1-C）。
8000
bp
M
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
10000
bp
M
5000
3000
2000
1500
800
500
300
bp
A CB M
5000
3000
2000
1000
750
500
250
A ：PCR 扩增 ；B ：菌落 PCR ；C ：重组质粒 pEASY-T1-JcGA20ox
图 1 小桐子 JcGA20ox 基因的 cDNA 克隆
2.2 小桐子JcGA20ox基因的生物信息学分析
经过测序，克隆的 JcGA20ox 基因 cDNA 序列全
长 1 307 bp，包含完整开放阅读框（1 131 bp），编
码 376 个氨基酸（aa），结果如图 2 所示。将其编码
区序列与对应基因组序列（Jcr4S02347 的 34 254-35
595 位，1 342 bp）进行比对，发现 JcGA20ox 基因包
含 3 个外显子与 2 个内含子。其推导蛋白质的理论
分子量为 43 kD，等电点为 6.7，单体属于稳定蛋白。
2015,31(10) 143王海波等：小桐子赤霉素 20 氧化酶的基因克隆及低温下表达分析
氨基酸组成以非极性氨基酸为主，其中 Leu、Ile、
Val、Ala 共占 23.4%。二级结构显示，该蛋白质富含
α-螺 旋（134 aa）， 占 35.64%， 主 要 分 布 于 70-110
位、160-210 位及 C 末端的 340-370 位 ；β-折叠（73
aa）占 19.41% ；β-转角（28 aa）占 7.45% ；无规则
卷曲（141 aa）占 37.50%。存在 1 个明显的跨膜区域，
位于 189-208 位，这与二级结构中 α-螺旋富集区相
吻合。SignalP 分析发现该蛋白质在 N 端没有信号肽。
1
91
181
271
361
451
541
631
721
811
901
991
1081
1171
1261
起始（ATG）与终止（TAA）密码子用下划线标注
图 2 小桐子 JcGA20ox 基因的 cDNA 与推导的氨基酸序列
GA20ox 蛋白质属于 2-ODD（2-oxoglutarte depen-
dent dioxygenase）家族。目前研究表明，2-ODD 家
族成员在核酸甚至氨基酸序列上的保守性较低，约
为 19%-75%，如该家族的赤霉素合成酶的氨基酸序
列在不同物种间保守性仅为 50%-60%。应用 NCBI
中的 BlastP 工具对不同物种的 GA20ox 氨基酸序列
进行同源性比对分析，并利用 GeneDOC 软件生成比
对图（图 3-A），发现 GA20ox 蛋白的 N 端与 C 端的
氨基酸差异性变化都较大，在不同物种之间没有相
似性，而在中间部位 100-170、210-320 位之间的
序列较为保守，其中 100-170 位主要构成 α-螺旋，
210-320 区间的氨基酸序列则构成多段 β-折叠。
通过 Prosite 服务器功能结构域分析发现，该小
桐子 Ga20ox 蛋白质在 218-318 位存在 1 个依赖 Fe2+
与 2-酮戊二酸双加氧酶结构域（Fe2+ 2-oxoglutarate
dioxygenase，Fe2OG_OXY 或 2GO-FeII_Oxy），Fe2+
结合位点位于该功能域的 His243、Asp245、His299 位，
而 Arg309 位则为 2-酮戊二酸的主要结合部位，属于
典型的 2-ODD 家族蛋白质。另外，在 N 端还发现了
1 个非血红素双加氧酶结构域，该结构域是催化吗
啡合成中的核心结构域（DIOX_N），同样依赖 Fe2+
与 2-酮戊二酸（图 3-B）。
下 载 不 同 植 物 的 GA20ox 氨 基 酸 序 列， 利 用
MEGA4.0 软 件 通 过 邻 近 法 与 我 们 得 到 的 小 桐 子
GA20ox 构建系统进化树。结果（图 4）显示，小桐
子 GA20ox 与同科的蓖麻最先聚类，在进化上亲缘关
系最近，接着与杨柳科的大叶杨与小叶杨聚合，而
与豆科的蒺藜苜蓿亲缘关系最远。另外，进化树显
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10144
1
ᤏই㣕1˖ᤏই㣕2˖㩍ঌ1˖
ᤏই㣕3˖㫪㰌㤌㬯˖⮚㤴˖䗓ὂ˖⅗ⲭ㤡˖⮚㤴1˖⮚㤴2˖⮚㤴3˖傜䫳㯟˖䉼䉶˖
ᶯṇ˖བྷਦᶘ˖ሿਦᶘ˖ሿẀᆀ˖㬆哫˖✏㥹˖㖾㣡✏㥹˖
˖377˖378˖381
˖380˖382˖364˖375˖376˖378˖372˖379˖384˖380
˖379˖385˖385˖376˖378˖379˖379
ᤏই㣕1˖ᤏই㣕2˖㩍ঌ1˖
ᤏই㣕3˖㫪㰌㤌㬯˖⮚㤴˖䗓ὂ˖⅗ⲭ㤡˖⮚㤴1˖⮚㤴2˖⮚㤴3˖傜䫳㯟˖䉼䉶˖
ᶯṇ˖བྷਦᶘ˖ሿਦᶘ˖ሿẀᆀ˖㬆哫˖✏㥹˖㖾㣡✏㥹˖
˖362˖360˖365
˖363˖366˖349˖357˖357˖357˖354˖363˖368˖364
˖363˖368˖368˖358˖363˖361˖361
ᤏই㣕1˖ᤏই㣕2˖㩍ঌ1˖
ᤏই㣕3˖㫪㰌㤌㬯˖⮚㤴˖䗓ὂ˖⅗ⲭ㤡˖⮚㤴1˖⮚㤴2˖⮚㤴3˖傜䫳㯟˖䉼䉶˖
ᶯṇ˖བྷਦᶘ˖ሿਦᶘ˖ሿẀᆀ˖㬆哫˖✏㥹˖㖾㣡✏㥹˖
˖270˖268˖273
˖269˖274˖257˖265˖265˖265˖262˖271˖276˖272
˖271˖276˖276˖266˖271˖269˖269
ᤏই㣕1˖ᤏই㣕2˖㩍ঌ1˖
ᤏই㣕3˖㫪㰌㤌㬯˖⮚㤴˖䗓ὂ˖⅗ⲭ㤡˖⮚㤴1˖⮚㤴2˖⮚㤴3˖傜䫳㯟˖䉼䉶˖
ᶯṇ˖བྷਦᶘ˖ሿਦᶘ˖ሿẀᆀ˖㬆哫˖✏㥹˖㖾㣡✏㥹˖
˖176˖174˖177
˖175˖180˖163˖171˖171˖171˖168˖177˖182˖178
˖177˖182˖182˖172˖177˖175˖175
ᤏই㣕1˖ᤏই㣕2˖㩍ঌ1˖
ᤏই㣕3˖㫪㰌㤌㬯˖⮚㤴˖䗓ὂ˖⅗ⲭ㤡˖⮚㤴1˖⮚㤴2˖⮚㤴3˖傜䫳㯟˖䉼䉶˖
ᶯṇ˖བྷਦᶘ˖ሿਦᶘ˖ሿẀᆀ˖㬆哫˖✏㥹˖㖾㣡✏㥹˖
˖83˖81˖86
˖81˖87˖69˖78˖78˖78˖75˖84˖89˖85
˖84˖89˖89˖79˖84˖82˖82
50 100
DIOX_N
DIOX_N Superfamily
2OG-FeII_Oxy
2OG-FeII_Oxy Superfamily
150 200 250 300
A
B 350 376
20 40 60 80
100 120 140 160 180
200 220 240 260 280
300
380

320 340 360
A ：多重序列比对（实线表示依赖 Fe2+ 与 2- 酮戊二酸双加氧酶结构域，虚线表示非血红素双加氧酶结构域，◆表示 Fe2+ 结合位点，* 表示 2- 酮戊
二酸结合位点）；B ：NCBI 推测的保守结构域
图 3 小桐子 JcGA20ox 推导氨基酸序列与其它植物 GA20ox 的多重序列比对（A）及保守结构域预测（B）
2015,31(10) 145王海波等：小桐子赤霉素 20 氧化酶的基因克隆及低温下表达分析
99
99
99
99
0.05
100
57
95
78
71
73 83
88 77
100
100
100
91
NP_001234070.1⮚㤴ˈSolanum lycopersicum
CAB82616.1⅗ⲭ㤡ˈSolanum dulcamara
ADZ96940.1䗓ὂˈCapsicum annuum
AAM12870.1㖾㣡✏㥹ˈNicotiana sylvestris
BAA32156.1✏㥹ˈNicotiana tabacum
NP_001234628.1⮚㤴ˈSolanum lycopersicum
NP_001234579.1⮚㤴ˈSolanum lycopersicum
ACC97203.1⮚㤴ˈSolanum lycopersicum
AED91121.1ᤏই㣕ˈArabidopsis thaliana
AED96129.1ᤏই㣕ˈArabidopsis thaliana
AED85055.1ᤏই㣕ˈArabidopsis thaliana
BAM73279.1㩍ঌˈRaphanus sativus
AES72892.1㫪㰌㤌㬯ˈMedicago truncatula
AAT40506.1傜䫳㯟ˈSolanum demissum
AAC49721.1䉼䉶ˈPisum sativum
AEW67997.1ᶯ㋏ˈCastanea millssima
EEF51475.1㬆哫ˈRicinus communis
KJ670150.1ሿẀᆀˈJatropha curcas
ACQ91097.1ሿਦᶘˈPopulus simonii
AFS33166.1བྷਦᶘˈPopulus tomentosa
图 4 通过 ClustalW 序列比对 MEGA4.0 邻接法构建的 GA20ox 系统进化树
示同属番茄 GA20ox 家族的不同 GA20ox，被聚类在
不同的亲缘关系簇中，尤其是 GA20ox1 和 GA20ox4
与其它两种 GA20ox 亲缘关系较远，说明 GA20ox 家
族中的不同成员可能有不同的功能侧重，推测其基
因表达调控方式也是不同的。
通过同源建模得到的三维结构显示，小桐子
GA20ox 蛋白质具有典型的 2-ODD 蛋白结构模型，
表现出结构的层次性，由 8 条 β-折叠片层组成主体
平面位于蛋白质结构的中心位置，另外 4 条 β-折叠
片层构成第二平面，两平面平行组成一个中空结构
作为催化中心而存在 ；在主体平面的外围主要为 3
段长 α-螺旋与 3 段短 α-螺旋共同组成的平面维持结
构，保护中心主体平面结构的稳定 ；而第二平面的
外围主要由无规则卷曲构成 ；2-酮戊二酸的主要结
合部位 Arg309 位于主体平面上，组成催化中心的氨
基酸残基也主要位于主体平面上，而 Fe2+ 结合位点
His243、Asp245、His299（H-D-H）位于第二平面上（图
5-A）。另外，Ramachandram 能量图（图 5-B）显示，
该预测结构的 95.2% 的氨基酸残基处于能量稳定
区域，说明预测的小桐子 GA20ox 蛋白质三维结构
可信。
2.3 低温锻炼下不同组织中JcGA20ox基因的差异
表达分析
利用半定量 RT-PCR 方法分析了 JcGA20ox 基因
在小桐子不同组织及不同低温锻炼条件下的表达情
况。结果（图 6）表明，JcGA20ox 基因在本研究所
涉及的组织中都有表达，但表现出明显的组织特异
性。在茎中表达量较高，且存在明显的低温诱导特性：
随着低温锻炼时间的延长，在茎中的表达量逐渐升
高，在低温锻炼 48 h 后仍然表现出继续增加的趋势；
在根中其表达量随低温锻炼表现出先下调后上调再
恢复本底表达水平的变化模式 ；而在叶中其表达变
化模式与根中基本相同，但其表达量较根中低。
3 讨论
目前，在植物中研究清楚的 2-ODD 酶类包括
赤 霉 素 合 成 酶 类 如 GA2ox（Gibberellin 2 oxidase，
EC 1.14.11.13）、GA3ox（Gibberellin 3 oxidase，
EC1.14.11.15），黄酮类合成代谢过程中限速酶类如
黄烷酮羟化酶（Flavanone 3-hydroxylase，F3H）、花
青 素 合 成 酶（Anthocyanidin synthesis，ANS）、 白
花 色 素 双 加 氧 酶（Leucoanthocyanidin dioxygenase，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.10146
LDOX，EC1.14.11.19）、1-羧 基 氨 基 环 丙 烷 氧 化 酶
（1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidases，ACCO，
EC1.14.17.4）等。此类酶参与动物如脯氨酸羟化、
植物（乙烯、赤霉素、花色素苷、黄酮类化合物）
与微生物（抗生素盘尼西林、头孢菌素）的初生及
次生代谢物等的合成［14，15］。
另外，此类酶都包含依赖 Fe2+ 与 2-酮戊二酸
的双加氧酶结构域。2-ODD 酶在催化反应中都需
要 Fe2+ 与 2-酮戊二酸或抗坏血酸作为辅助因子，在
反应中氧分子的两个氧原子，一个进入底物，另
一 个 参 与 2-酮 戊 二 酸 脱 羧 反 应 生 成 琥 珀 酸 盐 和
CO2
［16，17］。Fe2+ 与 2-酮戊二酸依赖性双加氧酶结构
域在三维结构中，都包含由 β-折叠构成的双层 β-
桶结构（PDB ：2G19）［15］，类似于 cupin 亚家族的
保守结构域。保守的两个 His 和 Asp 残基（H-D-H
或 H-X，X 代表任意氨基酸）结合辅助金属离子
如 Fe2+，如本研究中小桐子 GA20ox 蛋白的 His243-
Asp245-His299 保守残基，而距 N-端更近的两个保守的
碱性氨基酸如 Arg 或 Lys（R-X-S，X 代表同上）直
接催化酸性底物的氧化反应。
在植物中，GA20ox 基因属于小基因家族。目
前， 在 拟 南 芥 中 有 5 个 GA20ox 基 因 被 分 离 出 来
（AtGA20ox1-AtGA20ox5）［18］，在水稻中发现有 4 个
GA20ox 基 因（OsGA20ox1-OsGA20ox4）， 且 存 在 于
不同的染色体上。而 GA20ox 基因在植物中也表现
出表达特异性，如 OsGA20ox1 在水稻的几乎所有
器 官 中 都 有 表 达，OsGA20ox2 仅 在 未 开 的 花 中 表
达，OsGA20ox3 则在所有器官中的表达量都极低，
OsGA20ox4 在叶与茎中表达较多，而在根中表达水
平较低［19］。刘文超等［20］克隆到丹参（Salviamiltio-
rrhiza bunge）的 GA20ox 同源基因 2-酮戊二酸依赖
性双加氧酶基因，表达分析显示，该基因在丹参各
器官都有表达，但表现出组织特异性，同时受茉莉
酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）、赤霉素 3（GA3）
的诱导表达，且分别在诱导表达的 8、4 及 12 h 达
到最高表达量。另外，GA20ox 基因的表达还受到植
物激素如吲哚乙酸、萘乙酸及脱落酸等的调控，拟
南芥幼苗经吲哚乙酸处理 AtGA20ox1 基因表达量
上 调 明 显［21］， 经 萘 乙 酸 处 理 24 h 后，AtGA20ox1
与 AtGA20ox2 基因表达水平均提高［22］，而经脱落
-180
-120
-60
0Ps
i
60
120
180
-180 -120 -60 0 60 120 180
Phi
C
y
N
His243 His
299
Asp245
Arg309
A
B
A ：三维结构卡通模型 ；B ：Ramachandram 能量图
图 5 小桐子 JcGA20ox 蛋白的三维空间结构
JcGA20ox
18S rRNA
Control 12 h
ṩ
24 h 48 h
JcGA20ox
18S rRNA
JcGA20ox
18S rRNA
Control 12 h
㤾
24 h 48 h
Control 12 h
ਦ
24 h 48 h
图 6 低温锻炼下不同组织中 JcGA20ox 基因的差异表达分析
2015,31(10) 147王海波等：小桐子赤霉素 20 氧化酶的基因克隆及低温下表达分析
酸 处 理 后 AtGA20ox 表 达 量 下 降［23］。 转 基 因 研 究
表明，GA20ox 过表达在不同植物中有不同的效应。
例如，卡里佐枳橙（Carrizo citrange）中过量表达
CcGA20ox1 后，转基因植株呈现出伸长的表型，其
体内赤霉素浓度增高［24］；而南瓜 GA20ox 基因在莴
苣（Lactuca sativa cv Vanguard）中过量表达则导致
有生物活性的 GAs（GA1 和 GA4）大大减少，莴苣
出现矮化表型［25］。此外，还有研究表明，GA20ox
基因的表达受到其它因子如 homeo-box 转录因子、
激素运转抑制子、光及低温的调控［26］，但其具体机
理还不甚了解。
4 结论
本研究克隆到小桐子 GA20ox 基因。序列分析表
明，其包含 1 131 bp 的开放阅读框，编码 376 个氨
基酸，分子量为 43 kD，理论等电点为 6.7。GA20ox
蛋白存在 1 个依赖 Fe2+ 与 2-酮戊二酸双加氧酶结构
域，属于 2-ODD 家族。半定量 RT-PCR 分析显示，
低温锻炼条件下，JcGA20ox 基因在本研究所涉及的
小桐子各组织中表达水平具有组织特异性，其中茎
中表达量较高，且受低温诱导表达最显著，而在叶
中表达量较茎与根低。
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（责任编辑 马鑫）