全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
收稿日期 : 2012-04-05
作者简介 : 姚攀 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 药效活性成分及其生物合成 ; E-mail: 357687652@qq.com
通讯作者 : 徐晖 , 女 , 研究员 , 研究方向 : 药效活性成分及其生物合成 ; E-mail: zyfxsherry@gzhtcm.edu.cn
萜类成分广泛存在于植物、真菌等生物体中，
既包括了固醇、胡萝卜素等初级代谢产物，又包括
了成千上万结构各异的次级代谢产物。萜类合酶是
萜类成分生物合成的关键酶，萜类成分结构的丰富
性与萜类合酶家族成员的多样性密不可分。自 1992
年开始有植物萜类合酶基因克隆的报道，迄今为止，
已有超过 200 种的植物萜类合酶的 cDNA 被克隆，
穿心莲 ent-柯巴基焦磷酸合酶基因的克隆与
生物信息学分析
姚攀1，2 陈慧芝1，2 李竹君1，2 何瑞1，2 杨锦芬1，2 徐晖1，2
（1 广州中医药大学 中药资源科学与工程研究中心，广州 510006 ；2 岭南中药资源教育部重点实验室 广州中医药大学，广州 510006）
摘 要： 旨在克隆穿心莲 CPS的编码基因，并进行序列分析。通过 RT-PCR和 cDNA末端快速扩增的技术从穿心莲叶片中
获得目的基因；并利用生物信息学的方法对其编码蛋白进行功能分析。结果显示，获得了全长 2 499 bp的 cDNA序列，编码一个
833 aa的蛋白。序列同源性比较表明，该蛋白与野甘草、咖啡等其他植物来源的 CPS具有较高的同源性。保守功能结构域分析显示，
该蛋白包含一个富含 Asp残基的植物萜类合酶的共有保守功能域“DXDD”，归属于萜类生物合成酶 I类超级家族和顺式聚异戊二
烯焦磷酸合酶超级家族。初步推测克隆得到了穿心莲 CPS的编码基因（命名为 ApCPS，GenBank登录号为 JN216843.1）。
关键词： 穿心莲 穿心莲内酯 ent-焦磷酸古巴酯合成酶（CPS） 基因克隆
Cloning and Bioinformatic Analysis of a cDNA Encoding a Putative ent-
Copalyl Diphosphate Synthase from Andrographis
paniculata （Burm. f.） Nees
Yao Pan1，2 Chen Huizhi1，2 Li Zhujun1，2 He Rui1，2 Yang Jinfen1，2 Xu Hui1，2
（1Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510006；2Key Laboratory
of Chinese Medicine Resource from Lingnan （Guangzhou University of Chinese Medicine），Ministry of Education，Guangzhou 510006）
Abstract: The aim of this study is to clone the cDNA encoding CPS from Andrographis paniculata （Burm. f.） Nees and analyze its
function. RT-PCR combined with RACE-PCR was used to clone the CPS gene from the leaves of A. paniculta. Bioinformatic analysis was used to
identify the gene. Results showed that a cDNA with the length of 2 499 bp encoding 833 amino acids was cloned. Homologous analysis showed
that the deduced protein has extensive sequence similarities to CPS from other plants, such as Scoparia dulcis, Caffea arabica. The result of
CD-search （Conserved Domain Database） indicated that the deduced protein contains a conserved Asp-rich motif “DXDD” of plant terpene
synthases and belongs to isoprenoid biosynthsis Class I superfamily and trans-isoprenyl diphosphate synthases. A putative CPS gene from A.
paniculata （designated as ApCPS, GenBank accession number JN216843） was successfully cloned.
Key words: Andrographis paniculata Andrographolides ent-copalyl diphosphate synthase （CPS） Gene cloning
包括烟草、薄荷、番茄、丹参等多种植物的单萜合
酶、倍半萜合酶、二萜合酶［1-6］。有趣的是，目前
的相关研究显示，各种萜类合酶基因可能都是由一
个双功能的编码贝克杉烯合酶的祖先基因（CPS/KS
gene） 演变而来［7］。贝克杉烯合酶含有两个活性位点，
其中位于 N 端的活性结构域带保守功能域“DXDD”，
位于 C 端的活性结构域带保守功能域“DDXXD”，
2012年第10期 157姚攀等 ：穿心莲 ent-柯巴基焦磷酸合酶基因的克隆与生物信息学分析
通过基因复制、功能丢失以及功能更新，形成了各
种单功能或双功能的萜类合酶［7，8］。
穿心莲内酯类成分（Andrographolides）是常用
大宗中药材穿心莲［Andrographis paniculata （Burm.
f.） Nees］的主要药效活性成分，是一类由十氢萘
环合而成的对映半日花烷型（ent-labdane）二萜内
酯［9，10］。焦磷酸香叶基香叶酯（GGPP）环合形成
ent-焦磷酸古巴酯（ent-CPP）是穿心莲内酯生物合
成的关键步骤，决定了穿心莲内酯的母核结构，而
催化这个环合反应的二萜合酶——ent-柯巴基焦磷酸
合酶（ent-copalyl diphosphate synthase，简称 CPS），
是影响穿心莲内酯生物合成的关键限速酶（图 1）。
Maison 等［11］ 在对穿心莲（Andrographis paniculata
Wall. ex Nees）的遗传多样性研究中发现了一个 CPS
基因片段（GenBank 登录号 ：AJ973129.1）。使用
Blastx 对该基因片段进行比对，发现该基因与野甘
草、蓖麻、葡萄等多种植物的 CPS 基因具有较高同
源性。
本研究根据已经公开的穿心莲 CPS 部分基因序
列及其同源基因序列，采用简并引物逆转录 -聚合酶
链式反应（RT-PCR）与 cDNA 末端快速扩增（RACE）
相结合的方法，克隆穿心莲 CPS 基因的 cDNA
序列，并进行功能分析，旨在为深入研究该基因与
穿心莲内酯类成分生物合成的相关性奠定基础。
GGPP. geranylgeranyl diphosphate; ent-CPP. ent-copalyl diphosphate
图 1 穿心莲内酯类成分结构图和 CPS催化环合反应
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 穿心莲植物采自广州中医药大
学“华南药用植物资源库”迁地保护区，经广州
中医药大学詹若挺研究员鉴定为爵床科植物穿心
莲［Andrographis paniculata （Burm. f.） Nees］。于 11、
12 月期间收集穿心莲的新鲜嫩叶，每次取 0.1 g 用
于穿心莲叶总 RNA 的提取。
1.1.2 试剂 RNAisoTM Plus（总 RNA 提取试剂）、
RNAisoTM - mate for Plant Tissue （植物总 RNA 提取
辅助剂）、PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、
Taq DNA 聚合酶、Ex Taq Hot Start DNA 聚合酶、Pri-
meSTAR® HS DNA Polymerase、dNTPs、3-Full RACE
Core Set Ver.2.0、Agarose Gel DNA Purification Kit、
pMD19-T Vector 克隆载体，限制性内切酶均购自大
连宝生物公司 ；iScript cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad，
美 国 ）；Power Taq DNA polymerase、2×Power Taq
Plus PCR MasterMix（百泰克，北京）；Advantage®
2 PCR Enzyme Systemd、SMARTerTM RACE cDNA
Amplifcation Kit（Clontech，美国）；pGEX-4T-3 表达
载体（GE，美国）；引物由上海生工生物技术服务
有限公司和北京六合华大基因科技股份有限公司合
成 ；测序由北京六合华大基因科技股份有限公司和
上海英潍捷基 Invitrogen 公司完成 ；大肠杆菌 E. coli
DH5α 菌株（本实验室保存）。
1.2 方法
1.2.1 穿心莲 CPS 基因核心片段的扩增 将 Gen-
Bank 中穿心莲 CPS 基因的部分序列（登录号 ：
AJ973129.1）以及其他已知 CPS 基因序列进行比对，
用 GeneFisher 和 CODEHOP v1.0 设计一对简并引物
apCPS_deF1 和 apCPS_R1（表 1）。称取 0.1 g 穿心莲
新鲜嫩叶在液氮中研磨，按照植物总 RNA 提取试剂
盒说明书进行穿心莲总 RNA 的提取，并通过 1% 的
琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的质量［12］。以总 RNA
为模板，使用 iScript cDNA Synthesis Kit 进行反转录
得到 cDNA。以 cDNA 为模板，用引物 apCPS_deF1
和 apCPS_R1 进行 PCR 扩增。PCR 反应程序 ：94℃
2 min；94℃ 30 s，53.7℃ 30 s，72℃ 50 s，36 个循环；
72℃ 5 min。对扩增产物回收后进行序列测定。并在
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期158
NCBI 上用 BLASTn 对测序结果进行比对，确定其是
否为 ApCPS 基因片段。
1.2.2 穿心莲 CPS 基因 3端及 5端的克隆
1.2.2.1 RACE 引物的设计 根据 1.2.1 项获得的
核心片段和 RACE 试剂盒的引物设计要求，设计
3RACE的序列特异性引物：1st PCR的 apCPS 3GSP1
和 2nd PCR 的 apCPS 3GSP2 ；5RACE 的序列特异
性引物 ：apCPS 5GSP1（表 1）。
1.2.2.2 3端及 5端的克隆与全长序列的拼接 3-
RACE ：以穿心莲总 RNA 为模板，使用 PrimeScript
1st Strand cDNA Synthesis Kit 进行反转录，再利用
3-Full RACE Core Set Ver.2.0，以引物对 Outer Primer
和 apCPS 3GSP1，Inner Primer 和 apCPS 3GSP2 进
行嵌套 PCR 反应，退火温度为 56℃。5-RACE ：以
穿心莲总 RNA 为模板，5-CDS Primer 和 SMARTer
II A Oligonucleotide 为引物，用 SMARTerTM RACE Kit
进行反转录，再以试剂盒中的 UPM 和 apCPS 5GSP1
进行 PCR 扩增，退火温度为 59℃。回收目的 DNA，
连接到 pMD19-T 克隆载体上，并进行测序。使用
DNAMAN 5.2.9 Demo version 软件将获得 3-末端和
5-末端与核心片段序列拼接，得到 cDNA 全长序列。
1.2.3 穿心莲 CPS 编码区的克隆 根据拼接获得的
cDNA 全长序列中的编码区设计引物 apCPS sense 和
apCPS antisense（表 2），以 cDNA 为模板，用 Prime-
STARTM HS DNA Polymerase 进行 PCR，扩增编码区
全长。PCR 产物胶回收纯化，用 BamH Ⅰ和 SmaⅠ
对进行双酶切，酶切产物纯化后连接到 pGEX-
4T-3 载体上。筛选阳性克隆测序，检验编码区完
整性。
1.2.4 生物信息学分析 用 DNAsis for Windows Ver
2.1 软件对基因的开放阅读框进行分析，翻译得到
氨基酸序列。用 GenBank 中的 Blastp 对所得到的氨
基酸序列进行同源分析。用 iPSORT 运算法则对蛋
白进行亚细胞定位预测，SignalP 3.0 Server 对氨基酸
序列进行信号肽在线预测分析，用 TMHMM Server
v. 2.0 对氨基酸序列进行跨膜结构域预测分析。利
用 GenBank 中的 Blastp 对氨基酸序列进行同源分析，
利用保守功能域数据库（conserved domain database，
CDD）进行蛋白保守功能域的在线预测［13］。用
DNAMAN 5.2.9 进行多重序列对比及系统进化分析。
登陆 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BankIt/，向 GenBank
提交 cDNA 序列。
2 结果
2.1 穿心莲叶总RNA提取结果
从穿心莲新鲜嫩叶中提取总 RNA，电泳结果（图
2）显示，得到了较完整的 RNA，28S 和 18S rRNA
条带清晰，无 DNA 污染，可用于反转录。
2.2 穿心莲CPS基因核心片段克隆结果及序列分析
使用核心片段扩增引物 apCPS_deF1 和 apCPS_
R1 进行 RT-PCR，获得约为 420 bp 的目的片段（图
3）。取 PCR 产物送样测序，得到 373 bp 的序列。使
用 Blastn 对该序列进行分析，与穿心莲 CPS 基因片
段序列（登录号 ：AJ973129.1）一致性大于 98%。
表 1 穿心莲 CPS基因克隆所用的特异引物
引物 序列（5-3）
apCPS_deF1 CCTWTTCRGCYCACGA
apCPS_R1 CAAAGGCAGTGGAGGA
apCPS 3GSP1 GCACCAGGACAAAACTGATAAAG
apCPS 3GSP2 CACTGCCATCCCTTATTGAAACAGC
apCPS 5GSP1 GGAGGATGGAGAAAAGAGAAATGAGCCG
简并引物代码 ：W=A，T ；R=A，G ；Y=C，T
表 2 扩增 ApCPS基因编码区所用引物
引物 序列（5-3）
apCPS sense TCGTGGATCCATGCCTTTGTTTTCCCTCCTC
apCPS antisense TTTTCCCGGGATCAGAAGTAACGGCGGGTA
划直线部分为起始密码子，点式下划线为终止密码子，波浪线部分分别为
BamH Ⅰ和 Sma Ⅰ酶切位点，斜体加粗部分为所替换的碱基
2.3 穿心莲CPS基因3端及5端的克隆结果及分析
3-RACE 克隆得到约 1 900 bp 的片段（图 4-a），
测序得到含 poly（A）的 3端序列，使用 GenBank
数据库中 Blastx 进行同源基因分析，结果表明，该
序列与野甘草的 CPS 3端序列有较高的一致性
（68%）。5-RACE 克隆得到约 950 bp 的片段（图
4-b），测序得到 960 bp，使用 GenBank 数据库中
Blastx 进行同源基因分析，结果表明，该序列与野
甘草的 CPS 5端序列有较高的一致性（57%）。
2.4 穿心莲CPS基因全长cDNA的拼接及其编码区
克隆与分析
将克隆得到的 5端序列、核心片段序列与 3
2012年第10期 159姚攀等 ：穿心莲 ent-柯巴基焦磷酸合酶基因的克隆与生物信息学分析
端序列进行拼接，获得了全长 cDNA 序列，共 2 645
bp，包含5端的非编码区、2 499 bp的开放阅读框和3
端的非编码区（包含 polyA），命名为“ApCPS-2645”。
开放阅读框编码 832 个氨基酸。
ApCPS-2631 与拼接全长序列 ApCPS-2645 进行比对，
结果表明两条序列一致性为 97%，在开放阅读框架
内有两个碱基不同。
M. DL2000 DNA Ladder Marker ；1. 穿心莲叶片总 RNA
图 2 穿心莲叶片总 RNA电泳图
使用引物 apCPS sense 和 apCPS antisense 扩增得
到的编码区片段（图 4-c）经过酶切后连接到 pGEX-
4T-3 载体上，筛选阳性重组子，测序得到 2 631 bp
的序列，命名为“ApCPS-2631”。使用 ClustalW 将
M. DL2000 DNA Ladder Marker ；1. 核心片段 PCR 产物（长度约为 420 bp）
图 3 穿心莲 CPS基因核心片段 PCR扩增产物电泳图
M. DL2000 DNA Ladder Marker ；1. CPS 基因 3端扩增产物 ；2. CPS 基因 5
端扩增产物 ；3. CPS 基因编码区扩增产物 ；M1. 200 bp DNA Ladder Marker
图 4 穿心莲 CPS基因 3端（a）、5端（b）以
及编码区（c）的扩增电泳图
70%-77%。
进一步使用 DNAMAN 构建系统进化树进行亲
缘关系分析，结果（图 6）显示，该编码蛋白与野
甘草（S. dulcis）CPS 蛋白的亲缘关系最近。
将克隆获得的编码蛋白与 5 种植物（野甘草、
毛果杨、向日葵、豌豆和拟南芥）的 CPS 多重氨
基酸序列对比（图 6）显示，从第 100 位氨基酸以
后，该蛋白序列中存在较多的保守区域，其中包括
第 715-717 位之间的富含 Asp 残基的植物萜类合酶
的共有保守功能域“DXDD”（图 7 黑框部分）。
CDD 搜索发现，该编码蛋白的保守功能域主要
为第 40 位氨基酸和第 800 位氨基酸之间的 CPS 保守
区域（PLN02592），其中包括了若干个底物结合区域、
一个底物 -Mg2+ 结合区域、一个天冬氨酸富含区域、
其他萜类环化或合成区域。基于与已知蛋白活性位
图 5 ApCPS跨膜结构域预测
使用 DNAsis 对“ApCPS-2631”中编码区 2 499
bp 进行分析，翻译得到一个全长为 832 aa 的蛋白，
分子量约为 95.371 kD。亚细胞定位预测该蛋白 N 端
包括一个 30 aa 的叶绿体转运肽。信号肽在线预测结
果显示，信号肽可能区域位于 N 端 45 位氨基酸之
前的序列。跨膜结构域在线预测结果显示，不具跨
膜结构域，整个多肽链位于膜外（图 5）。
2.5 穿心莲CPS基因全长序列的生物信息学分析
将 ApCPS-2631 中编码区翻译得到的蛋白用
Blastp 进行比对。结果（表 3）表明，该蛋白与多
种植物来源的 CPS 具有较高的同源性，相似性介于
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期160
点的序列相似性，该蛋白归属于萜类生物合成酶 I
类超级家族和顺式聚异戊二烯焦磷酸合酶超级家族
（图 8）。
预测显示该基因编码蛋白带 N 端信号肽，定位于叶
绿体，行使催化功能，这与植物二萜合酶定位于质
体中是一致的［7］。同源性比较证明，其与多种植物
CPS 具有较高的同源性。综合上述生物信息学分析
结果，推断克隆得到的 DNA 片段是一个单功能 CPS
的编码基因，命名为 ApCPS，将编码区序列提交到
GenBank，获得序列登录号 JN216843.1。
在研究过程中还发现，拼接的全长序列与直接
克隆的 cDNA 序列在编码区内不完全一致，存在两
个碱基的差异，从而导致在氨基酸 C 端有 2 个氨基
酸的不同，其可能原因是 DNA 聚合酶在扩增过程中
存在错误，因此以高保真酶扩增的全长 cDNA 片段
测序结果（“ApCPS-2631”）为最后结果。此外，在
RT-PCR 反应中存在较多的非目的条带，分析其原因
可能是该基因在穿心莲中存在同源基因。已有文献
报道在多种植物中找到多个 CPS 基因［14］，如日本粳
稻全基因组中存在 4 个 CPS 基因，其中 OsCPS1 与
植物激素赤霉素合成相关，OsCPS2 参与了非赤霉素
类二萜的生物合成相关，OsCPSsyn 与 syn-半日花烷
型的二萜合成相关［15，16］。穿心莲中 CPS 同源基因
的存在情况如何，本研究克隆获得的 ApCPS 基因是
否参与了次生代谢物穿心莲内酯的合成，均有待于
更深入的分析和探讨。
萜类成分是一个庞大的天然产物家族，其生物
合成及代谢调控一直是科学研究的热点。萜类成分
也是中药发挥药效的主要物质基础之一，关于中药
表 3 穿心莲 CPS与其他植物 CPS蛋白同源性比较
编号 CPS 来源 科属 序列登录号 序列长度（aa） 一致性（%） 相似性（%）
1 咖啡 C. arabica 茜草科，咖啡属 ACQ99373.1 821 62 75
2 野甘草 S. dulcis 大戟科，野甘草属 BAD91286.1 825 64 77
3 毛果杨 P. trichocarpa-1 杨柳科，杨属 EEE81383.1 795 59 75
4 番茄 S. lycopersicum 茄科，番茄属 BAA84918.1 800 59 73
5 毛果杨 P. trichocarpa-2 杨柳科，杨属 EEE93773.1 807 58 73
6 向日葵 H. annuus 菊科，向日葵属 CBM82407.1 798 57 74
7 板栗 C. mollissima 壳斗科，栗属 AEF32082.1 807 56 71
8 莴苣 L. sativa 菊科，莴苣属 BAB12440.1 799 54 72
9 豌豆 P. sativum 豆科，豌豆属 AAB58822.1 801 54 70
10 甜菊 S. rebaudiana 菊科，甜叶菊属 AAB87091.1 787 54 72
11 笋瓜 C. maxima-1 葫芦科，南瓜属 AAD04292.1 823 54 71
12 笋瓜 C. maxima-2 葫芦科，南瓜属 BAC76429.1 822 54 71
13 近琴状巴豆 C. sublyratus 大戟科，巴豆属 BAA95612.1 829 55 72
14 拟南芥 A. thaliana 十字花科，拟南芥属 AEE82229.1 802 54 72
图 6 穿心莲 CPS与其他 14种植物 CPS蛋白的系统进化树
3 讨论
本研究利用同源克隆的方法从穿心莲叶片中克
隆得到了全长 2 499 bp 的 cDNA 片段，编码 832 aa。
氨基酸序列分析表明，在第 40-800 位氨基酸之间
为 CPS 的保守功能域，包含一个典型的植物萜类合
酶共有保守功能域“DXDD”，但不含另一个共有保
守功能域“DDXXD” ［7］。亚细胞定位及信号肽在线
2012年第10期 161姚攀等 ：穿心莲 ent-柯巴基焦磷酸合酶基因的克隆与生物信息学分析
中萜类成分生物合成方面的研究也日益深入［17-19］，
但目前尚未见对二萜类成分穿心莲内酯的生物合成
相关功能基因的研究报道。CPS 是穿心莲内酯生物
合成途径中起催化环合作用的关键酶，该基因的成
图 7 穿心莲 CPS与其他 5种植物 CPS蛋白多序列比对
2. 野甘草 ; 3. 毛果杨 ; 6. 向日葵 ; 10. 豌豆 ; 14. 拟南芥
图 8 蛋白保守区域预测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期162
功克隆为下一步进行 ApCPS 基因的表达和功能验证
打下了基础，并为阐明穿心莲中穿心莲内酯的生物
合成途径提供了重要的研究资料。
4 结论
本研究利用 RT-PCR 与 RACE 相结合的方法从
穿心莲叶片中克隆了 CPS 基因的 cDNA 片段，全长
2 499 bp，编码 832 aa，其编码蛋白产物归属于萜类
生物合成酶 I 类超级家族和顺式聚异戊二烯焦磷酸
合酶超级家族。
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（责任编辑 马鑫）