全 文 ：文章编号:1000-2375(2005)01-0074-04
RP-HPLC测定穿心莲 、路边青配伍药液中
脱水穿心莲内酯在小鼠血浆中的浓度
蔡文涛 ,韩凤梅
(湖北大学 生命科学学院 , 湖北 武汉 430062)
摘　要:建立一种简单 、快速的反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定穿心莲 、路边青配伍药液中脱水穿
心莲内酯在小鼠血浆中的浓度.使用 C18反相柱(4.0 mm×250 mm , 5 μm),流动相为甲醇-乙腈-水(13∶17∶
70),流速:1.0 mL·min-1 ,检测波长:252 nm.血药浓度在0.102～ 20.305mg·L-1(r =0.999 8)时线性关系良好;
低 、中 、高浓度下的回收率 、重现性均符合方法学要求.该方法能有效地监测小鼠血浆中脱水穿心莲内酯的浓
度变化.
关键词:反相高效液相色谱法;穿心莲 、路边青配伍药液;脱水穿心莲内酯;血药浓度的测定
中图分类号:R917　　文献标志码:A
收稿日期:2004-09-17
基金项目:湖北大学中药生物技术省重点实验室开放基金(040104)资助项目;湖北省青年杰出人才科学基金(2002AC004)资助项目
作者简介:蔡文涛(1980-　),女 ,硕士 ,助教 , Tel:(027)88663590
复方穿心莲片是临床上应用广泛的一种中成药.它是由穿心莲 600 g 、路边青1 400 g 组成 ,收录于中
华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第 19册 ,具有清热解毒 、凉血 、利湿的功能 ,主治风热感冒 ,
喉痹 , 痄腮 , 湿热泄泻等[ 1] .其中 , 穿心莲为配伍的君药 , 它是爵床科植物穿心莲 Andrographis
paniculata(Burm.f .)Nees的干燥地上部分 ,主要含有二萜内酯类化合物(总称为:穿心莲总内酯).穿心
莲总内酯是穿心莲的主要有效部位 ,其中以脱水穿心莲内酯(Dehydroandrographolide , 简记为 DAP)为最
强[ 2] ,为该药材主要质量控制指标之一[ 3] .此外 ,配伍的路边青为马鞭草科植物路边青 Clerodendron
cyrtophyllum Tucrz.的叶[ 4] ,含黄酮类及吲哚甙等 ,具有抗菌 、抗炎等作用.目前尚少见测定复方穿心莲
片或穿心莲 、路边青配伍药液中脱水穿心莲内酯在小鼠体内血药浓度的方法报道.本文建立了 RP-
HPLC法测定穿心莲 、路边青配伍药液(compatible preparation , 简记为CP)中脱水穿心莲内酯在小鼠血浆
中浓度的方法.该方法简便 、快速 、准确 ,能较好地应用于脱水穿心莲内酯血药浓度的测定.
1　实验材料
1.1　仪器　Agilent 1100型HPLC仪 ,DAD UV-Vis检测器 ,Agilent Chemstation数据处理系统(Agilent公
司);BFC2000氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司);SIGMA 2K15C台式高速离心机(Sigma 公司);
超低温冰箱(Jouan公司);WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);TGL-16C 高速台式离心机
(上海安亭科学仪器厂).
1.2　药品与试剂　甲醇(色谱纯 ,由美国Fisher公司出产),脱水穿心莲内酯对照品(购于中国药品生物
制品鉴定所),脱水穿心莲内酯甲醇贮备液(0.407mg·mL-1),重蒸水(0.45μm滤膜滤过),其他试剂均为
分析纯.
1.3　实验动物　SPF 级昆明小鼠(KM):雌雄兼有 ,25 ～ 30 g ,购于湖北省实验动物研究中心 ,合格证号:
SCXK(鄂)2003-005.
第 27 卷 第 1期
2005 年 3 月
湖北大学学报(自然科学版)
Journal of Hubei University(Natural Science)
　Vol.27　No.1　
Mar., 2005
2　实验方法
2.1　色谱条件　色谱柱:Hypersil C18-ODS不锈钢柱(5μm ID ,4.0mm×250mm);流动相:甲醇-乙腈-
水(13∶17∶70);流速:1.0 mL·min-1;检测波长:252 nm.
2.2　系列标准品溶液的配制　 精密称取脱水穿心莲内酯对照品4.07mg 置于 10mL容量瓶中 ,甲醇定
容至刻度 ,即得 0.407 g·L-1标准品储备液.分别精密吸取脱水穿心莲内酯标准储备液 20 ,50 , 100 , 300 ,
500 ,1 000μL置于 10mL容量瓶中 ,甲醇定容 ,配制成浓度分别为 0.814 ,2.035 ,4.070 ,12.210 ,20.350 ,
40.700mg·L-1的系列标准品溶液.
2.3　灌胃药液的配制
2.3.1　浸膏及总内酯的含量的测定　穿心莲浸膏的提取参照药典的方法[ 3] ,100 g 穿心莲药材可提取
29.8 g 浸膏 ,浸膏中穿心莲总内酯的含量经紫外分光度法测得为 29.8 %;路边青浸膏的提取参照部颁
标准的方法[ 1] , 100 g 路边青药材可提取 21.1 g浸膏.
2.3.2　穿心莲 、路边青配伍药液的配制　混合穿心莲总内酯浸膏和路边青浸膏(按复方穿心莲片处方 ,并结
合药材提成浸膏的比例),加适量0.1mol·L-1醋酸缓冲液(pH=3.6)配制成浓度为0.511g·mL-1的悬浮液.
2.3.3　路边青药液制备　除不加穿心莲总内酯浸膏外 ,其余同 2.3.1 ,制得路边青药液.
2.4　血样的制备方法　 取小鼠血浆样品 0.4mL 置于 1.5mL 离心管中 ,依次加入 100μL甲醇 ,旋涡振
荡 10 s ,再加入 100μL 0.5mol·L-1 pH 3.6醋酸缓冲液 ,旋涡振荡20 s ,最后用乙酸乙酯萃取 3次 ,每次加
乙酸乙酯 0.5mL ,旋涡振荡 5min ,再 1.0×104 r·min-1离心 5min ,合并乙酸乙酯层 ,于 50 ℃氮气流下挥
干 ,残渣用 100μL流动相溶解 ,1.2×104 r·min-1离心 10min ,取上清液 15μL进样.
3　结　果
3.1　方法的专属性　在本色谱条件下 ,脱水穿心莲内酯的保留时间为 14.0±0.5min ,色谱峰分离良
好 ,无任何杂质峰干扰.实验结果见图 1.
图 1　小鼠血浆样的色谱图(峰 1:DAP)
a:空白血浆　b:外加 DAP标液的空白血浆　c:灌胃 CP后的血浆　d:灌胃路边青药液后的血浆
75第 1期 蔡文涛等:RP-HPLC 测定穿心莲 、路边青配伍药液中脱水穿心莲内酯在小鼠血浆中的浓度
3.2　线性关系 　取小鼠空白血浆 0.4mL ,分别加入 100μL脱水穿心莲内酯系列标准品溶液配制成不
同DAP 浓度的血浆样品 ,除不加 100μL甲醇外 ,其余按“血样的制备方法”项下操作 ,以脱水穿心莲内酯
峰面积(y)对其血药浓度(x)作图 ,得线性回归方程为:y =146.98x +12.292 , r =0.999 8(n =3),线
性范围:0.102 ～ 20.305mg·L-1 ,最低检测限为 0.050mg·L-1(S/ N >3).
3.3　精密度　配制含 DAP 0.204 , 3.052 ,10.175mg·L-13个浓度的血浆样品 ,按“血样的制备方法”项处
理 ,计算日内及日间精密度.结果见表 1.
表 1　方法的精密度(n=3 , x±s)
加入量/(mg·L-1) 日　内 日　间测得值/(mg·L-1) RSD / % 测得值/(mg·L-1) RSD / %
0.204 0.207±0.004 1.93 0.199±0.006 3.02
3.053 3.031±0.029 0.96 2.982±0.050 1.68
10.175 10.310±0.126 1.22 10.065±0.183 1.82
3.4　回收率
3.4.1　绝对回收率　配制含 DAP 0.204 ,3.053 ,10.175mg·L-13个浓度的血浆样品 ,按“血样的制备方
图 2　小鼠灌胃 CP 后 DAP在其体内的药时曲线
表 2　绝对回收率(n=5 , x ±s)
加入量/(mg·L-1) 回收率/ % RSD / %
0.204 82.30±3.00 3.64
3.053 84.10±1.00 1.19
10.175 85.70±3.10 3.62
表 3　相对回收率(n=5 , x ±s)
加入量/(mg·L-1) 回收率/ % RSD / %
0.204 105.10±4.50 4.28
3.053 99.40±1.10 1.11
10.175 102.30±3.70 3.62
法” 项处理 , 每个浓度各平行做 5 份.另各取 100 μL
0.814 ,12.210 ,40.700mg·L-1脱水穿心莲内酯标液于 1.5
mL 离心管中 ,各平行做 3份 , 50 ℃氮气挥干 ,残渣用 100
μL流动相溶解 ,1.2×104 r·min-1离心 10 min ,取上清液
15μL 进样.以相同浓度标液进样得到的 DAP 峰面积为
标准 ,用血浆样品中 DAP 的峰面积与之相比 ,结果计为
绝对回收率.结果见表 2.
3.4.2 　相对回收率 　配制含 DAP 0.204 , 3.053 ,
10.175mg·L-13个浓度的血浆样品 ,按“血样的制备方
法”处理 , 每个浓度各平行做5份 , 将所得峰面积值代入
回归方程计算浓度 , 所得浓度与实际浓度的比值即为相
对回收率.结果见表 3.
3.5　血样的测定　取昆明种小鼠 50只 ,雌雄兼有 ,随机
等量分为 5组 ,禁食 12 h ,全程不禁水.按 4.20 g·kg-1剂
量 ig CP(相当于 ig 6.81 g 穿心莲 、路边青混合浸膏·
kg-1 , 合 0.766 g 穿心莲总内酯·kg-1),于给药后不同时
间点摘眼球取血.测定不同时间的血药浓度 ,平均血药浓
度(n =5)-时间数据结果见图 2.血药浓度范围为0.59
～ 7.67mg·L-1.另取昆明种小鼠 5只 ,按 4.24 g 路边青
浸膏·kg-1剂量 ig 路边青药液 ,于给药后 20 min 摘眼球
取血.血样处理后经 HPLC 仪检测 ,所得色谱图作为方法
学专属性的依据之一.
4　讨　论
在血样预处理方法上曾比较了固相萃取与液液萃取 ,实验表明乙酸乙酯液液萃取的回收率及精密
度均高于固相萃取.对液液萃取方式的选择 ,曾比较过水平振荡与旋涡振荡(时间均为 5min)、及乙酸乙
酯不同萃取体积与次数等对回收率的影响 ,其中以旋涡振荡萃取 3次(每次乙酸乙酯用量均为 0.5mL)
回收率最好.
流动相曾选择甲醇-水 ,乙腈-水混合 ,经过不断摸索最终确定选用三元流动相:甲醇-乙腈-水
76 湖北大学学报(自然科学版) 第 27 卷
(13∶17∶70).在此条件下 ,脱水穿心莲内酯分离良好 , R >1.5 ,且不受内源性杂质峰的影响.采用二极
管阵列检测器在 190 ～ 950 nm的范围内对脱水穿心莲内酯峰进行全扫描 ,得到其吸收光谱图 ,确定 252
nm为检测波长 ,获得了较高的灵敏度.
由于穿心莲二萜内酯类成分在碱性条件下不稳定 ,在酸性条件下较稳定 ,但 pH<3.0时 ,其稳定性
反而不好[ 5] .为了调节体系酸碱度 ,使脱水穿心莲内酯处于稳定状态 ,实验中用 0.1mol·L-1 , pH=3.6
醋酸缓冲液溶解穿心莲片粉末并在萃取前加入 0.1mL 0.5mol·L-1 , pH=3.6醋酸缓冲液.
本文建立了穿心莲 、路边青配伍药液中脱水穿心莲内酯在小鼠血浆中浓度的 RP-HPLC测定方法.
该方法能较好地应用于脱水穿心莲内酯血药浓度的测定 ,可为药动学研究提供参考.
参考文献:
[ 1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准 中药成方制剂(第 19 册)[ M] .1994.115.
[ 2] 郑虎占 ,董泽宏 , 佘　靖.中药现代研究与应用(第四卷)[ M] .北京:学苑出版社 , 1998.3491 , 3493 , 3499～ 3505.
[ 3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2000年版一部)[ M] .北京:化学工业出版社 , 2000.221 , 541 ～ 542.
[ 4] 刘春安 ,彭明.抗癌中草药大词典[ M] .武汉:湖北科学技术出版社 , 1994.74 , 781.
[ 5] 于波涛 ,张志荣 , 刘文胜 ,等.穿心莲内酯体外稳定性研究[ J] .中成药 , 2002 , 24(5):332 ～ 333.
RP-HPLC determination of dehydroandrographolide in Andrographis
and Clerodendron compatible preparation in mice plasma
CAI Wen-tao ,HAN Feng-mei
(School of Life Science ,Hubei University ,Wuhan 430062 , China)
Abstract:To develop a simple and rapid reversed-phase high performance liquid chromatographic method for
the determination of dehydroandrographolide in Andrographis and Clerodendron compatible preparation in mice
plasma.The C18 reversed-phase column(4.0mm×250mm ,5μm)was used as analytical column;The mobile phase
consisted of methanol-acetonitrile-water(13∶17∶70)at a flow rate of 1.0mL·min-1;The detection wavelength
was 252 nm.The calibration curve in plasma was linear well over the range of 0.102 ～ 20.305 mg·L-1(r =
0.999 8);The recovery and reproducibility of low 、middle and high concentration are accord with methodological re-
quest.The method is proved suitable for monitoring the change of concentration of dehydroandrographolide in mice
plasma.
Key words:RP -HPLC;Andrographis and Clerodendron compatible preparation;dehydroandrographolide;
determination of plasma concentration
(责任编辑　游　俊)
(上接第 73页)
Molluscicidal effects of extracts of Alternanthera philoxeroides on Oncomelania hupensis
YANG Jian-ming , WANG Ping-yao ,XIAO Rui-fen ,WU Chun-hong
(School of Life Science , Hubei University , Wuhan 430062 , China)
Abstract:To understand the molluscicidal effects of water extract of Alternanthera phi loxeroides on
Oncomelania hupensis ,with Na-PCP(pentachloro phenol sodium)and pure water as controls , the soaking liquids
of the roots , stem and leaves of Alternanthera philoxeroides were used to examine their killing effect on
Oncomelania hupensis .The result shows that the soaking liquid at>0.5 %concentrations could kill 30 %～ 90 %
bodies of Oncomelania hupensis .When treated for 48 h , the mortality of Oncomelania hupensis was up to 100 %,
the higher of the concentration , the better of the effect.Alternanthera philoxeroides has molluscicidal effect.It is a
good candidate of potential plant molluscicides.
Key words:Alternanthera philoxeroides;Oncomelania hupensis ;molluscicidal effect
(责任编辑　游　俊)
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