全 文 ：·综述与专论· 2014年第3期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
氨基葡萄糖（GlcN）是一类重要的氨基单糖，
氨基连接在葡萄糖环的 2 号位的 C 上，是黏多糖和
几丁质的主要组成成分，广泛地分布于细菌、酵母
菌、丝状真菌、植物和动物体内［1，2］。在人体内，
氨基葡萄糖是糖胺聚糖的二糖单位前体，而这些糖
胺聚糖是组成黏膜分泌物、结蹄组织、皮肤、肌腱、
软骨和韧带等必不可少的成分。GlcN 在保健食品和
医药领域具有广泛应用，如能特异性地作用于关节
软骨，有效治疗风湿性关节炎 ；可抑制白血病细胞
K562 的生长 ；可参与肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的
作用等［3］。在日本和美国，GlcN 作为食品配料得到
收稿日期 ：2013-08-28
基金项目 ：国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2012AA021504）
作者简介 ：刘佃磊，男，硕士研究生，研究方向 ：微生物酶技术 ；E-mail ：liudianlei010187@126.com
通讯作者 ：王瑞明，男，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：微生物酶技术 ；E-mail ：ruiming3k@163.com
高产氨基葡萄糖基因工程菌的研究进展
刘佃磊  李丕武  李瑞瑞  王升  王瑞明
（齐鲁工业大学食品与生物工程学院 山东省微生物酶技术重点实验室，济南 250353）
摘 要 ： 氨基葡萄糖（GlcN）又称氨基葡糖或葡糖胺，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，在医药和保健领域具
有广泛应用。氨基葡萄糖的传统生产方法主要采取酸解几丁质法，受原料限制产量低，污染比较严重，构建高效产氨基葡萄糖的
基因工程菌可以避免这些问题。介绍了氨基葡萄糖的代谢途径，以及最近几年国内外产氨基葡萄糖基因工程菌的构建和氨基葡萄
糖的发酵培养，对氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的发酵生产有重大的指导意义。
关键词 ： 氨基葡萄糖 乙酰氨基葡萄糖 基因工程菌 发酵
Research Advance of the Construction of Gene Engineering Strains for
Glucosamine
Liu Dianlei Li Piwu Li Ruirui Wang Sheng Wang Ruiming
（School of Food and Bioengineering，Qilu University of Technology，Shandong Provincial Key Laboratory of
Microbial Engineering，Jinan 250353）
Abstract:  Glucosamine（GlcN）, also called amino sugar, was a compound derived from the substitution of a hydroxyl group of
glucose molecule with an amino group. GlcN found a wide-range of applications in health food and pharmaceutical industries. Glucosamine was
currently produced by extraction and acid hydrolysis of chitin from shellfish waste, which was limited by the amount of raw material available
and existed great risks of environment pollution. However, recombinant strain of gene engineering to overexpress the glucosamine could avoid
those problems. the gene engineering strain, its metabolic pathway and fermentation of glucosamine were introduced. It is a great significance to
ferment glucosamine and N-acetyglucosamine.
Key words:  Glucosamine N-acetyglucosamine Gene engineering strain Fementation
广泛应用。但目前国内上市的 GlcN 产品还比较少，
因此相关产品的开发空间和潜力巨大。
生产 GlcN 的方法可分为 3 种：微生物发酵法［4-7］
甲壳素水解法和生物转化法［8，9］。甲壳素水解是目
前生产 GlcN 的主要方法，但原料来源受限、环境污
染严重、部分消费者服用后会过敏 ；生物转化法生
产的酶价格高、生产成本高，转化时间长，难于实
现工业化生产［4-7，10-11］。因此，用微生物发酵生产
GlcN 吸引了越来越多研究者［12-14］。
相对于水解法和生物转化法，微生物发酵法具
有以下优点 ：发酵时间较短，生产强度较高 ；原料
2014年第3期 37刘佃磊等 ：高产氨基葡萄糖基因工程菌的研究进展
来源不受地域和季节限制，产品无鱼腥味 ；对环境
污染小 ；产品来自微生物，消费者服用后不会过敏。
之前的研究曾经报道了通过利用包括真菌在内的微
生物发酵生产氨基葡萄糖。由 Rhizopus oligosporus
发酵生产氨基葡萄糖的产量达到 110 mg/gdw［15］，
而 利 用 Monascus pilosus 发 酵 时 产 量 可 以 达 到 264
μg/mL［16］。另外，通过固体发酵工艺利用 Aspergillus
sp. 生产氨基葡萄糖的产量为 24.4 mg/gdw［17］。Hsieh
等［18］对 Aspergillus sp.BCRC31742 的发酵进行了一定
程度的改进使得氨基葡萄糖的产量达到 3 428 mg/L。
在 Sitanggang 等［19］ 的 研 究 中，Aspergillus sp.BCRC-
31742 发 酵 生 产 氨 基 葡 萄 糖 的 产 量 达 到 7.48 g/L。
Hsieh 利用 3 株不同的菌种研究了氨基葡萄糖产量
的 提 高， 这 3 个 菌 种 分 别 是 ：Rhizopus oligosorus，
Monascus pilonus and Aspergillus sp.。
大肠杆菌中 GlcN 合成代谢途径［4-7，20，21］（图 1）：
进入细胞内的葡萄糖在磷酸葡萄糖异构酶（PGI）的
催化下转化成 6-磷酸葡萄糖，后者在氨基葡萄糖合
成酶（GlmS）催化下生成 GlcN，氨基葡萄糖乙酰化
酶（Gna1）催化 GlcN 转化成乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）
（图 1）乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）经弱酸的处理后
会得到氨基葡萄糖。由于 GlcN 依靠甘露糖磷酸转移
系统（Mannose PTS，Ⅱ Man，由 manXYZ 操纵子编
码）和葡萄糖磷酸转移系统（glucose PTS，Ⅱ Glc，
由 pstG 基因编码）对其进行磷酸化后从胞外向胞内
进行转运，GlcNAc 依靠，排出胞外的氨基葡萄糖和
乙酰氨基葡萄糖经过 manXYZ 转运途径进入到胞内，
Ⅱ Man 和乙酰氨基葡萄糖磷酸转移系统（GlcNAc
PTS，Ⅱ NAG，由基因 nagE 编码）对其进行磷酸化
后从胞外向胞内转运，导致氨糖产量降低。因此，
要想在胞外积累高浓度的 GlcN 或 GlcNAc，就必须
减弱或阻断 GlcN 或 GlcNAc 从胞外到胞内的转运。。
1 国内外的研究
江南大学刘龙、堵国成等［22-24］通过基因工程
的方法，构建了一株高产氨基葡萄糖的基因工程
菌，提取大肠杆菌 BL21（DE3）和酿酒酵母 S288C
的 DNA，通过 PCR 技术将大肠杆菌中的氨基葡萄
糖合成酶编码基因（glms）和酿酒酵母中氨基葡
萄糖乙酰化酶编码基因（gnaI）克隆出来，选取大
肠 杆 菌 常 用 质 粒 pet-28a（+）， 将 glms 和 gnaI 连
接 到 pet-28a（+） 载 体 上， 得 到 重 组 质 粒 pet-28a
（+）-glms-gnaI，最后采取 Red 同源重组技术敲除重
组菌 E.coliATCC25947 基因组中 nagE 基因片段，得
到 nagE 基因失活的菌株 E.coli- △ nagE，将质粒 pet-
28a（+）-glms-gnaI 转 化 E.coli- △ nagE， 得 到 基 因
工程菌 pet-28a（+）-glms-gnaI- △ nagE，构建好的
基因工程菌采用 10% 的乳糖诱导，最后测得发酵液
中氨基葡萄糖的浓度可以达到 70 g/L。
江南大学构造的基因工程菌采用乳糖替代 IPTG
诱导，降低了成本，并且安全性提高了。最后产物
中氨基葡萄糖的浓度达到了 70 g/L，产量高，为下
一步工业化生产奠定了基础。
复旦大学涂宇鹏等［25］根据大肠杆菌代谢工程，
通过 λRed 同源重组系统将大肠杆菌 BL21（DE3）
中甘露糖磷酸转移酶系统操纵子（manXYZ）和乙酰
氨基葡萄糖（GlcNAc）转运和代谢特异性系统操纵
子（nagBACDnagE）进行双剔除，随后构建含新型
氨基葡萄糖合成酶基因（glms）表达载体 PETG，并
将它转化该双操纵子剔除菌株，改造后的菌株不可
以利用 GlcN 和 GlcNAc 作为碳源代谢，表达产 glms
菌株上清液经过 NiNTA 亲和层析纯化，其酶活性达
到 8.63 U/mg，酶活力是未克隆 glms 菌的 11.8 倍，
经过一整夜，低温 IPTG 诱导后发酵液中氨基葡萄糖
的浓度达到 16 mg/L。
涂宇鹏等［25］成功的构造了氨基葡萄糖的基因
工程菌，采用双基因敲除的策略使其 GLC 和 GLCN-
GlcNAc GlcNAc GlcN Glc
OUT
ptsG
manXYZ manXYZ
nagE
gnaI Glms Pgi
ptsG
IN
Fru-6-P Glc-6-PGlcNAc-6-P GlcN-6-P
Glc ：glucose ；Fru-6-P ：fructose-6-P ；ptsG ：glucose transporter gene ；
GlcN-6-P ：glucosamine-6-P ；GlcNAc-6-P ：N-acetylglucosamine-6-P ；glmS ：
glucosamine synthase ；gna1 ：glucosamine-6-phosphate acetyltransferase ；
nagE ：GlcNAc-specific transporter gene ；manXYZ ：mannose transporter gene ；
OUT ：outside the cell ；IN ：inside the cell. 双黑线代表细胞膜结构 ；绿线代表
代谢通路 ；红线代表切断途径 ；× 代表切断（颜色标识见电子版）
图 1 大肠杆菌中氨基葡萄糖代谢途径
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期38
AC 作为碳源，通过定向改造 glms 表达量提高生产
GLCN 的能力。但是发酵液中氨基葡萄糖的产量很
低，定向改造没有解除氨基葡萄糖的反馈抑制。
山东大学刘波等［26］通过采用 PCR 方法从 Pyr-
ococcus horikoshii OT3 基因组中克隆出 PH0511（外
切氨基葡萄糖苷酶）、PH0499（几丁二脱乙酰酶）、
PH0495（甘油酸激酶）基因，插入到 pET15b 表达
质粒中，再进行 E.coli BL21-codonPlus（DE3）-RIL
表达。通过对几丁质代谢相关嗜热酶类性质鉴定，
推测在极端嗜热球古菌 P.horikoshii OT3 中存在着特
有的几丁质代谢途径。其主要特征是几丁二脱乙酰
酶 Dacph（PH0499）能够将几丁寡糖（GlcNAcn）或
几丁二糖（GlcNAc2）先脱去乙酰基，生成非还原性
末端部分脱乙酰化的几丁寡糖或 GlcN-GlcNAc，然
后在外切氨基糖苷酶的水解作用下生成 GlcNAcn-1
与 GlcN，随后 Dacph 将 GlcNAcn-1 再脱去乙酰基，
并在外切氨基葡萄糖苷酶的上述配合作用下，从而
最终将几丁寡糖降解为产物氨基葡萄糖。
虽 然 试 验 结 果 鉴 定 了 嗜 热 球 古 菌 Pyrococcus
horikoshii OT3 几丁类物质降解的几种关键的酶，但
是，某些保守的可能参与该降解途径的蛋白尚未知。
例如，虽然序列分析显示在该保守的 ORF 簇中存在
负责寡糖转运的 ABC 转运蛋白系统，但是，对于它
们的结构、具体功能以及特征还是空白。另外，在
P.horikoshii 中，RT-PCR 证明一种 β-甘露糖苷酶很
可能参与该古菌几丁质类物质的降解过程，但是其
具体功能尚有待研究［27］。一种推定的蛋白（PH0500），
可能也参与该古菌的几丁质降解过程，其功能也有
待阐明。最后，氨基葡萄糖进一步转化为 6-磷酸氨
基葡萄糖的葡萄糖激酶也未知。因此，有必要鉴定
这些参与该古菌几丁质类物质代谢的其他保守蛋白
的性质，以对嗜热球古菌特有的几丁质降解途径有
更全面、深入的认识与理解，这方面还需要做大量
的工作。
由于氨基葡萄糖对缓解骨关节炎疼痛的特殊功
效，国外一些机构在 2000 年左右就开始对氨基葡
萄糖代谢途径进行深入的研究［28，29］，并且做了大
量的工作。美国的 Deng 等［2，4，7］最早开始对氨基
葡萄糖合成酶基因进行研究，根据代谢途径做了大
量的试验，从不同的菌中克隆了关键酶基因［30］，编
码氨基葡萄糖合成酶的基因从大肠杆菌、枯草芽孢
杆菌、酿酒酵母、白色念珠菌中克隆，并且对最
终产氨基葡萄糖合成酶的量进行了比较，得出从
大肠杆菌中克隆的关键酶基因表达后的酶活是 803
nmol/（min·mg），氨基葡萄糖的产量是 2 029 mg/L，
枯草芽孢杆菌克隆的关键酶基因酶活是 637 nmol/
（min·mg），氨基葡萄糖的产量是 128 mg/L，其它几
种菌中克隆的关键酶酶活是微量的，氨基葡萄糖产
量也很低［30］。代谢途径中的另一种关键酶是氨基葡
萄糖乙酰化酶，克隆从酿酒酵母、白色念珠菌、阿
拉伯芥等基因组中克隆，最终得出酿酒酵母克隆的
关键酶基因表达产酶是最高的，乙酰氨基葡萄糖的
产量也是最大的。2005 年，Deng 等［30］构建大肠杆
菌基因工程菌，首先阻断 nag 和 manXYZ 途径，构
建了一株 7107-17（manXYZ8，△ nag∷tetR）菌 ；通
过基因工程的方法把氨基葡萄糖合成酶基因（glms）
构建到 7107-17（DE3）中 ；采用 pet-24d 质粒，最
终得到 2123-12 工程菌株，最终得到氨基葡萄糖的
产量是 75 mg/L，是未改造菌的 20 倍左右。将克隆
后的氨基葡萄糖乙酰化酶基因 gnaI 导入到 2123-12
中，经过诱导和条件优化后，构建好的菌株最终乙
酰氨基葡糖的产量达到了 110 g/L，颇具市场竞争力。
Deng 等［31］研究表明大肠杆菌 6-磷酸氨基葡萄糖脱
氨酶（NagB）可以替代 Glms 生产氨基葡萄糖和乙
酰氨基葡萄糖，NagB 的过量表达可以合成 6-磷酸氨
基葡萄糖。高效表达 NagB 和 GnaI 产氨基葡萄糖和
乙酰氨基葡萄糖的水平和高效表达 glms 和 gnaI 相同。
Czarnecka 等［32］白色念珠菌 6-磷酸氨基葡萄糖合酶
高效纯化，通过构建基因工程菌，3 种重组方法包
括内部低聚糖组氨酸片段的构建来纯化氨基葡萄糖
合酶，从而达到高产氨基葡萄糖的目的。
2 基因工程菌发酵
2.1 基因工程菌的发酵培养
大多数的基因工程菌都是采用大肠杆菌作为表
达菌株。一般采用 LB 培养基斜面培养，再取一环
接种到 20 mL 种子培养基的 250 mL 的三角瓶里进
行种子培养（种子培养基的成分蛋白胨 12 g，酵母
膏 24 g，甘油 4 mL），按照 50 μg/mL 加入卡那霉素，
pH 自然，培养时间 12 h，温度 37℃，摇床转速 200
2014年第3期 39刘佃磊等 ：高产氨基葡萄糖基因工程菌的研究进展
r/min ；再以 5% 接种量接入装有 100 mL 发酵培养基
的 500 mL 的三角瓶中进行发酵培养（发酵培养基
的成分为蛋白胨 12 g，酵母膏 24 g，葡萄糖 10 g），
按照 50 μg/mL 加入卡那霉素，pH 自然，培养时间
12 h，温度 37℃，摇床转速 200 r/min，OD600 达到 0.6
时，按照 10% 浓度加入乳糖诱导 glms 和 gnaI 基因
的表达［24］。
最近几年也有一些关于氨基葡萄糖发酵条件优
化的研究，江南大学的陈欣［33］等通过分布调节溶
氧水平提高基因工程菌氨基葡萄糖的产量，最高产
量的氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖控制溶氧 0-2 h
是 20%，2-8 h 是 30%，8-12 h 是 40%，12-18 h 是
30%。在这种溶氧控制方法下，氨基葡萄糖和乙酰
氨基葡萄糖的总产量可以达到 72.89 g/L，是溶氧不
控制的 1.37 倍（53.31 g/L），这种溶氧控制方法对
重组工程菌工业化生产氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄
糖具有一定的指导作用。陈欣等［34］通过葡萄糖的
添加量对氨基葡萄糖的产量影响做了研究，第一个
阶段（0-2 h），分批培养物中最初的葡萄糖浓度控
制在 27 g/L，在第 2 个阶段（2-10 h）采取指数添
加，比生长速率控制在 0.20-1 h，第 3 个阶段（10-
16 h）葡萄糖添加浓度 300 g/L 添加速率是 32 mL/h。
通过葡萄糖时间变量添加策略，总的氨基葡萄糖
和乙酰氨基葡萄糖的量达到了 69.66 g/L，与一次性
培养添加相同量的葡萄糖的发酵液相比提高了 1.59
倍。江南大学张佳欣等［35］优化产氨基葡萄糖曲霉
BCRC31742 溶氧水平控制策略提高产量。在 0-12 h
时溶氧水平控制在 30% 而 12-60 h 时溶氧水平控
制在 50%，通过这个溶氧水平改变策略，氨基葡萄
糖的最高产量达到了 14.37 g/L，是没有溶氧控制的
1.3 倍。
在发酵培养的时候要注意几个方面 ：从斜面取
菌接种到种子培养基时，轻轻取一环即可，取得太
多容易培养的菌液浓度过高，对后面的发酵有影响，
操作时一定注意在超净工作台里无菌操作 ；卡那霉
素加入量不要太高或太低，加入量太多，菌体长不
起来，加入量太少，容易染杂菌，一般按照 20 mL
的培养基中加入 10 mg/mL 的卡那霉素 100 μL，使其
工作浓度达到 50 μg/mL ；乳糖诱导时间一定要把握
合适，一定要在 OD 值在 0.6 的时候加入乳糖诱导，
主要原因是 OD 在 0.6 时大肠杆菌处于对数生长期，
生长最为活跃，增值快，这个时期对外界最为敏感，
诱导收率大 ；其次，外源基因的表达是采用的强启
动子，诱导表达时会对菌体造成很大的负担（都用
于表达外源蛋白），如果一开始就表达的话，菌体
吸收的营养都用于表达外源蛋白，势必会严重影响
它的繁殖，这样算起来蛋白的表达量会很少，所以
一定要把握好诱导的时间，直接关系着产物的产量
问题。
3 展望
大肠杆菌基因工程菌容易染噬菌体，并且产内
毒素，具有一定的缺陷。而枯草芽孢杆菌广泛的应
用在工业化生产酶和氨基单糖等，具有很高的安全
性能，不产生外毒素和内毒素，也不容易被噬菌体
感染，适合基因工程菌的构建，但是枯草芽孢杆菌
的表达体系研究的不是很彻底，还需要很多工作去
做 ；另一个就是在酿酒酵母中构建基因工程菌，酿
酒酵母属于食品专用酵母具有安全高效的特点，容
易被消费者接受，安全性更高。其次是采用同源重
组敲除代谢途径中阻遏氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄
糖合成的基因，增强氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖
合成的关键途径，从而提高产量 ；再次就是用响应
面法找出最优的发酵条件，尤其是溶氧水平和乳糖
诱导时间的控制，对提高产量有很大的影响，产物
最终采取离子交换色谱技术进行纯化。
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（责任编辑 狄艳红）