全 文 ：第 １１ 卷第 ４ 期
２０１３ 年 ７ 月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ． １１ Ｎｏ． ４
Ｊｕｌ． ２０１３
ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １６７２ － ３６７８． ２０１３． ０４． ００８
收稿日期：２０１２ － ０３ － ２７
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３ 计划）（２０１２ＡＡ０２２１０１）
作者简介：王珊珊（１９８８—） ，女，河南洛阳人，硕士研究生，研究方向：生物化工；严　 明（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙａｎｍｉｎｇ＠ ｎｊｕｔ． ｅｄｕ． ｃｎ
过表达氨基葡萄糖脱氨酶对大肠杆菌氨基葡萄糖
合成及中心碳代谢的影响
王珊珊，高　 璐，严　 明，许　 琳
（南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 ２１１８００）
摘　 要：考察过表达氨基葡萄糖脱氨酶对氨基葡萄糖合成及大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中心碳代谢的影响。 实验结
果表明：过表达氨基葡萄糖脱氨酶使得在 ３６ ｇ ／ Ｌ葡萄糖，ｐＨ为 ９􀆰 ０ 的发酵条件下，发酵 ２４ ｈ后，重组菌发酵液中氨
基葡萄糖、丙酮酸和乙酸的量分别是对照菌 Ｒｏｓｅｔｔａ的 ２􀆰 １、１􀆰 ４８ 和 １􀆰 ７４ 倍；而乳酸的量为 ２􀆰 ５３ ｇ ／ Ｌ，对照菌 Ｒｏｓｅｔｔａ
发酵液中的乳酸含量未检测到，重组菌发酵液中柠檬酸及 α⁃酮戊二酸的含量分别是 Ｒｏｓｅｔｔａ的 ２􀆰 ９９ 和 ２􀆰 ７３ 倍。
关键词：大肠杆菌；脱氨酶；氨基葡萄糖
中图分类号：Ｑ７８　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２ － ３６７８（２０１３）０４ － ００４２ － ０７
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｏｎ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ ｃａｒｂｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＷＡＮＧ Ｓｈａｎｓｈａｎ，ＧＡＯ Ｌｕ，ＹＡＮ Ｍｉｎｇ，ＸＵ Ｌｉｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ ｃａｒｂｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｂｙ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ􀆰 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ
ｎａｇＢ ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｂｙ ｔｗｏ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈａｔ ｏｆ Ｒｏｓｅｔｔａ，ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ３６
ｇ ／ Ｌ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｐＨ ９􀆰 ０，ａｆｔｅｒ ２４ ｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ􀆰 Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｗａｓ １􀆰 ４８ ｔｉｍｅｓ，ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ
１􀆰 ７４ ｔｉｍｅｓ，ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ２􀆰 ９９ ｔｉｍｅｓ，α⁃ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ２􀆰 ７３ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｔｈａｔ ｏｆ Ｒｏｓｅｔｔａ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｒｅｌｙ．
Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｗａｓ ２􀆰 ５３ ｇ ／ Ｌ． Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ ｎｏｔ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ． Ｔｈｅｓｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ，ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｄ
ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ，ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｌｓｏ ｍａｄｅ ｔｈｅ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｕｖａｔｅ，ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ 􀆰 Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｈａｓ
ｇｒｅａｔ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ＴＣＡ ｃｙｃｌｅ，ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ α⁃ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｅ． ｃｏｌｉ；ｄｅａｍｉｎａｓｅ；ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ
　 　 氨基葡萄糖（２ 氨基 ２ 脱氧 Ｄ 葡萄糖，简
称 ＧｌｃＮ）是人体合成关节软骨及滑液的中间物，人
体及动物体内关节组织中糖蛋白的天然成分［１ － ２］。
国内外研究发现 ＧｌｃＮ 对骨关节炎有一定的疗
效［３ － ４］。 目前，工业上主要通过化学法水解甲壳素
得到，但原材料来源逐渐成为这种生产方法的限
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制，且通过这种方法生产的 ＧｌｃＮ用来做药物作用于
人体会有贝类蛋白过敏的风险［５］。 生物法制备氨
基葡萄糖不会有原料来源的限制及贝类蛋白过敏
的风险，环境污染小，操作简单等优点，近年来已成
为研究热点［５ － ７］，通过基因工程手段改变宿主的代
谢途径产 ＧｌｃＮ就是其中的一种方法。
氨基葡萄糖脱氨酶 （ ＮａｇＢ）主要催化 （ ＧｌｃＮ⁃
６⁃Ｐ）合成 Ｆｒｕ⁃６⁃Ｐ，此酶会受到乙酰氨基葡萄糖 ６
磷酸的变构激活（图 １），使得正逆反应的 Ｋｍ 值均减
小［８］。 而黑曲老霉的氨基葡萄糖脱氨酶催化 Ｆｒｕ⁃６⁃
Ｐ形成 ＧｌｃＮ⁃６⁃Ｐ的 Ｋｍ 值是已报道的氨基葡萄糖脱
氨酶中最低的，且此酶在偏酸性的环境下脱氨的反
应酶活较高，在偏碱性的条件下加氨反应酶活较
高［９］。 因此，通过过表达黑曲老霉的氨葡萄糖脱氨
酶并控制发酵过程，在偏碱性的条件下研究其对大
肠杆菌 ＣｌｃＮ的合成［１０ － １１］的影响。
由于 Ｆｒｕ⁃６⁃Ｐ在细胞内不仅用来合成氨基葡萄
糖，还有一部分经过 ＥＭＰ途径，生成丙酮酸，而丙酮
酸一部分代谢生成乳酸和乙酸，一部分在有氧条件
下进入 ＴＣＡ 循环。 这就造成氨基葡萄糖的合成途
径和 ＥＭＰ 途径会竞争 Ｆｒｕ⁃６⁃Ｐ 这个共同的底
物［５，９］，所以过表达氨基葡萄糖脱氨酶可能会对中
心碳代谢产生影响。 因此，笔者拟考察在大肠杆菌
中过表达黑曲霉的氨基葡萄糖脱氨酶及其对大肠
杆菌 ＧｌｃＮ的合成［１２ － １３］及中心碳代谢的影响，为通
过改变大肠杆菌代谢途径生产 ＧｌｃＮ 的研究奠定
基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株和质粒
大肠杆菌 Ｒｏｓｅｔｔａ、ＤＨ５α，质粒 ｐＭＤ１８Ｔ － ｎａｇＢ
由笔者所在实验室保藏。 表达载体 ｐＥＴ１５Ｂ 购自
ＴａＫａＲａ公司。
１􀆰 ２　 培养基
种子液采用 ＬＢ 培养基（ｇ ／ Ｌ）：胰蛋白胨 １０、酵
母粉 ５、ＮａＣｌ １０。
自诱导培养基（ｇ ／ Ｌ） ［１４］：胰蛋白胨 １０、酵母粉
５、Ｎａ２ ＨＰＯ４ ７􀆰 ０９９、 ＫＨ２ ＰＯ４ ６􀆰 ８０４ ５、 （ ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４
３􀆰 ３０３ ５、α 甘油 ５、葡萄糖 ０􀆰 ５、α 乳糖 ３，微量元
素溶液。
１ ０００ ×微量元素（ｍｍｏｌ ／ Ｌ）：ＦｅＣｌ３ ０􀆰 ０１、ＣａＣｌ２
０􀆰 ００４、ＭｎＣｌ２ ０􀆰 ００２、 ＺｎＳＯ４ ０􀆰 ００２、 ＣｏＣｌ２ ０􀆰 ０００ ４、
ＣｕＣｌ２ ０􀆰 ０００ ４、 ＮｉＣｌ２ ０􀆰 ０００ ４、 ＮａＭｏＯ４ ０􀆰 ０００ ４、
图 １　 大肠杆菌 ＧｌｃＮ的生物合成与分解途径
Ｆｉｇ． １　 Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ
ＧｌｃＮ ｆｏｒ Ｅ． ｃｏｌｉ
Ｎａ２ＳｅＯ３ ０􀆰 ０００ ４、Ｈ３ＢＯ３ ０􀆰 ０００ ４。
用 ＮａＯＨ 调 ｐＨ 至 ７􀆰 ５，加入 ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ２４ ｇ ／ Ｌ，
加氨苄青霉素的终质量浓度为 ０􀆰 １ ｇ ／ Ｌ。
发酵液 （ ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ３６、 ＮＨ４ ＨＣＯ３ ７􀆰 ９０６、
Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ ７􀆰 ２、 ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ４１， ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ４、
ＺｎＣｌ２ ０􀆰 ４。
磷酸缓冲液 （ ＰＢＳ）体系 （ ｇ ／ Ｌ）： ＮａＣｌ ８、 ＫＣｌ
０􀆰 ２、ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ２４、Ｎａ２ＨＰＯ４ １􀆰 ４４。
１􀆰 ３　 主要试剂和仪器
限制性内切酶、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ购自 ＴａＫａＲａ公司，
ＬＡｐｒｏ ＴａｑＤＮＡ聚合酶购自南京金斯瑞生物科技有
限公司，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、质粒小量抽提试剂盒购自
上海申能博彩生物技术有限公司，胶回收试剂盒购
自美国 Ｂｉｏｍｉｇａ公司，氨苄青霉素购自 ＢＢＩ 公司，乙
腈购自美国 ＲＯＥ 公司，其他试剂均为国产试剂纯，
高效液相色谱系统购自美国戴安公司。
１􀆰 ４　 氨基葡萄糖脱氨酶基因 ｎａｇＢ 在 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ 中的
表达
１􀆰 ４􀆰 １　 重组质粒 ｐＥＴ１５Ｂ⁃ｎａｇＢ的构建
根据 ＮＣＢＩ中黑曲霉基因组中的 ｎａｇＢ 基因序
列设计氨基葡萄糖脱氨酶基因的 ＰＣＲ 扩增引物。
上游引物 Ｐ１：５′⁃ＧＣＧＧＣＧＴＣＴＣＡＣＡＴＧＡＧＡＧＴＡＡＴ
ＣＡＴＴＡＧＧＧＡＧＡＣＴＡＧＣＣ⁃３′；下游引物 Ｐ２：５′⁃ＣＣＧ⁃
ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＴＧＣＧＡＴＧＣＡＡＣＣＣ⁃３’。
３４　 第 ４ 期 王珊珊等：过表达氨基葡萄糖脱氨酶对大肠杆菌氨基葡萄糖合成及中心碳代谢的影响
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在上下游分别设计了 ＢｓｍＢＩ 和 ＸｈｏＩ 点用于连
接到表达载体 ｐＥＴ１５Ｂ。 以 ｐＭＤ１８Ｔ⁃ｎａｇＢ 为模板，
用设计的引物 ＰＣＲ扩增 ｎａｇＢ基因。 所用引物由南
京金斯瑞生物科技有限公司合成。
扩增条件：９４ ℃预变性 ５ ｍｉｎ；９４ ℃变性 ４５ ｓ，
５４ ℃退火 ４５ ｓ，７２ ℃延伸 １ ｍｉｎ ３０ ｓ，３０ 个循环；７２
℃延伸 １０ ｍｉｎ。
将 ｐＥＴ１５Ｂ 和 ＰＣＲ 扩增片段用 ＢｓｍＢＩ 和 ＸｈｏＩ
进行双酶切，胶回收 ｎａｇＢ 片段，将其与经相同酶切
线性化并胶回收过的 ｐＥＴ１５Ｂ 载体连接，转化入大
肠杆菌 ＤＨ５α，挑取阳性转化子。 提取质粒酶切鉴
定，将重组表达载体命名为 ｐＥＴ１５Ｂ⁃ｎａｇＢ。 并将其
转化大肠杆菌 Ｒｏｓｅｔｔａ，筛选出阳性转化子。
１􀆰 ４􀆰 ２　 重组菌诱导表达
重组菌 Ｒｏｓｅｔｔａ⁃ｐＥＴ１５Ｂ⁃ｎａｇＢ 在液体 ＬＢ 中，３７
℃培养活化。 然后按 ２％接种量转接入自诱导培养
基中， ３７ ℃、 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ、培养 ２􀆰 ５ ｈ。 然后转入
１５ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ条件下，进行诱导表达 １５ ｈ。
１􀆰 ４􀆰 ３　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ电泳分析
采用 ５％的浓缩胶及 １２％分离胶的不连续垂直
平板电泳进行蛋白分离，考马斯亮蓝 Ｒ ２５０ 染色。
１􀆰 ４􀆰 ４　 蛋白质含量测定
蛋白质含量的测定采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法，以牛血清
白蛋白为标准蛋白质。
１􀆰 ４􀆰 ５　 酶活力的测定
粗酶液的制备：低温收集菌体，用 １００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＰＨ ８􀆰 ３ Ｔｒｉｓ洗菌 ２ 次，破碎细胞，低温离心，取上清
作为酶液。
酶活力单位定义：１ ｍｉｎ 生成 １ μｍｏｌ ＧｌｃＮ 所需
的酶量为 １ 个单位（Ｕ）。
酶活力测定方法［９］：取 １􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ的 Ｎａ２ＣＯ３ 溶
液 １０ ｍＬ加入 ７００ μＬ乙酰丙酮得乙酰丙酮溶液；
称 １􀆰 ３３３ ｇ对二甲氨基苯甲醛溶于 ２５ ｍＬ浓盐
酸和 ２５ ｍｌ无水乙醇的混合液中得对二甲氨基苯甲
醛溶液；
取一个 １􀆰 ５ ｍＬ 的 ＥＰ 管，加入 ６００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＮＨ４Ｃｌ １０ μＬ，６０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 Ｆｒｕ⁃６⁃Ｐ１０ μＬ，酶液 ８０
μＬ，放入 ３０ ℃水浴锅中，反应 ５ ｍｉｎ后，加入乙酰丙
酮溶液 ５０ μＬ，沸水浴 ３０ ｍｉｎ，冷却后加入 １００ μＬ
无水乙醇，５０ μＬ 对二甲氨基苯甲醛溶液，混匀，再
加入 ２００ μＬ 无水乙醇，６０ ℃保温 １ ｈ，用酶标仪测
５４０ ｎｍ处的吸光值。
１􀆰 ５　 发酵体系的优化以及有机酸随发酵时间的
变化
　 　 低温收集诱导表达后的菌体，并用 ＰＢＳ 低温洗
菌 ２ 次，加入发酵液，转移至 ２５０ ｍＬ 三角瓶中，
３０ ℃、２００ ｒ ／ ｍｉｎ条件下，发酵葡萄糖形成 ＧｌｃＮ。 在
此基础上对于初始 ｐＨ、发酵温度、底物浓度，菌体浓
度的发酵条件进行了优化。
１􀆰 ６　 测定方法
ＧｌｃＮ含量的测定［１５］：采用戴安 Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００
高效液相色谱系统，汉邦 Ｃ１８ 色谱柱，检测器为紫
外检测器，检测波长 ２５４ ｎｍ，流动相为乙酸钠乙腈
溶液。
有机酸含量的检测：采用戴安 Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ 高
效液相色谱系统，戴安有机酸色谱柱，检测器为紫
外检测器，检测波长 ２１０ ｎｍ，流动相为 ６􀆰 ８ ｇ ／ Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４溶液。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 含有氨基葡萄糖脱氨酶基因 ｎａｇＢ 重组质粒
的构建及表达
　 　 以实验室已有 ｐＭＤ１８Ｔ⁃ｎａｇＢ 载体为模板，利
用合成的引物 Ｐ１ 和 Ｐ２ 进行 ＰＣＲ 扩增，通过琼脂
糖凝胶电泳检测扩增片段，扩增 ＤＮＡ 片段长为
１ ０６８ ｂｐ。 将该片段纯化和酶切后，插入载体
ｐＥＴ１５Ｂ 的 ＮｃｏＩ和 ＸｈｏＩ酶切位点之间。 用所构建
的重组质粒转化大肠杆菌 ＤＨ５α，转化子涂布于含
有 ３４ μｇ ／ ｍＬ氯霉素和 １００ μｇ ／ ｍＬ 氨苄青霉素的
ＬＢ 平板，提取阳性重组子质粒。 重组质粒经过双
酶切验证（预期两片段大小分别为：６ ２７０ 和 ４４１
ｂｐ），结果如图 ２ 所示。 由图 ２ 可知，泳道 ４ 重组
质粒双酶切验证结果片断大小与预期相符。 该质
粒命名为ｐＥＴ１５Ｂ⁃ｎａｇＢ。
将重组质粒 ｐＥＴ１５Ｂ⁃ｎａｇＢ 转化进入大肠杆菌
Ｒｏｓｅｔｔａ 中，挑取单菌落接入 ＬＢ 液体培养基培养，
１２ ｈ后转接入自诱导培养基。 １５ ℃诱导 １５ ｈ 菌液
经超声破碎细胞后，上清液经 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ 蛋白质电
泳分析，结果如图 ３ 所示。 由图 ３ 可知：重组菌的破
碎上清液中出现 １ 条约为 ４􀆰 ２ × １０４的特异性条带，
与理论值 ３􀆰 ９ × １０４相符合。 同时测得重组菌破碎
上清液中氨基葡萄糖脱氨酶活性为 ２ ｍＵ ／ ｍｇ，而对
照菌的破碎上清液中检测到氨基葡萄糖脱氨酶的
活性为 ０􀆰 ４ ｍＵ ／ ｍｇ，说明氨基葡萄糖脱氨酶基因
ｎａｇＢ在重组菌中已获得成功表达。
４４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
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１ ～ ２—ｎａｇＢ基因 ＰＣＲ扩增产物；３—ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００；４ ～ ５—重组质粒 ｐＥＴ１５Ｂ⁃ｎａｇＢ双酶切产物；
６—ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００；７—ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ１５０００
图 ２　 ｎａｇＢ的基因扩增与重组质粒 ｐＥＴ１５Ｂ⁃ｎａｇＢ的酶切鉴定
Ｆｉｇ． ２　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｎａｇＢ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐＥＴ１５Ｂ⁃ｎａｇＢ
Ｍａｒｋｅｒ—Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ；１—Ｒｏｓｅｔｔａ菌；２—Ｒｏｓｅｔｔａ⁃ｐＥＴ１５Ｂ⁃ｎａｇＢ
图 ３　 重组大肠杆菌 Ｒｏｓｅｔｔａ⁃ｐＥＴ１５Ｂ⁃ｎａｇＢ
细胞的 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ电泳分析
Ｆｉｇ． ３　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｒｏｓｅｔｔａ⁃ｐＥＴ１５Ｂ⁃ｎａｇＢ
２􀆰 ２　 发酵条件对大肠杆菌合成 ＧｌｃＮ的影响
２􀆰 ２􀆰 １　 初始 ｐＨ对重组大肠杆菌合成 ＧｌｃＮ的影响
在大肠杆菌中，合成 ＧｌｃＮ 的底物 Ｆｒｕ⁃６⁃Ｐ 是葡
萄糖经 ＥＭＰ途径转化而来，而另一个底物谷氨酰胺
主要用来提供 ＮＨ ＋４ ，因此发酵底物选择葡萄糖和铵
盐。 由文献［９］知，ｐＨ 对该酶的活性影响较大，因
此在发酵条件中，选择不同的初始 ｐＨ 条件作为考
虑的首要问题。
由图 ４ 可知：初始 ｐＨ≤７􀆰 ０ 时，发酵液中 ＧｌｃＮ
含量较低，这主要是由于在酸性缓冲液中氨基葡萄
糖脱氨酶的加氨反应活性较低所致；初始 ｐＨ为 ８􀆰 ０
图 ４　 不同初始 ｐＨ对发酵合成 ＧｌｃＮ的影响
Ｆｉｇ． ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｎ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ＧｌｃＮ ｙｉｅｌｄ
至 ９􀆰 ３ 时，发酵液中 ＧｌｃＮ 的含量较高，这主要是因
为氨基葡萄糖脱氨酶在偏碱性的条件下，酶的加氨
方向的反应活性较高；初始 ｐＨ 为 １０􀆰 ０ 时，发酵液
中 ＧｌｃＮ含量骤然减少，这是由于碱性过强的溶液对
于菌体会产生影响。 因此，初始 ｐＨ 对于重组菌发
酵合成 ＧｌｃＮ 有影响，且发酵液的最适初始 ｐＨ
为 ９􀆰 ０。
２􀆰 ２􀆰 ２　 温度对重组大肠杆菌合成 ＧｌｃＮ的影响
考察了温度对重组菌发酵合成 ＧｌｃＮ的影响，结
果如图 ５ 所示。
由图 ５ 可知：发酵温度在 ２０ ～ ４８ ℃时，发酵液
中 ＧｌｃＮ的含量随着温度的降低而增高。 这是因为
温度升高时，温度对酶稳定性的影响增强，酶会逐
渐失活，产物得率降低。 确定体系最适发酵温度为
２０ ℃。
２􀆰 ２􀆰 ３　 铵盐对重组大肠杆菌合成 ＧｌｃＮ的影响
考察铵盐对重组菌发酵合成 ＧｌｃＮ有影响，结果
见图 ６。 由图 ６ 可知：ＮＨ４ＨＣＯ３ 对发酵产生 ＧｌｃＮ最
５４　 第 ４ 期 王珊珊等：过表达氨基葡萄糖脱氨酶对大肠杆菌氨基葡萄糖合成及中心碳代谢的影响
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有利，其余来源的铵盐对于发酵产生 ＧｌｃＮ没有明显
的作用。 因此确定体系最适铵盐来源为 ＮＨ４ＨＣＯ３。
图 ５　 温度对发酵合成 ＧｌｃＮ的影响
Ｆｉｇ． ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｏｆ ＧｌｃＮ ｙｉｅｌｄ
图 ６　 铵盐对发酵合成 ＧｌｃＮ的影响
Ｆｉｇ． ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｏｎ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ＧｌｃＮ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ２􀆰 ４　 底物浓度对重组大肠杆菌合成 ＧｌｃＮ的影响
考察底物浓度对重组菌发酵合成 ＧｌｃＮ的影响，
结果见图 ７。 由图 ７ 可知：底物浓度≤０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ时，
随着底物浓度的增加，发酵液中 ＧｌｃＮ的量增加。 这
主要是根据酶反应动力学原理，在底物浓度≤Ｋｍ的
时候，提高底物浓度会提高反应速率，产物的量会
增加。 当底物浓度在 ０􀆰 ３ ～ ０􀆰 ６ ｍｏｌ ／ Ｌ 时，随着底物
浓度增加，发酵液中 ＧｌｃＮ的量减少。 这主要是由于
菌体所处的胞外环境浓度过高，不利于菌体代谢。
确定体系最适底物浓度为 ０􀆰 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ。
２􀆰 ２􀆰 ５　 菌体密度对重组大肠杆菌合成 ＧｌｃＮ的影响
考察菌体浓度对发酵产物合成的影响［１６］，结果
见图 ８。 由图 ８ 可知：在菌体 ＯＤ６００为 ２０ 左右的情
况下，发酵液中 ＧｌｃＮ 的积累最多。 因此，确定最适
菌体浓度 ＯＤ６００为 ２０。
图 ７　 底物浓度对发酵合成 ＧｌｃＮ的影响
Ｆｉｇ． ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ＧｌｃＮ ｙｉｅｌｄ
图 ８　 菌体密度对发酵合成 ＧｌｃＮ的影响
Ｆｉｇ． ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ＧｌｃＮ ｙｉｅｌｄ
２􀆰 ２􀆰 ６　 发酵时间对重组大肠杆菌合成 ＧｌｃＮ的影响
考察发酵时间对发酵产物的影响［１６］，结果见图
９。 由图 ９ 可知：发酵时间在 ０ ～ ２４ ｈ 时，随着发酵
时间的延长，发酵液中 ＧｌｃＮ 的含量不断增加，２４ ｈ
达到最大值，２８ ｈ 开始减少。 因此确定体系最佳发
酵时间为 ２４ ｈ。
图 ９　 发酵时间对发酵合成 ＧｌｃＮ的影响
Ｆｉｇ． ９　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ＧｌｃＮ ｙｉｅｌｄ
６４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
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２􀆰 ３　 过表达 ｎａｇＢ基因对 ＧｌｃＮ积累以及中心碳代
谢的影响
　 　 在最适发酵条件下，检测发酵液中残糖、ＧｌｃＮ
的含量，以及丙酮酸、乙酸、乳酸、柠檬酸及 α 酮戊
二酸几种有机酸的含量，观察过表达氨基葡萄糖脱
氨酶对于 ＧｌｃＮ积累以及中心碳代谢的影响。
２􀆰 ３􀆰 １　 过表达 ｎａｇＢ 基因对发酵过程中糖耗以及
ＧｌｃＮ积累的影响
图 １０ 为过表达 ｎａｇＢ 基因对发酵过程中糖耗
的影响结果。 由图 １０ 可知：在优化的最佳发酵条件
下，０ ～ １８ ｈ，重组菌的糖耗速率比原始菌 Ｒｏｓｅｔｔａ
大，而且在 ２４ ｈ 葡萄糖均已耗尽。 由此可见，过表
达 ｎａｇＢ造成了发酵过程中的糖耗速率增大。
图 １０　 过表达 ｎａｇＢ对发酵过程中糖耗的影响
Ｆｉｇ． １０　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｎａｇＢ
ｏｎ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ
图 １１ 为在最佳发酵条件下，过表达 ｎａｇＢ 基因
对发酵过程中大肠杆菌 ＧｌｃＮ 积累的影响结果。 由
图 １１ 可知：在最佳发酵条件下，葡萄糖耗尽，重组菌
发酵液中的 ＧｌｃＮ含量是 Ｒｏｓｅｔｔａ 的 ２􀆰 １ 倍。 这说明
过表达 ｎａｇＢ 对大肠杆菌 ＧｌｃＮ 的合成有一定的促
进作用。
图 １１　 过表达 ｎａｇＢ对大肠杆菌 ＧｌｃＮ积累的影响
Ｆｉｇ． １１　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｇｅｎｅ ｎａｇＢ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｎ ＧｌｃＮ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ
２􀆰 ３􀆰 ２　 过表达 ｎａｇＢ 基因对大肠杆菌中心碳代谢
的影响
合成 ＧｌｃＮ⁃６⁃Ｐ的底物 Ｆｒｕ⁃６⁃Ｐ在细胞内除了用
来合成 ＧｌｃＮ⁃６⁃Ｐ 之外，还会经 ＥＭＰ 途径形成丙酮
酸，丙酮酸一部分经代谢会合成乳酸或乙酸，另一
部分进入 ＴＣＡ 循环。 因此，通过观察乙酸、乳酸和
柠檬酸及 α⁃酮戊二酸的积累，观察过表达 ｎａｇＢ 对
中心碳代谢的影响，结果见图 １２。
图 １２　 过表达 ｎａｇＢ对大肠杆菌有机酸积累的影响
Ｆｉｇ． １２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｎａｇＢ ｏｎ ｏｒｇａｎｉｃ
ａｃｉｄｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ
由图 １２ 可知：在最佳发酵条件下，重组菌发酵
液中丙酮酸的含量是 Ｒｏｓｅｔｔａ 的 １􀆰 ４８ 倍；丙酮酸的
代谢产物乙酸的含量是 Ｒｏｓｅｔｔａ 的 １􀆰 ７４ 倍；丙酮酸
的代谢产物乳酸的含量为 ２􀆰 ５３ ｇ ／ Ｌ，Ｒｏｓｅｔｔａ 发酵液
中没有检测到乳酸含量；重组菌发酵液中柠檬酸及
α 酮戊二酸的含量分别是 Ｒｏｓｅｔｔａ 的 ２􀆰 ９９ 和 ２􀆰 ７３
倍。 实验数据表明：过表达 ｎａｇＢ 导致了有机酸的
积累，且跟 ＴＣＡ途径相关的柠檬酸及 α 酮戊二酸
的含量较高，分别为 ２􀆰 ３９ 和 １１􀆰 ７４ ｇ ／ Ｌ。
３　 结　 论
研究了在大肠杆菌 Ｒｏｓｅｔｔａ 中过表达黑曲霉氨
基葡萄糖脱氨酶，对于大肠杆菌 ＧｌｃＮ的合成和中心
碳代谢的影响。 实验结果表明：过表达氨基葡萄糖
脱氨酶使得在 ３６ ｇ ／ Ｌ 葡萄糖，ｐＨ 为 ９􀆰 ０ 的发酵条
件下，发酵 ２４ ｈ后，重组菌发酵液中氨基葡萄糖、丙
酮酸和乙酸的量分别是对照菌 Ｒｏｓｅｔｔａ 的 ２􀆰 １、１􀆰 ４８
和 １􀆰 ７４ 倍；而乳酸的量为 ２􀆰 ５３ ｇ ／ Ｌ，对照菌 Ｒｏｓｅｔｔａ
发酵液中的乳酸含量并未检测到，重组菌发酵液中
柠檬酸及 α 酮戊二酸的含量分别是 Ｒｏｓｅｔｔａ 的
２􀆰 ９９ 倍和 ２􀆰 ７３ 倍。 过表达黑曲霉氨基葡萄糖脱氨
酶能够促进 ＧｌｃＮ的合成，导致糖代谢减慢，使得葡
萄糖主要经过 ＥＭＰ途径进入 ＴＣＡ循环。
７４　 第 ４ 期 王珊珊等：过表达氨基葡萄糖脱氨酶对大肠杆菌氨基葡萄糖合成及中心碳代谢的影响
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在后期的工作中，可以对大肠杆菌的代谢途径
进一步的改造，加强 ＧｌｃＮ 合成途径，弱化中心碳代
谢途径，以实现 ＧｌｃＮ的有效积累。
参考文献：
［ １ ］　 ｄｅ ｌｏｓ Ｒｅｙｅｓ Ｇ Ｃ， Ｋｏｄａ Ｒ Ｔ， Ｌｉｅｎ Ｅ Ｊ． Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｎｄ
ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ： ａ ｓｕｒｖｅｙ
［Ｊ］ ． Ｐｒｏｇ Ｄｒｕｇ，２０００，５５：８１⁃１０３．
［ ２ ］ 　 Ｖａｎｇｓｎｅｓｓ Ｃ Ｔ，Ｊｒ Ｓｐｉｋｅｒ Ｗ，Ｅｒｉｃｋｓｏｎ Ｊ． Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｅｖｉｄｅｎｃｅ⁃
ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｆｏｒ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｎｄ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｕｓｅ ｉｎ
ｋｎｅｅ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ［Ｊ］ ． Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ，２００９，２５（１）：８６⁃９４．
［ ３ ］ 　 Ｄｉｓｔｉｅｒ Ｊ， Ａｎｇｕｅｌｏｕｃｈ Ａ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ⁃ｂａｓｅｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ： ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ
ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｎｄ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ
ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｎｕｒｓｅ Ｐｒａｃｔ，
２００６，１８（１０）：４８７⁃４９３．
［ ４ ］ 　 Ｂａｒｒｉｅｎｔｏｓ Ｃ， Ｒａｃｏｔｔａ Ｒ， Ｑｕｅｖｅｄｅ Ｌ． Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ
ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｏｆ ｉｎｔｒａａｂｄｏｍｉｎａｌ ｆａｔ，ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ
ａ ｈｉｇｈ⁃ｆａｔ ｄｉｅｔ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］ ． Ｎｕｔｒ Ｒｅｓ，２０１０，３０（１１）：７９１⁃８００．
［ ５ ］ 　 Ｄｅｎｇ Ｍ Ｄ，Ｗａｓｓｉｎｋ Ｓ Ｌ，Ｇｒｕｎｄ Ａ Ｄ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｎｅｗ ｐａｔｈｗａｙ
ｆｏｒ Ｎ⁃ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａ ｃａｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅ，
ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ⁃６⁃ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅａｍｉｎａｓｅ，ｗｉｔｈ ａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ，
ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ⁃６⁃ｐｈｏｓｐｈａｔｅ⁃Ｎ⁃ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ［Ｊ］ ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ
Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００６，３９：８２８⁃８３４．
［ ６ ］ 　 Ｄｅｎｇ Ｍ Ｄ， Ｓｅｖｅｒｓｏｎ Ｄ Ｋ， Ｇｒｕｎｄ Ａ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｎｄ Ｎ⁃ａｃｅｔｙｌ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ［ Ｊ］ ． Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ，２００５，７：
２０１⁃２１４．
［ ７ ］ 　 Ｈｏｎｇ Ｋ Ｋ， Ｃｈｕｎｇ Ｊ Ｓ， Ｓｈｉｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｅｎｕｓ
ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｈａｖｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ Ｎ⁃ａｃｅｔｙｌ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ａｎｄ
ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｎ⁃ａｃｅｔｙｌ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｏｒ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｕｓｉｎｇ
ｓａｍｅ：ＥＰ，２３４８１０１Ａ２［Ｐ］． ２０１１⁃０７⁃２７．
［ ８ ］ 　 Áｌｖａｒｅｚ⁃ Ａñｏｒｖｅ Ｌ Ｉ， Ｂｕｓｔｏｓ⁃Ｊａｉｍｅｓ Ｉ， Ｃａｌｃａｇｎｏ Ｍ Ｌ， ｅｔ ａｌ．
Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ⁃６⁃ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ
（ＮａｇＢ） ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｎ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ［ Ｊ］ ． Ｊ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， ２００９，１９１（２０）：６４０１⁃６４０７．
［ ９ ］ 　 Šｏｌａｒ Ｔ，ＴｕｒšｉｃˇＪ，Ｌｅｇｉšａ Ｍ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ⁃６⁃ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｔ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｇｒｏｗｈｔ ｉｎ ａ ｈｉｇｈ⁃
ｃｉｔｒｉｃ⁃ａｃｉｄ⁃ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ［Ｊ］ ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，７８：
６１３⁃６１９．
［１０］ 　 Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｍ， Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｓ． Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ⁃
ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
［Ｊ］ ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ，２０１０，３４５：２６０５⁃２６０９．
［１１］ 　 Ｗｈｉｔｅ Ｒ Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｍｉｎｏ ｓｕｇａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔｓ ｕｎａｂｌｅｔｏ ｄｅｇｒａｄｅ ａｍｉｎｏ ｓｕｇａｒｓ ［ Ｊ ］ ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９６８，１０６：８４７⁃５８．
［１２］ 　 Ｐａｐａｇｉａｎｎｉ Ｍ，Ｗａｙｍａｎ Ｆ，Ｍａｔｔｅｙ Ｍ． Ｆａｔｅ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｍｍｏｎｉｕｍ
ｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ［ Ｊ］ ． Ｊ
Ａｍ Ｓｏｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，７１（１１）：７１７８⁃７１８６．
［１３］ 　 Ｌｅｇｉšａ Ｍ，Ｍａｔｔｅｙ Ｍ． Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ
ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｏｖｅｒｆｌｏｗ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，
２００７，２９（２）：１８１⁃１９０．
［１４］ 　 Ｓｔｕｄｉｅｒ Ｆ Ｗ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｔｏ⁃ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｇｈ⁃ｄｅｎｓｉｔｙ
ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］ ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，２００５，４１：２０７⁃２３４．
［１５］ 　 周慧，郝宁，严明，等． 柱前衍生化 ＨＰＬＣ 法测定发酵液中
Ｌ 瓜氨酸和 Ｌ 鸟氨酸含量［ Ｊ］ ． 南京工业大学报：自然科学
版，２００９，３１（２）：７７⁃８０．
［１６］ 　 陈金燕，邹树平，何冬梅，等． 水 ／离子液体［ＢＭＩＭ］ ＰＦ６ 两相
体系中全细胞催化生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸［ Ｊ］ ． 化工
学报，２０１１，６２（１１）：３１３６⁃３１４２．
８４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
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