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Review on Research Progresses in the Fermentation Methods to Produce Glucosamine

利用发酵法生产氨基葡萄糖的研究进展



全 文 :生物技术通报
·技术与方法· BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
利用发酵法生产氨基葡萄糖的研究进展
王升  李丕武  刘佃磊  李以明  林晶晶
(齐鲁工业大学食品与生物工程学院 山东省微生物工程重点实验室,济南 250353)
摘 要 : 氨基葡萄糖(GlcN) 是一种重要的氨基己糖。它由葡萄糖的一个羟基被氨基取代形成,能够有效作用于软骨组织
治疗风湿性关节炎,并被视为天然无害的食品及保健品配料,市场应用前景广阔。目前,生产 GlcN 的方法主要有酸水解法、酶解
法及微生物发酵法。由于酸水解法及酶解法生产 GlcN 会对环境造成不利影响及生产效率低等原因,微生物发酵法生产 GlcN 得到
了越来越多研究者的关注。对微生物代谢产 GlcN 的合成途径、霉菌发酵产 GlcN 及工程菌发酵产 GlcN 等方面进行了概述,并对微
生物发酵法生产 GlcN 的研究方向进行了展望。
关键词 : 氨基葡萄糖 合成途径 微生物发酵
Review on Research Progresses in the Fermentation Methods to
Produce Glucosamine
Wang Sheng Li Piwu Liu Dianlei Li Yiming Lin Jingjing
(Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering,School of Food and Bioengineering, Qilu University of Technology Ji’nan 250353)
Abstract:  Glucosamine(GlcN)is an important hexosamine. It is formed by one hydroxyl group of glucose substituted by amino and has
an effective role in the treatment of rheumatoid arthritis in the cartilage tissue. Besides, it is regarded as the natural harmless ingredients for food
and health products. Currently, the methods for the production of GlcN include acid hydrolysis, enzymatic hydrolysis and microbial fermentation.
For acid hydrolysis and enzymatic hydrolysis to product GlcN can lead to some adverse effects, such as environmental pollution, microbial
fermentation is getting more attention from researchers. This overview focused on the biosynthetic pathway of microbial metabolism, microbial
production of GlcN, and the direction of research for GlcN fermentation.
Key words:  Glucosamine Biosynthetic pathway Microbial fermentation
氨基葡萄糖(2-amino-2-deoxy-D-glucose,GlcN) 有消炎护肝的功效[9,10]。GlcN 在食品保健领域也有
是一种重要的氨基己糖, 由葡萄糖的一个羟基被氨 着广泛的应用, 在一些欧美国家 GlcN 被视为天然无
基取代形成, 分子式为 C6H13O5N, 易溶于水及亲水 害的食品及保健品配料而得到大量推广, 而目前国
性溶剂。GlcN 广泛存在于真菌细胞壁及虾蟹的外骨 内相关产品较少[7]。目前, 生产 GlcN 的方法主要
骼中,是甲壳素与壳聚糖的组成成分[1]。在自然界中, 有 3 种,即酸水解法、酶解法[11,12]及微生物发酵法。
细菌、酵母、真菌、植物及动物体内也广泛存在 前两种方法的生产原料基本上来源于虾蟹的外骨骼,
3]GlcN[2, 。GlcN 也是糖蛋白和蛋白聚糖的主要成分, 即从虾蟹壳中提取甲壳素与壳聚糖, 再经酸解或酶
在人与动物的关节软骨组织中起着重要作用[4], 并 解获得 GlcN 。高浓度的盐酸在一定的反应条件下能
大量存在于人类眼睛晶状体中[5,6]。早在 20 个世纪 够将虾蟹壳中的甲壳素与壳聚糖降解为 GlcN, 但由
60 年代,GlcN 就已被大量用于骨关节炎的治疗。研 于浓盐酸的大量使用会带来严重的环境问题, 将逐
究表明, 它能够有效作用于软骨组织治疗风湿性关 步受到国家相关政策的限制 ; 酶解法是利用壳聚糖
节炎[7,8], 其次对白血病癌细胞具有抑制作用, 并 酶对虾蟹壳进行降解, 现在面临的最大问题是生产
基金项目 : 国家“863 计划” 项目(2012AA021504)
作者简介 : 王升, 男, 硕士研究生, 研究方向 : 发酵工程 ;E-mail :wangshengshow@sina.com
通讯作者 : 李丕武, 男, 副教授, 研究方向 : 发酵工程 ;E-mail :piwuli@126.com
69 2014年第1期 王升等 : 利用发酵法生产氨基葡萄糖的研究进展
效率低下, 表现为壳聚糖酶价格较高、转化时间较
长及生产成本较高。且来源于虾蟹壳的 GlcN 在临床
应用过程中会引起过敏体质患者的过敏反应[13]。所
以微生物发酵法生产 GlcN 得到了越来越多研究者的
关注。相较于酸水解法与酶解法, 微生物发酵法生
产 GlcN 具有以下优点 : 消除了地域季节对原料来源
的限制, 产品无鱼腥味 ; 生产周期短, 强度高 ; 对
环境污染较小 ; 不产生过敏反应[14]。
目前, 国内外对微生物发酵法生产 GlcN 的研究
相对较少,相关产业尚未形成工业化生产规模。所以,
着重对微生物代谢产 GlcN 的合成途径、霉菌发酵产
GlcN 及工程菌发酵产 GlcN 等方面进行了概述, 并
对微生物发酵法生产 GlcN 的研究方向进行了展望,
以期对相关研究起到积极的推动作用。
1 GlcN 生物合成途径
在生物体内 GlcN 通过氨基己糖途径( 图 1) 合
GlcN
synthase
GlcN6P
GlcN1P
GlcNAc6P
GlcNAc1P
IN
e mutase
Peptidoglycan(bacteria)
Polysaccharides
Chitin(fungal cell wall)
Glycoproteins(mammalian)
Glucosamine-1P
N-acetyltransferase
UDP-GlcNAc
Glucosamine-6P
N-acetyl glucosamine-1P
uridyltransferase
Glc GlcNAc
OUT Membrane
Glc6P
Fru6P
Glucosamine-6P
deaminase
Phosphoglucosamin
Glucosamine-6P
N-acetyltransferase
Phosphoacetylgluco
samine mutase
Mannoproteins
Proteoglycans
Glc :glucose ;Glc6P :glucose-6-phosphate ;Fru6P :fructose-6-phosphate ;GlcN :glucosamine ;GlcN6P :glucosamine-6-
phosphate ;GlcNAc1P :N-acetylglucosamine-1-phosphate ;UDP-GlcNAc :UDP- N-acetylglucosamine.
Glucosamine-6P synthase(glmS,gfa1 or gfat1 depending on its bacterial fungal or mammalian origin),Glucosamine-6P
deaminase(nagB in prokaryotes,nag1 in eukaryotes),Phosphoglucosamine mutase(glmM),Glucosamine-1P N-acetyltransferase
(GlmU),Glucosamine-6P N-acetyltransferase(GNA1),Phosphoacetylglucosamine mutase(AGM1),N-acetylglucosamine-1P
uridyl transferase(glmU in prokaryotes,UAP1 in eukaryotes).
In prokaryotes,the pathway follows the order Glc6P,Fru6P,GlcN6P,GlcN1P,GlcNAc1P,UDP-GlcNAc.In eukaryotes,it
follows the order Glc6P,Fru6P,GlcN6P,GlcNAc6P,GlcNAc1P,UDP-GlcNAc.
图 1 氨基葡萄糖生物合成途径
成, 此途径起始于糖酵解产生的 Fru6P 。Fru6P 在
磷酸氨基葡萄糖合成酶, 也称为谷氨酰胺磷酸果糖
氨基转移酶(Glutamine fructose-6P amidotransferase,
GAT) 作 用 下 转 化 为 GlcN6P[15]。 对 于 细 菌 与 真
菌, 磷酸氨基葡萄糖合成酶为重要的限速酶分别
由 glmS 与 gfa1 编码。磷酸氨基葡萄糖合成酶位于
氨基糖生物合成的起始位置, 控制着氨基糖生物合
成途径, 所以有必要对磷酸氨基葡萄糖合成酶进行
深入研究[15,16]。对大肠杆菌(Escherichia coli) 与
假丝酵母(Candida albicans) 的研究表明, 磷酸氨
基葡萄糖合成酶是 L-谷氨酰胺依赖性氨基转移酶
(L-glutamine-dependent amidotransferases,GATs) 家
族的一员。GATs 催化 L-谷氨酰胺上的氨基氮转移
到相应受体上[15]。对融合酶进行的生物化学以及 X-
射线晶体衍射分析进一步揭示了 GATs 的生物化学
特性及物理特性[15]。磷酸氨基葡萄糖合成酶催化过
70 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期
程中, 通过酶上的微小通道将 L-谷氨酰胺上的氨基
转移至 Fru6P[17], 且获得的催化过程中结构域的晶
体结构, 为阐明磷酸氨基葡萄糖合成酶的催化过程
奠定了理论基础[17]。GlcN6P 可在磷酸氨基葡萄糖
脱氨酶催化下转化为 Fru6P, 此步是生物体利用氨
基糖作为碳源的最重要途径, 即当胞内的 GlcN6P 含
量过高时,会有过量 Fru6P 生成进入糖酵解途径[18]。
磷酸氨基葡萄糖合成酶催化的反应是将 Fru6P 转化
为 GlcN6P,L-谷氨酰胺作为氨基氮的供体, 而磷酸
氨基葡萄糖脱氨酶与磷酸氨基葡萄糖合成酶的催化
反应方向相反, 它催化 GlcN6P 转化为 Fru6P 与氨
基[19]。磷酸氨基葡萄糖脱氨酶序列的分析表明磷酸
氨基葡萄糖脱氨酶是 3 个簇组成的超家族蛋白, 具
有一定的多样性与复杂性[20]。而相关研究报道了
对来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 的磷酸
氨基葡萄糖脱氨酶进行三维结构及动力学分析的研
究, 则揭示了磷酸氨基葡萄糖脱氨酶的物理化学性
质[21]。GATs 催化生成的 GlcN6P 在下游两种酶的
作用下生成 GlcNAc1P 后,1-磷酸乙酰尿苷转移酶
催 化 GlcNAc1P 生 成 UDP-GlcNAc 。UDP-GlcNAc 可
形成细菌细胞壁的肽聚糖, 革兰氏阴性菌的脂多糖
以及真菌细胞壁中的几丁质[15]。对于细菌与真菌,
GlcN 生物合成途径的不同之处在于上述两种酶的差
异。细菌中为避免生成的 GlcN6P 转化为 Fru6P 以
及 GlcN6P 自身对细胞的毒害作用, 在磷酸氨基葡
萄糖变位酶[22]的作用下 GlcN6P 被转化为 GlcN1P 。
GlcN1P 又在磷酸氨基葡萄糖酰基转移酶催化下生成
GlcNAc1P 。GlcNAc1P 对细胞无毒害作用, 则消除了
对细胞的不利影响[23]。因此, 磷酸氨基葡萄糖变位
酶是细菌细胞内合成 UDP-GlcNAc 的关键酶[24,25]。
研究表明, 磷酸氨基葡萄糖变位酶的编码基因发生
突变将影响细菌细胞的正常生长, 形态学特征以及
对青霉素的敏感性[25]。目前, 对来源于大肠杆菌、
绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡
萄球菌(Staphylococcus aureus) 等的磷酸氨基葡萄
糖变位酶进行的研究进一步表明, 将磷酸氨基葡萄
糖变位酶编码基因敲除后, 细胞毒性会降低, 对抗
生素的相容性增加。而在真菌细胞内,GlcN6P 依
次在 6-磷酸氨基葡萄糖乙酰转移酶与磷酸乙酰氨基
葡萄糖变位酶催化下最终也转化为 GlcNAc1P[26]。
据研究报道, 在细胞膜上还存在控制磷酸化 GlcN 及
乙酰化 GlcN 进出细胞的载体蛋白, 若能够通过基因
工程手段, 控制此载体蛋白的运载功能, 则对于提
高发酵法生产的 GlcN 在胞外的累积量至关重要[15]。
GlcN 的代谢过程是多种酶参与的催化过程。如何有
效控制代谢过程中的酶, 是微生物代谢工程研究的
重要内容, 所以利用多基因表达的控制策略进行微
生物代谢产 GlcN 的研究将对发酵法生产 GlcN 起到
积极的推动作用[27]。在构建高产 GlcN 工程菌过程中,
对关键酶基因进行过量表达或对抑制基因进行失活
处理, 将有可能提高目的产物的量。
Glucosamine-6P synthase
D-fructose-6P + L-glutamine L-glutamate + D-glucosamine-6P
H2O NH2
Glucosamine-6P D-fructose-6P
Glucosamine-6P deaminase
Phosphoglucosamine mutase
Glucosamine-6P Glucosamine-1P
图 2 磷酸氨基葡萄糖合酶、磷酸氨基葡萄糖脱胺酶 及磷
酸氨基葡萄糖变位酶的催化反应
2 霉菌发酵产 GlcN
用于 GlcN 发酵研究的霉菌包括根霉、毛霉及曲
霉。霉菌是真菌的一个大类, 霉菌细胞壁中的几丁
质含量相对较高, 因而霉菌成为 GlcN 研究的重要菌
种。据相关报道, 野生型的毛霉(Monascus pilosus)
发酵产 GlcN 的量只有 264 mg/L[1]。但由于运用野
生型菌株进行发酵生产具有稳定性好, 发酵条件易
控制等优势, 使得霉菌发酵产 GlcN 的研究得到重
视。研究表明曲霉(Aspergillus sp.BCRC31742)、毛
霉(Monascus pilosus BCRC31527) 及根霉(Rhizopus
oligosorus BCRC 31996) 产 GlcN 的 能 力 逐 步 递 减,
对 发 酵 条 件 进 行 优 化 后 Aspergillus sp.BCRC31742
产 GlcN 的 量 可 达 到 3.43 g/L[1]。 所 以 Aspergillus
sp.BCRC31742 被广泛用作发酵产 GlcN 的原始菌株。
在霉菌发酵过程中, 由于菌丝球会使发酵液黏度增
大, 搅拌速度与溶氧率就变得至关重要, 因其直接
影响氧的传递及发酵产物的量[28,29]。Zhang 等[28]
以 Aspergillus sp.BCRC31742 为发酵菌株, 研究了溶
氧对 GlcN 产量的影响。通过对不同溶氧条件下产
71 2014年第1期 王升等 :利用发酵法生产氨基葡萄糖的研究进展
GlcN 的动力学分析,发现通过二级溶氧控制,可有
效提高 GlcN 的产量。不但溶氧能够影响发酵产物
的水平,发酵时菌丝体形态及刺激因子也会对发酵
过程产生较大影响。相关研究通过对 Aspergillus sp.
BCRC31742 菌株进行产 GlcN 深层发酵,控制霉菌菌
丝球的大小与刺激因子的种类提高了 GlcN 的产量,
在菌丝球直径为 2.15 mm,50 mL 装液量(250 mL
发酵摇瓶),30℃,200 r/min.,pH7.0 条件下发酵 5
天 最高生物量达到 33.82 g/L,GlcN 的浓度达到 7.05
g/L[30]。并发现甲醇相对于谷氨酸、放线菌酮及乙
醇对 GlcN 的产量具有明显的提升作用,当甲醇的添
加量为 1.5%(V/V)时,GlcN 的最大浓度达到 7.48
g/L[30]。在提取工艺方面,利用霉菌发酵产 GlcN 的
提取过程是对霉菌发酵产生的含有大量几丁质的菌
丝体进行酸碱降解,获得游离的 GlcN,所以此过
程的关键是控制好酸水解过程[31](图 3 。但在菌
丝体处理过程中,涉及到酸与碱的使用,酸与碱的
过量使用会对环境造成不利影响。使用几丁质酶代
替酸碱处理成为越来越迫切的需要。表 1 列出了近
些年霉菌发酵产 GlcN 研究的部分成果。Aspergillus
sp.BCRC31742 作为重要的产 GlcN 菌株,随着研究
的深入,有望成为高产 GlcN 的优良工业菌株。
Fungal Dry Biomass
The Treatment of Mild Base 1-4% NaOH
The Treatment ofAggressive Acid 17-20% HCI
Obtain Solution GlcN composition
Crystallize GlcN
Retain crystallized GlcN composition
Pure GlcN
图 3 霉菌发酵产 GlcN 的菌丝体处理流程
表 1 霉菌发酵产 GlcN 的研究
GlcN 浓度 GlcN 对菌丝干重占比 GlcN 产率 GlcN 对碳源占比
菌种 参考文献
(g/L) (mg/g DCW) (mg/(L h)) (mg/g carbon)
Rhizopus oligosporus
NRRL 2710
- 0.11 - - [32]
Aspergillus sp. - 24.10 - - [33]
Monascus pilosus 0.26 - - 13.20 [34]
Aspergillus sp. BCRC
31742
3.43 185.00 20.40 137.00 [1]
Monascus pilosus
BCRC31527
0.72 40.40 4.28 35.90 [1]
Rhizopus oligosporus
BCRC 31996
0.40 188.00 2.34 13.20 [1]
Rhizopus oryzae ATCC 20344 - 160.00 - - [35]
Aspergillus sp. BCRC
31742
7.05 210.00 58.73 210.00 [30]
Aspergillus sp. BCRC
31742
7.48 260.00 62.33 220.00 [30]
Aspergillus sp. BCRC
31742
14.37 338.00 - - [28]
大肠杆菌高产 GlcN 工程菌的构建及发酵 者已对大肠杆菌进行了构建工程菌研究,并对大肠
就目前发酵法生产 GlcN 的研究状况来看,工程 杆菌中氨基糖代谢途径、代谢过程中涉及的酶及对
菌发酵在产量上相对于野生菌具有明显优势。研究 应的编码基因进行了深入研究
[26](图 4 。
3
72 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期
Peptidoglycan
IN
GlcNAc1P
(glmU)
GlcN1P
N-acetyltransferase
UDP-GlcNAc
mine Mutase
(glmM)
(manXYZ)
IIGlc
(ptsG)
IIMan
(manXYZ)
IINag
(nagE)
(ptsG)
GlcNAc6P
(nagA) (GNA1)
(glmS)
(nagB)
GlcN6P
GlcNAc1P
Lipid A
Uridyltransferase
GlcN1P
Phosphoglucosa
IIMan
IIGlc
GlcNAc6P
Deacetylase
GlcN6P
N-acetyltransferase
GlcN6P Synthase
GlcN6P Deaminase
G l c 6 P :g l u c o s e -6 -p h o s p h a t e ;F r u 6 P :f r u c t o s e -6 -p h o s p h a t e ;G l c N :
g l u c o s a m i n e ;G l c N 6 P :g l u c o s a m i n e - 6 - p h o s p h a t e ;G l c N A c 1 P :
N-acetylglucosamine-1-phosphate ;UDP-GlcNAc :UDP- N-acetylglucosamine ;
IIGlc :glucose transporter(ptsG);IINag :GlcNAc-specific transporter(nagE);
IIMan :mannose transporter(manXYZ)
图 4 大肠杆菌中 GlcN 的代谢途径
通过对大肠杆菌氨基己糖代谢途径进行修饰,
即对酶的编码基因进行过量表达、失活或敲除处理,
构建高产 GlcN 的工程菌,可以有效提高 GlcN 的产量。
由于 GlcN6P 强烈抑制 glmS 的活性, 且若在胞内大
量积累则对细胞有毒害作用, 而 GlcNAc 的性质较稳
定, 对代谢过程无抑制作用, 在酸性条件下可水解
Glucose
GlcNAc
GlcN
OUT
为 GlcN, 所以在胞内过量表达 GNA1, 使 GlcNAc 大
Glc6P 量积累, 再对 GlcNAc 进行酸水解处理, 即可获得
GlcN 。Deng 等[26]通过过量表达 glmS 及对分解代
谢基因 nagB 进行失活处理将 GlcN 的产量提高到 17
g/L, 并 研 究 了 酿 酒 酵 母(Saccharomyces cerevisiae)
的 GNA1 在大肠杆菌中的过量表达, 使 GlcNAc 产量
Fru6P
达到 110 g/L 以上。同时, 研究发现 GlcN 与 GlcNAc
从胞外向胞内转运依靠的是甘露糖磷酸转移系统
(IIMan,mannose transporter), 由 manXYZ 操纵子编码。
manXYZ 操纵子由 X 、Y 和 Z 三个基因构成, 其中
manX 的缺失对甘露糖特异性磷酸转移复合酶活性影
响较大。如果将 manX 从基因组中敲除可阻断 GlcN
与 GlcNAc 从胞外向胞内转运, 提高 GlcN 与 GlcNAc
在胞外的积累量[15,26]。国内江南大学的陈欣等[14]
将 glmS 与 GNA1 导入大肠杆菌过量表达, 获得了一
株高产 GlcN 及 GlcNAc 工程菌, 并运用 Red 同源重
组技术敲除 nagE 与 manX, 研究其对发酵产 GlcN
的影响。nagE 与 manX 双基因敲除菌株培养 10 h 后,
GlcN 产量达到最大值 4.82 g/L,GlcNAc 产量达到
最大值 118.78 g/L 。这表明 nagE 与 manX 基因的敲
除可显著降低 GlcN 与 GlcNAc 向胞内的转运, 提高
GlcN 与 GlcNAc 在胞外的量积量[14]。在提取工艺方
面, 利用工程菌发酵生产 GlcN 的提取方法与霉菌发
酵的提取方法的区别在于工程菌发酵产生的 GlcN 与
GlcNAc 存在于发酵液中。利用离子交换法从发酵液
中提取 GlcN 被认为是较理想的方法[36,37]。表 2 概括
表 2 工程菌发酵产 GlcN 的研究 *
菌种 基因 修饰 目的
最大浓度(g/L)
参考文献
GlcN GlcNAc
E.coli-glmS-GNA1
E.coli-glmS-GNA1
E.coli-glmS-GNA1
E.coli-glmS-GNA1
E.coli-glmS-GNA1-∆nagE
E.coli-glmS-GNA1-
∆nagE-∆manX
glmS,GNA1, Over-expression,
nagB Deletion
glmS,GNA1 Over-expression
glmS,GNA1 Over-expression
glmS,GNA1 Over-expression
glmS,GNA1, Over-expression,
nagE Deletion
glmS,GNA1, Over-expression,
nagE,manX Deletion
Increase the pool of GlcN6P and GlcNAc6P
Delete nagB to reduce GlcN6P be catalyzed to Fru6P
Increase the pool of GlcN6P and GlcNAc6P
Increase the pool of GlcN6P and GlcNAc6P
Increase the pool of GlcN6P and GlcNAc6P
Increase the pool of GlcN6P and GlcNAc6P
Delete nagE to reduce extracellular GlcNAc be
transported to intracellular as carbon source
Increase the pool of GlcN6P and GlcNAc6P
Delete nagE and manX to reduce extracellular
GlcN and GlcNAc be transported to intracellular,
respectively
17.00 110.00 [2]
37.88 35.01 [38]
35.10 34.56 [39]
4.06 41.46 [14]
4.38 71.80 [14]
4.82 118.78 [14]
* glmS : 氨基葡萄糖合酶编码基因 ;GNA1 :N- 乙酰氨基葡萄糖转移酶编码基因 ;nagB : 氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因 ;nagE :N- 乙酰氨基葡萄糖转运子编码
基因 ;manX : 甘露糖转送子编码基因
73
4
2014年第1期 王升等 : 利用发酵法生产氨基葡萄糖的研究进展
了近几年国内外工程菌发酵产 GlcN 的研究状况, 相
信随着研究的深入,GlcN 的产量还将得到大幅提高。
展望
目前, 发酵法产 GlcN 的研究集中在霉菌发酵与
重组大肠杆菌研究上, 已对 Aspergillus sp.BCRC31742
菌株发酵产 GlcN 进行了深入的研究, 并且国内外已
构建成功了几株高产 GlcN 的大肠杆菌工程菌。笔
者认为今后的研究重点主要有以下几个方面, 第一,
有效利用现有的 Aspergillus sp.BCRC31742 菌株进行
微生物代谢工程研究, 如利用基因工程技术对菌种
代谢过程进行控制, 将酿酒酵母中的 GFA1 整合到
Aspergillus sp.BCRC31742 的基因组中, 从而有效提
高 GlcN 的产量。第二, 对 Aspergillus sp.BCRC31742
菌株进行诱变研究, 以 HNO2 -UV 与 UV-5BU 复合处
理, 筛选出优良的适合工业生产的 GlcN 产生菌。第
三, 现有的大肠杆菌工程菌在 GlcN 的产量上表现出
明显优势, 有必要加大对大肠杆菌基因工程菌的研
究, 如在原有高产 GlcN 工程菌内过量表达磷酸葡萄
糖异构酶, 催化糖酵解途径中的 Glc6P 大量转化为
Fru6P, 使过量的 Fru6P 流入 GlcN 合成途径, 进一
步提高 GlcN 的产量。但大肠杆菌不是公认的安全生
产菌种, 且易受噬菌体感染。所以, 枯草芽孢杆菌
工程菌与酿酒酵母工程菌将成为 GlcN 研究的重要方
向。第四, 重视 GlcN 发酵的下游提取工艺研究, 提
高 GlcN 的得率与纯度。相信随着市场对 GlcN 需求
量不断增加, 人们环保意识逐步增强, 微生物发酵
法生产 GlcN 的研究将受到越来越多的关注。随着研
究的深入, 微生物发酵法将会成为最有前景的 GlcN
工业化生产方法。
参 考 文 献
[1]Hsieh JW, Wu HS, Wei YH, et al. Determination and kinetics of
producing glucosamine using fungi[J].Biotechnology Progress,
2007, 23(5):1009-1016.
[2]Deng MD, Severson DK, Grund AD, et al. Metabolic engineering
of Escherichia coli for industrial production of glucosamine and
N-acetylglucosamine[J].Metabo Eng, 2005, 7(3):201-214.
[3]Subramanyam C, Rao SLN. An enzymic method for the determination
of chitin and chitosan in fungal cell walls[J].Journal of Biosciences,
1987, 12(2):125-129.
[4]Dahmer S, Schiller RM. Glucosamine[J].American Family
Physician, 2008, 78(4):471-476.
[5]Anderson JW, Nicolosi RJ. Glucosamine effects in humans :a review
of effects on glucose metabolism, side effects, safety considerations
and efficacy[J].Food Chem Toxicol, 2005, 43(3):187-201.
[6]Reginster JY, Deroisy R, Rovati LC, et al. Long-term effects of gluco-
samine sulphate on osteoarthritis progression :a randomised, plac-
ebo-controlled clinical trial[J]. Lancet, 2001, 357 :251-256.
[7]Nakanura H.Application of glucosamine on human disease—
Osteoarthritis[J].Carbohydrate Polymers, 2011, 84(2):835-
839.
[8]Mennini T.Controversy on glucosamine[J].Nutrafoods, 2012, 11 :
37-41.
[9]Sachadyn P, Jedrzejczak R, Milewski S, et al. Purification to
homogeneity of Candida albicans glucosamine-6-phosphate synthase
overexpressed in Escherichia coli[J].Protein Expression and
Purification, 2000, 19(3):343-349.
[10]Teplyakov A, Leriche C, Obmolova G, et al. From Lobry de Bruyn
to enzyme-catalyzed ammonia channelling :molecular studies of
D-glucosamine-6P synthase[J].Nat Prod Rep, 2002, 19 :60-69.
[11]Sashiwa H, Fujishima S, Yamano N. Production of N-acetyl-D-gluco-
samine from α-chitin by crude enzymes from Aeromonas hydrophila
H-2330[J].Carbohydr Res, 2002, 337(8):761-763.
[12]Kuk JH, Jung WJ, Jo GH. Production of N-acetyl-β-D-glucosamine
from chitin by Aeromonas sp. GJ-18 crude enzyme[J].Applied
Microbiology and Biotechnology, 2005, 68(3):384-389.
[13]Donzelli BG, Ostroff G, Harman GE. Enhanced enzymatic
hydrolysis of langostino shell chitin with mixtures of enzymes from
bacterial and fungal sources[J].Carbohydrate Research, 2003,
338(18):1823-1833.
[14] 陈欣 , 刘龙 , 李江华 , 等 . Red 同源重组敲除 nagE 和 manX 对
大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的影响[J]. 生物工程学报 ,
2012, 28(3):305-319.
[15]Durand P, Golinelli-Pimpaneau B, Mouilleron S, et al. Highlights of
glucosamine-6P synthase catalysis[J]. Archives of Biochemistry
and Biophysics, 2008, 474(2):302-317.
[16]Chevreux G, Atmanene C, Lopez P, et al. Monitoring the dynamics
of monomer exchange using electrospray mass spectrometry :the
case of the dimeric glucosamiine-6-phosphate synthase[J].
American Society for Mass Spectrometry, 2011, 22(7):431-439.
74 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期
[17]Mouilleron S, Badet-Denisot MA, Golinelli-Pimpaneau B. Glutamine
binding opens the ammonia channel and activates glucosamine-6P
synthase[J]. J Biolo Chem, 2006, 281(7):4404-4412.
[18]Uhde A, Youn JW, Maeda T, et al. Glucosamine as carbon source for
amino acid-producing Corynebacterium glutamicum[J]. Applied
Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(4):1679-1687.
[19]Tanaka T, Takahashi F, Fukui T, et al. Characterization of a novel
glucosamine-6-phosphate deaminase from a Hyperthermophilic Arc-
haeon[J]. J Bacteriol, 2005, 187(20):7038-7044.
[20]Vincent F, Davies GJ, Brannigan JA. Structure and kinetics of a
monomeric glucosamine 6-phosphate deaminase[J].The Journal
of Biologcal Chemistry, 2005, 280(20):19649-19655.
[21]Hu GJ, Li LF, Li D, et al. Protein preparation and preliminary X-ray
crystallographic analysis of a putative glucosamine 6-phosphate
deaminase from Streptococcus mutants[J]. Structural Biology and
Crystallization Communications, 2007, 63(9):809-811.
[22]Barreteau H, Kovac A, Boniface A, et al. Cytoplasmic steps of
peptidoglycan biosynthesis[J].FEMS Microbiology Reviews,
2008, 32(2):168-207.
[23]Mehra-Chaudhary R, Mick J, Beamer LJ. Crystal Structure of
Bacillus anthracis phosphoglucosamine mutase, an enzyme in the
peptidoglycan biosynthetic pathway[J]. Journal of Bacteriology,
2011, 193(16):4081-4087.
[24]Shimazu K, Takahashi Y, Karibe H, et al. Contribution of phosphog-
lucosamine mutase to determination of bacterial cell morphology in
Streptococcus gordonii[J]. Odontology, 2012, 100(1):28-33.
[25]Mehra-Chaudhary R, Mick J, Tanner JJ, et al.Quaternary structure,
conformational variability and global motions of phosphoglucosa-
mine mutase[J]. FEBS Journal, 2011, 278(18):3298-3307.
[26]Deng MD, Wassink S, Grunda A. Engineering a new pathway for
N-acetylglucosamine production-coupling a catabolic enzyme,
glucosamine-6-phosphate deaminase, with a biosynthetic enzyme,
glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase[J]. Enzyme and
Microbial Technology, 2006, 39(4):828-834.
[27] 姜天翼 , 李理想 , 马翠卿 , 等 . 微生物细胞工厂中多基因表达
的控制策略[J]. 生物工程学报 , 2010, 26(10):1419-1425.
[28]Zhang JX, Liu L, Li JH, et al. Enhanced glucosamine production
by Aspergillus sp. BCRC 31742 based on the time-variant kinetics
analysis of dissolved oxygen level[J].Bioresource Technology,
2012, 111(6):507-511.
[29]Bodizs L, Titica M, Faria N, et al. Oxygen control for an industrial
pilot-scale fed-batch filamentous fungal fermentation[J].Journal
of Process Control, 2007, 17(7):595-606.
[30]Sitanggang AB, Wu HS, Wang S, et al. Effect of pellet size and
stimulating factor on the glucosamine production using Aspergillus
sp. BCRC 31742[J].Bioresour Technol, 2010, 101 :3595-3601.
[31]Einbu A, Varum KM. Characterization of chitin and its hydrolysis to
GlcNAc and GlcN[J]. Biomacromolecules, 2008, 9(7):1870-
1875.
[32]Sparringa RA, Owens JD. Short communication :glucosamine
content of tempe mould, Rhizopus oligosporus[J].International
Journal of Microbiology, 1999, 47(2):153-157.
[33]Carter SB, Nokes SE, Crofcheck CL, et al.The in�uence of
environmental temperature and substrate initial moisture content
on Aspergillus niger growth and phytase production in solid
state cultivation[J].Transactions of the American Society of
Agricultural Engineers, 2004, 47(6):945-949.
[34]Yu KW, Kim YS, Shin KS, et al. Macrophage stimulating activity of
exo-biopolymer from cultured rice bran with Monascus pilosus[J].
Applied Biochemistry and Biotechnology, 2005, 126(4):35-48.
[35]Liao W, Liu Y, Frear C, et al. Co-production of fumaric acid and
chitin from a nitrogen-rich lignocellulosic material-dairy manure
using a pelletized filamentous fungus Rhizopus oryzae ATCC
2034[J].Bioresource Technology, 2008, 99(2):5859-5866.
[36] 梁芳 , 刘龙 , 李江华 , 等 . 离子交换法纯化氨基葡萄糖[J].
食品与发酵工业 , 2012, 38(5):213-217.
[37]Chmielowski RA, Wu HS, Wang SS. Scale-up of upstream and dow-
nstream operations for the production of glucosamine using micr-
obial fermentation[J].Biotechnol J, 2007, 2(2):996-1006.
[38]Chen X, Li u L , L i J H , et a l . I mpr o ved gl uc o s a m in e an d
N-acetylglucosamine production by an engineered Escherichia coli
via step-wise regulation of dissolved oxygen level[J].Bioresource
Technology, 2012, 110(2):534-538.
[39]Chen X, Liu L, Li JH, et al. Optimization of glucose feeding appro-
aches for enhanced glucosamine and N-acetylglucosamine produc-
tion by an engineered Escherichia coli[J]. J Ind Microbiol Biote-
chnol, 2012, 39(2):359-365.
(责任编辑 狄艳红)