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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
作为高效的动物疾病防治药物，泰乐菌素是一
种十分重要的 16 元大环内酯类畜禽用抗生素，是国
家规划重点发展的兽药产品［1］，其工业生产菌株是
弗氏链霉菌［2］。链霉菌发酵生产过程中易感染噬菌
体，严重影响菌体的生长和产物的合成，导致发酵
异常，造成严重损失。因此，分离弗式链霉菌噬菌
体并考察其生物学特性对泰乐菌素发酵生产中预防
收稿日期 ： 2014-04-25
作者简介 ：白宇，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物与基因工程 ；E-mail ：baiyu1119@163.com
通讯作者 ：苏建宇，男，博士，教授，研究方向 ：工业微生物 ；E-mail ：su_jy@nxu.edu.cn
一株弗氏链霉菌噬菌体的分离及其分子特性研究
白宇 徐春燕 苏建宇
（宁夏大学生命科学学院 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川 750021）
摘 要 ： 鉴定一株从泰乐菌素异常发酵液中分离出的烈性噬菌体 SF1 并研究其分子特性。采用双层平板法分离纯化弗氏链
霉菌的噬菌体 SF1，通过负染法电镜观察噬菌体 SF1 的大小和形态 ；测定噬菌体 SF1 对氯仿和异丙醇的敏感性分析其包膜结构 ；
通过 SDS-PAGE 分析噬菌体的结构蛋白 ；提取噬菌体基因组 DNA 进行限制性片段长度多样性分析。噬菌体 SF1 的噬菌斑直径约
11-15 mm，边缘整齐透明，为烈性噬菌体；SF1 为长尾型，头部为多面体，直径约 24-30 nm，尾长约 52-64 nm，尾宽约为 3-5 nm；
对氯仿和异丙醇不敏感，无包膜 ；基因组为双链 DNA，大小约为 35 kb ；至少含有 14 种相对分子量为 14.8-59.5 kD 的结构蛋白。
关键词 ： 弗氏链霉菌 噬菌体 泰乐菌素
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.028
Identification and Molecular Characterization of a Phage from
Streptomyces fradiae
Bai Yu Xu Chunyan Su Jianyu
（Key Laboratory of Ministry of Education for Conservation and Utilization of Special Biological Resources in the Western，School of Life Science，
Ningxia University，Yinchuan 750021）
Abstract: It was to identify and explore the molecular characterization of a phage SF1, which was isolated from Streptomyces fradiae
fermentation broth during the failed industrial production of tylosin. Phage SF1 was characterized by observing the shape of plaque, titering
on double-layer agar culture plate. The morphology of SF1 was observed by the electron microscopic observation after negative staining. The
sensitivity of the phage to chloroform and isopropyl alcohol was tested to detect its envelope. The structural proteins analysis of phage SF1 was
carried out by SDS-PAGE. Restriction fragment length polymorphism（RFLP）analysis of genomic DNA was further performed to characterize
the phage. Results showed that the plaque（11-15 mm in diameter）is neat and transparent. SF1 has a polyhedral head（about 24-30 nm in
diameter）and a long tail（about 52-64 nm long and 3-5 nm wide）. It is insensitive to chloroform and isopropyl alcohol. The genome of SF1
consists of double-stranded DNA and is approximately 35 kb. Capsid protein analysis shows a higher level of 14 major protein bands ranging from
14.8-59.5 kD, which is presumed to be the structural proteins of SF1.
Key words: Streptomyces fradiae Phage Tylosin
和控制噬菌体感染具有非常重要的意义。但是，目
前发酵工业生产中针对噬菌体感染的报道主要集中
在谷氨酸、乳酸、丙酮、丁醇等产品［3，4］，国内外
对泰乐菌素发酵生产过程中噬菌体感染与防治的研
究甚少，未见相关报道。
本研究针对从泰乐菌素异常发酵液中分离得到
的一株烈性噬菌体，对其分子特性进行研究，旨在
2014年第12期 169白宇等 ：一株弗氏链霉菌噬菌体的分离及其分子特性研究
为弗氏链霉菌噬菌体的防治提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 噬菌体来源 弗式链霉菌噬菌体 SF1 由本实
验室分离自泰乐菌素异常发酵液。
1.1.2 培养基和主要试剂 双层平板培养基 ：上层
高氏一号培养基（含 0.7% 琼脂），下层高氏一号培
养基（含 2% 琼脂），液体培养基：菌丝体培养基［5］，
SM 缓冲液［6］；限制性核酸内切酶 Xho I、BamH I、
Bgl II、Hind III、EcoR I 和 Xba I 购 自 Fermentas 公
司 ；DNase I、RNase A、蛋白酶 K 和饱和平衡酚购
自 Sigma 公 司。DL15 000 DNA marker、λ DNA/Hind
III marker 等核酸分子量标准购自 TaKaRa 公司。
1.2 方法
1.2.1 噬 菌 体 分 离 将 泰 乐 菌 素 异 常 发 酵 液 以
12 000 r/min 离心 5 min 去除菌体，取上清液经 0.22 μm
微孔滤膜过滤，滤液即为噬菌体原液，置于 4℃
保存。
将宿主弗氏链霉菌与噬菌体原液混合后利用双
层平板法［6］培养 48 h 后，挑取直径较大的噬菌斑
与已在液体培养基中培养至对数期的宿主菌液混合，
于 28℃，220 r/min 摇床中培养 48 h 后，12 000 r/min
离心 5 min 去除菌体，取上清液经 0.22 μm 微孔滤膜
过滤，再用双层平板法观察噬斑的形态。
1.2.2 噬菌体效价测定 纯化后的噬菌体悬液按 10
倍稀释法进行稀释，取适当稀释倍数的噬菌体液
100 μL 与弗氏链霉菌孢子悬液 100 μL 混匀，铺双层
平板，28℃培养 48 h 后计数噬菌斑。效价（pfu/mL）
= 噬菌斑数 × 稀释倍数 ×10。
1.2.3 噬菌体电镜形态学观察 噬菌体悬液经浓缩、
密度梯度离心和透析后制成高浓度噬菌体颗粒悬
液［6］，将该悬浮液制片后采用磷钨酸染色，自然干
燥后在透射电子显微镜（日立 H-7650）下观察噬菌
体形态。
1.2.4 噬菌体包膜分析 将噬菌体悬液 100 μL 加入
到 900 μL 氯仿中，摇匀后于 28℃分别作用 0.5、1.5、
3 h，静置分层后取上层水相部分测定噬菌体效价，
以未加氯仿的噬菌体悬液为对照。
将噬菌体悬液 100 μL 置于 900 μL 不同浓度的
异丙醇（50%、75%、100%）中，摇匀后于 28℃分
别作用 0.5、1.5 和 3 h，测定噬菌体效价，以未加异
丙醇的噬菌体悬液为对照。
1.2.5 噬菌体蛋白 SDS-PAGE 分析 将浓缩纯化的
噬菌体颗粒充分加热变性，于室温冷却后进行 SDS-
PAGE 电泳，分离胶和浓缩胶的浓度分别为 12% 和
4%。电压设定 90 V，待样品电泳至分离胶界面时，
调电压至 110 V，继续电泳至溴酚蓝指示剂达凝胶
下缘，停止电泳。凝胶以考马斯亮蓝染色 4 h，转入
脱色液脱色过夜后置于双蒸水中保存并摄像。
1.2.6 噬菌体核酸提取和定性 噬菌体核酸提取方
法参照文献［7］进行，略有改动。为测定核酸单双
链，按照文献［8］的方法将提取的噬菌体核酸置于
无菌 EP 管中，水浴加热，每升高 10℃，取 1 μL 核
酸检测其在 260 nm 处的吸光值，试验重复 3 次，并
绘制吸光值和温度的曲线图。
噬菌体核酸分别用 DNaseⅠ、RNase A 在 37℃
消化 1 h 后进行电泳观察结果。噬菌体核酸分别用 6
种限制性内切酶 Xho I、BamHⅠ、Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ、
EcoRⅠ和 XbaⅠ于 37℃酶切 5 h，根据酶切图谱鉴
定核酸近似大小。
2 结果
2.1 噬菌体SF1的噬菌斑特性
SF1 在双层平板上形成的噬菌斑（28℃倒置培
养 48 h）（图 1）显示，噬菌斑形态、大小基本一致，
直径约 11-15 mm，边缘整齐透明，为无晕环透明圆
斑，呈现典型的烈性噬菌体的噬菌斑特征。
图 1 弗氏链霉菌噬菌体 SF1 的噬菌斑
2.2 噬菌体SF1的电镜观察
纯化后的噬菌体 SF1 颗粒经负染后在透射电
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期170
镜下观察其形态，结果（图 2）显示，噬菌体 SF1
与大多数链霉菌噬菌体形态相似，为蝌蚪状噬菌
体，由多面体的头部和细长的尾部组成。头部直
径约为 24-30 nm，尾部相对细长，尾长约为 52-
64 nm，尾宽约为 3-5 nm。按照国际病毒分类委员
会（International Committee on Taxonomy of Viruses，
简称 ICTV）第 8 次报告的最新病毒分类系统的标
准［9］，噬菌体 SF1 从形态上分类属于长尾噬菌体科
（Siphoviridae）。
结果（图 5）显示，在凝胶上出现了 14 条蛋白质条
带。根据文献报道，纯化的噬菌体颗粒 SDS-PAGE
电 泳 图 谱 上 清 晰 可 见 的 往 往 是 噬 菌 体 的 结 构 蛋
白［10］。经 Quantity One 软件分析，蛋白的相对分子
量在 14.8-59.5 kD 之间，其中 14.8、16.0 和 34.6 kD
对应的 3 条带最明显，提示 14.8、16.0 和 34.6 kD 所
对应的 3 种蛋白含量较高，可能是噬菌体 SF1 的主
要衣壳蛋白。
2.5 噬菌体SF1的核酸类型分析
核酸酶对核酸的水解特征可用来判断核酸类
型。提取噬菌体 SF1 的基因组并分别用 DNase Ⅰ和
RNase A 消化，结果表明其核酸可被 DNase Ⅰ消化，
而不能被 RNase A 消化（图 6），说明噬菌体 SF1 的
核酸类型为 DNA。这与目前已在 GenBank 上登录的
另外 14 株链霉菌噬菌体核酸类型一致。
双链 DNA 加热变性时双螺旋解链会使其在 260
nm 处吸光值增高，称之为 DNA 链的“增色效应”
（Hyperchromic effect）［8］。 噬 菌 体 SF1 的 基 因 组 在
100 nm
图 2 噬菌体颗粒电镜（30 000×）
2.3 噬菌体SF1的包膜分析
有些噬菌体在核衣壳之外具有包膜，包膜来
源于宿主细胞膜，由脂类和蛋白质组成，对氯仿等
有机溶剂敏感，因此可以通过检测噬菌体对氯仿的
敏感性研究噬菌体是否具有包膜。用高比例氯仿处
理噬菌体 SF1，一段时间后测定噬菌体效价，结果
（图 3）显示，与对照相比，用氯仿处理噬菌体 0.5-
3 h 后，噬菌体的效价均处在同一数量级内。将试验
组与对照组数据两两进行显著性差异分析，结果表
明试验组和对照组的噬菌体效价相比无显著性差异
（α=0.05），说明噬菌体 SF1 对氯仿不敏感，推测噬
菌体 SF1 的核衣壳外无脂质包膜。
通常异丙醇对亲脂性病毒灭活效果好，而对亲
水性病毒效果较差。噬菌体 SF1 对异丙醇的抗性如
图 4 所示，噬菌体 SF1 经异丙醇处理不同时间后下
降 1-4 个数量级，说明噬菌体 SF1 对异丙醇有一定
的敏感性，但并不能使噬菌体 SF1 完全灭活。推测
噬菌体 SF1 的重要组成部分可能不含脂质，符合细
菌病毒 dsDNA 病毒、尾病毒目噬菌体的特点。
2.4 噬菌体SF1结构蛋白分析
将高浓度噬菌体颗粒进行 SDS-PAGE 电泳分析，
30 90 180ᰦ䰤 min 0024
6
8
10
᭸ԧ logPFU/mL
图 3 氯仿对噬菌体 SF1 效价的影响
20 40 60 80
3 h
1.5 h
0.5 h
100ᔲщ䞷⎃ᓖ % 0024
6
8
10
᭸ԧ logPFU/mL
图 4 异丙醇对噬菌体 SF1 效价的影响
2014年第12期 171白宇等 ：一株弗氏链霉菌噬菌体的分离及其分子特性研究
260 nm 的吸光值随温度的变化如图 7 所示，当温度
的升高到 80℃-90℃时，噬菌体 DNA 溶液在 260 nm
处吸光值显著增高，说明噬菌体 SF1 的基因组类型
为 dsDNA。具备 dsDNA 病毒中的尾病毒目长尾病毒
科的特征，并与按照形态初步分类的结果相同。
噬菌体 SF1 基因组经 XhoⅠ、BamHⅠ、Bgl Ⅱ、
Hind Ⅲ、EcoR I 和 Xba I 六种限制性内切酶酶切后
经琼脂糖凝胶电泳分析表明，噬菌体 SF1 基因组具
有 XhoⅠ、BamHⅠ、Bgl Ⅱ和 Hind Ⅲ的多个酶切位
点，但不具有 EcoRⅠ和 XbaⅠ的酶切位点（图 8）。
噬菌体 SF1 的基因组能够被 XhoⅠ切割成 3 个片段 ；
被 BamHⅠ切割成 4 个片段 ；被 Bgl Ⅱ切割成 4 个
片段 ；被 Hind Ⅲ切割成至少 4 个片段。由于这 4 种
限制性内切酶能够识别并切割双链 DNA 分子特定
的核苷酸序列，所以进一步证明了噬菌体 SF1 核酸
类型为双链 DNA，与迄今所报道的链霉菌噬菌体情
况一致。噬菌体 SF1 的基因组酶切图谱与已发表的
其它链霉菌噬菌体 DNA 的酶切图谱类型有较大差
异［11-15］，酶切图谱显示噬菌体 SF1 很有可能是一株
未报道的新噬菌体。在已知的链霉菌噬菌体中，其
基因组大多具有 EcoR I 酶切位点而没有 XhoⅠ酶切
位点，且其他 3 种限制性内切酶的酶切图谱与噬菌
体 SF1 的酶切结果也有很大差异 ；只有金色链霉菌
噬菌体 μ1/6 的基因组有 XhoⅠ酶切位点，但酶切片
段大小与噬菌体 SF1 的不相同，而且噬菌体 μ1/6 的
基因组不能被 Hind Ⅲ酶切，噬菌体 SF1 的基因组则
可以。
14.8
16
18.4
22
23.7
25.4
31.5
34.6
37.6
46.2
48.2
52
55.8
59.5
M
117
85
49
34
25
19
1 2 3 4 5
kD kD
M ：蛋白质分子量标准 ；1-5 ：噬菌体蛋白质样品
图 5 噬菌体 SF1 结构蛋白的 SDS-PAGE 分析
M1 M2
15000
bpbp
23130
9416
6557
4361
2322
2027
10000
7500
5000
2500
1000
250
1 2 3
M1 ：λDNA/Hind Ⅲ Marker ；1 ：未处理 ；2 ：DNase I 消化 ；3 ：RNase A 消化 ；
M2 ：DNA DL15 000 Marker
图 6 噬菌体基因组经核酸酶消化电泳图
8
7
6
5
4
3
2
1
30 40 50 60ᓖ ć ੨ݹ٬ 26
0
nm
70 80 90
图 7 不同温度下噬菌体基因组在 260 nm 的吸光值
M1 M2
15000
bpbp
23130
9416
6557
4361
2322
10000
7500
5000
2500
1 2 3 4 5 6 7
M1：λDNA/Hind Ⅲ Marker；1：噬菌体基因组；2：Xho l 酶切；3：BamH I 酶切；
4 ：Bgl Ⅱ酶切 ；5 ：Hind Ⅲ酶切 ；6 ：EcoR Ⅰ酶切 ；7 ：Xba l 酶切 ；M2 ：
DNA DL15 000 marker
图 8 噬菌体 SF1 基因组限制性酶切图谱
用 λ DNA/Hind Ⅲ酶切片段作为分子量标准，经
XhoⅠ、BamHⅠ、Bgl Ⅱ和 Hind Ⅲ酶切后得到不同
片段的分子量相加，初步计算噬菌体 SF1 基因组分
子量约为 35 kb。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期172
3 讨论
近年来，随着人们对链霉菌噬菌体研究工作的
日益重视，研究内容已由早期的分离鉴定逐渐发展
为对其基因组学和功能基因组学的深入研究。目前
在 GenBank 中登录基因组信息的链霉菌噬菌体有 14
株，其寄主分别为阿维菌素链霉菌、变铅青链霉菌、
金色链霉菌、天蓝色链霉菌、委内瑞拉链霉菌等，
核酸类型全部为双链 DNA。与以 λ 噬菌体为代表的
大肠杆菌噬菌体、乳酸菌噬菌体以及分支杆菌噬菌
体的研究相比，目前对链霉菌噬菌体，尤其是工业
链霉菌噬菌体的研究仍远远落后。因此，任何新的
链霉菌噬菌体的分子特性研究都具有重要的学术意
义。新的链霉菌噬菌体基因组信息也将有助于我们
研究噬菌体宿主的相互交叉作用、开发链霉菌属遗
传交换分析的分子工具以及开展辅助链霉菌属的分
类分群工作［16］。
通过对分离出的弗氏链霉菌噬菌体分子特性的
研究并查阅相关文献［11-15］，发现噬菌体 SF1 与已发
现的链霉菌噬菌体在形态特征和核酸酶切特性上均
有所差异，因此噬菌体 SF1 很可能是一株未经报道
的新噬菌体。为全面认识弗氏链霉菌噬菌体 SF1 的
遗传背景、基因调控方式以及与其宿主菌之间的相
互关系，全基因组测序工作非常必要，相关研究正
在开展。
4 结论
本研究首次分离出一株以弗氏链霉菌为宿主的
噬菌体 SF1，经鉴定其为烈性噬菌体，属于 dsDNA
病毒中的尾病毒目长尾病毒科。SF1 的基因组大小
约为 35 kb，至少含有 14 种结构蛋白，与已发现的
链霉菌噬菌体在形态特征和核酸酶切特性上均有一
定的差异。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）