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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
根结线虫是一类固着型内寄生植物病原线虫，
在很多国家和地区均有发生，每年给全世界的农林、
园艺等产业带来巨大的经济损失［1］。根结线虫病害
在我国发生极为普遍，粮食作物、蔬菜、果树、花
卉等 2 000 多种植物几乎均可受到侵染［2］，温带、
亚热带和热带地区遭受病害尤为严重，有时作物的
收稿日期 ： 2014-03-10
基金项目 ：国家“973”计划项目（2013CB127500），国家自然科学基金项目（31170062），国家“948”项目（2011-G25），公益性行
业科研专项（201403075），海南省重大科技项目（ZDZX2013023-1），中央级公益性科研院所基金项目（ITBB11-0302）
作者简介 ：陈雨晴，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物资源与利用 ；E-mail ：chenyuqingmz@126.com
通讯作者 ：鲍时翔，男，研究员，博士生导师，研究方向 ：微生物资源与利用 ；E-mail ：bsxitbb@ 163.com
1 株具有抗根结线虫活性的红树林土壤放线菌的
分离与鉴定
陈雨晴1，2  黄惠琴2  刘敏2  鲍时翔2
（1. 海南大学环境与植物保护学院，海口 570228 ；2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业部热带作物生物学与
遗传资源利用重点实验室，海口 571101）
摘 要 ： 采用平板稀释法，从海南省东寨港红树林根际土壤中分离得到 110 株放线菌 ；利用 24 孔板液体筛选模型，筛选出
具有抗线虫活性的放线菌菌株 HA10401。该菌株发酵液在稀释 20 倍和 40 倍时，抗根结线虫校正死亡率分别为 58.2% 和 52.6%。
通过 16S rDNA 基因序列分析，菌株 HA10401 与链霉菌属菌株 Streptomyces variabilis 同源性最高（99.8%），在系统发育树上聚在同
一分支内，亲缘关系最近。二者在形态特征、培养特征以及生理生化特征方面也基本一致，因此，鉴定菌株 HA10401 为变异链霉
菌（Streptomyces variabilis）。本研究首次报道了其抗根结线虫活性，值得进行更为深入的研究。
关键词 ： 红树林 放线菌 鉴定 根结线虫
Isolation and Identification of an Actinomycetes Strain Against Root-
knot Nematode from Mangrove Soil
Chen Yuqing1.2 Huang Huiqin2 Liu Min2 Bao Shixiang2
（1. College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228 ；2. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of
Tropical Crops of Agriculture Ministry，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou 571101）
Abstract: 110 Actinomycetes strains were isolated by plate dilution method and anti-root-knot nematode strain HA10401 was screened
by 24-well plate fluid model from mangrove soil in Dongzhaigang National Nature Reserve, Hainan Province. While the fermentation broth was
diluted by 20 times and 40 times, the mortality rates against nematode were 58.2% and 52.6%, respectively. Phylogenetic analysis based on the
16S rRNA gene sequence showed that strain HA10401 was closely related to Streptomyces variabilis with the highest similarity of 99.8%, and the
two strains formed a cluster in the phylogenetic tree. The morphological, cultural and biochemical characteristics were basically accorded with
Streptomyces variabilis. As a result, strain HA10401 was identified as Streptomyces variabilis, and its anti-root-knot nematode activity was first
reported in this study and worth further research.
Key words: Mangrove Actinomycetes Identification Root-knot nematode
减产量可达到 70% 以上［3］。根结线虫的防治非常困
难，传统的轮作、抗病育种方法并不能稳定、高效
地抵抗根结线虫，而常使用的化学方法则会造成严
重的环境污染［4］。因此，寻找一种比较科学的方法
来防治根结线虫极为重要，人们希望探索一些高效、
低毒、低残留并具有高选择性的杀线剂。近年来，
2014年第10期 175陈雨晴等：1株具有抗根结线虫活性的红树林土壤放线菌的分离与鉴定
生物防治越来越受到重视［5］，从微生物的代谢产物
中分离具有抗线虫活性物质已成为最具有潜力的防
治途径之一。
放线菌在自然界中广泛分布，且是抗生素的主
要来源，近几十年来具有生物活性的天然产物中，
45% 来自于放线菌［6］，它们能有效抑制某些危害
农作物的细菌、病毒和真菌等，被大量用于生物防
治［7］，其中由放线菌产生的阿维菌素（Avermectins）
已经在抗线虫方面得到了广泛的应用［8］。利用放线
菌的次生代谢产物制备无污染、无残留、可再生、
难以使线虫产生抗药性的新型杀线虫药剂，已经成
为未来农药的重点发展方向［9］。红树林作为一种分
布于热带和亚热带的特殊海岸潮间带生态系统，周
期性受潮水侵蚀，具有高水分、高盐分、寡营养等
特点，蕴含极为丰富且极具特色的微生物资源［10］，
近年来关于红树林抗线虫放线菌资源的开发已取得
了广泛的进展。魏华等［11］从海南东寨港红树林采
集的土壤样品中分离得到具有杀线虫活性的放线
菌 Saccharopolyspora jiangxiensis，在菌株发酵液稀释
20 倍后，抗根结线虫校正死亡率高达 70.5% ；黄惠
琴等［12］从该环境土壤样品中筛选出一株具有较强
抗根结线虫放线菌 Streptomyces aculeolatus，其抗根
结线虫活性也是首次被报道 ；Zeng 等［13］从放线菌
Streptomyces albogriseolus 中分离得到新型活性化合物
制霉色基素（Fungichromin B），进一步研究显示该
化合物具有广泛的抗虫谱。这些研究均表明了红树
林抗根结线虫放线菌资源的丰富性，大量潜在的高
效抗线虫资源还有待开发。本试验从海南文昌东寨
港红树林根际土壤中分离并筛选出具有高效抗根结
线虫活性的放线菌菌株，并对其进行形态、生理生
化和分子鉴定，旨为新型抗线虫药剂的进一步开发
提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土样的采集 于 2012 年 11 月从海南东寨港
的几种不同红树根际采集土壤样品，按照五点采样
法，分别采集 0-5、5-10、10-20 cm 深处的土壤样品，
混匀后装入无菌袋内，并置入冰盒中于 4 h 内带回
实验室处理。
1.1.2 培 养 基［14］ 分 离 培 养 基 ：腐 植酸-维 生 素
（HV）培养基、高氏一号培养基、淀粉-天门冬素
培养基，倒平板前向培养基中加入过滤除菌的 100
μg/mL 制霉菌素和 100 μg/mL 重铬酸钾，以抑制细菌
和真菌的生长 ；发酵培养基 ：酵母粉-淀粉液体培养
基（玉米粉 1.0%、酵母粉 0.1%、黄豆粉 1.0%、淀
粉 0.5%、KH2PO4 0.05%，pH7.2）。形态特征鉴定培
养基 ：高氏一号合成培养基、酵母粉 -淀粉培养基、
燕麦汁培养基（ISP3）、土豆汁培养基、无机盐淀粉
培养基（ISP4）和甘油天门冬素培养基（ISP5）。培
养基使用 70% 陈海水与 30% 蒸馏水配制。
1.1.3 供试线虫 初筛时使用松材线虫，将松材线
虫接种于长有镰刀菌的 PDA 培养基上，28℃恒温培
养 5 d ；复筛时使用根结线虫，将含有卵块的胡椒
根冲洗干净，使用灭菌牙签挑取卵块置于无菌水中
28℃培养孵化，收集备用。
1.2 方法
1.2.1 放线菌的分离 使用 3 种预处理方法（1）风
干 ：将采集的土壤样品自然风干 1 周 ；（2）干热 ：
风干样品 120℃干热处理 1 h ；（3）湿热 ：风干样品
55℃水浴 6 min。称取处理样品 5 g，加入灭菌陈海
水 45 mL，180 r/min 恒温震荡 30 min 制成水悬液，
室温静置 10 min 使土壤沉淀，使用无菌陈海水将上
清液稀释至 10-1、10-2、10-3 倍，各吸取 100 μL 稀释
液涂布到分离培养基上，每个稀释度 3 次重复。将
平板于 28℃下恒温培养 2-4 周，待长出明显菌落，
挑取菌落在高氏一号培养基上进行纯化，纯化菌株
用 20% 甘油冻存于 -80℃冰箱。
1.2.2 菌株的发酵培养 将纯化后的菌株挑取单菌
落接种于液体发酵培养基中，置于 28℃摇床中 200
r/min 培养约 7 d，10 000 r/min 离心 2 min 后，吸取
上清液备用。
抗线虫放线菌的筛选 线虫的初筛和复筛均采用
24 孔板液体筛选模型［15］。初筛时，在每孔中加入
400 μL（约 200 条）松材线虫液、550 μL 无菌水和
50 μL 发酵液，混合均匀，置于 28℃恒温培养箱中
培养 24 h 后用倒置显微镜观察，僵直或卷曲不动的
线虫视为被击倒，以发酵培养基为对照，每个试验
重复 3 次，计算校正击倒率和校正死亡率。向 24 孔
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期176
板中加入清水观察线虫恢复情况，不能恢复活性的
视为死亡。
校正击倒率（%）=（处理击倒率-对照击倒率）/
（1-对照击倒率）×100%
校正死亡率（%）= 校正击倒率 ×（1-恢复率）
对初筛中校正死亡率 80% 以上的菌株使用根结
线虫进行复筛，方法同上，并将活性菌株继代培养
5 代，测试菌株发酵液的抗线虫遗传稳定性。
1.2.3 发酵液处理时间对线虫活性的影响 在不同
的时间内（2、4、8、12 和 24 h）观察活性菌株的
发酵液对线虫的影响，计算校正击倒率和校正死
亡率。
1.2.4 菌株的形态和培养特征观察 形态特征 ：采
用插片培养法［16］观察菌株的形态特征，28℃培养
14 d，取出盖玻片分别在光学显微镜和电子显微镜
下观察菌株形态特征。培养特征 ：将菌株接种于放
线菌形态特征鉴定培养基上，28℃培养 7-15 d，并
记录菌株的气生菌丝、基内菌丝及色素产生情况等
特征。
1.2.5 菌株的生理生化鉴定 分别对菌株的碳源
利用、纤维素分解、H2S 产生、黑色素产生、硝酸
盐还原等方面进行生理生化测试［17］，并分别在 4、
10、15、20、28、37、40、45℃条件下进行温度耐
受性试验，分别在 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.0 的
pH 值下进行 pH 耐受性试验。以上测试均培养 20 d，
每 5 d 观察 1 次。
1.2.6 16S rDNA 序列分析和进化树的构建 使用细
菌基因组 DNA 提取试剂盒提取菌株的总 DNA，通
用引物 27f（5-AGAGTTTGATCMTGCCTCAG-3）和
1492r（5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3） 用 于
进行 PCR 扩增菌株 16S rDNA 序列，PCR 反应为 50
μL 体 系 ：模 板 DNA 1 μL，2×Es Taq MasterMix 25
μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，ddH2O 22 μL。
PCR 反应条件为：94℃ 5 min，94℃ 1 min，55℃ 30 s，
72℃ 1 min，30 个循环，72℃ 10 min。PCR 扩增产
物使用 1% 凝胶电泳检测后，送至生工生物工程（上
海）有限公司测序。测序结果提交至 EzTaxon 核酸
序列库（http ：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/）进行比对，
使用 MEGA5.0 软件进行多序列比对，用 Neighbor-
Joining 法构建系统发育树［18］。
2 结果
2.1 红树林放线菌的分离与筛选
本研究共分离得到 110 株放线菌，初筛时获得
27 株线虫校正死亡率在 80% 以上放线菌 ；复筛试
验中将发酵液稀释 40 倍、处理时间 24 h 时，获得
根结线虫校正死亡率在 50% 以上的菌株 2 株，其中
菌株 HA10401 校正击倒率为 58.4%，校正死亡率为
52.6% ；在发酵液稀释 20 倍时，校正死亡率上升到
58.2%。对该菌株连续继代培养 5 次，发现其发酵液
抗虫活性稳定。将稀释 40 倍的发酵液在不同的时间
段内处理根结线虫，观察发酵液对线虫活性的影响
情况。由图 1 可以看出，随着时间的延长，线虫校
正死亡率表现出增长的趋势。
0
10
20
30
40
50
60
2 4 8 12 24༴⨶ᰦ䰤h㓯㲛ṑ↓↫ӑ
⦷%
图 1 处理时间对线虫死亡率的影响
2.2 活性菌株形态和生理生化特征
菌株 HA10401 在 6 种形态鉴定培养基上均生长
良好，形成发达的气生菌丝和基内菌丝，气生菌丝
呈灰色或灰白色，基内菌丝呈棕色或者黄色。孢子
丝螺旋形，孢子卵形，表面带短刺。在 6 种培养基
上均不产生明显的可溶性色素。
菌株 HA10401 能利用 D-果糖、L-阿拉伯糖、L-
鼠李糖、肌醇等，不能利用蔗糖、棉籽糖，不产生
黑色素，淀粉水解、明胶液化、硝酸盐不还原，具
体情况，见表 1。
2.3 16S rDNA系统发育分析
将 菌 株 HA10401 的 16S rDNA 经 PCR 扩 增 后
进行测序，得到长度为 1 332 bp 的序列（GenBank
登录号 KJ523176），将该序列与 EzTaxon 核酸序列
库的相关菌株进行相似性比对，结果发现该菌株
与 Streptomyces variabilis NRRL B-3984T 同源性最高，
2014年第10期 177陈雨晴等：1株具有抗根结线虫活性的红树林土壤放线菌的分离与鉴定
为 99.8%。 选 取 9 株 同 源 性 高 的 模 式 菌 株， 利 用
MEGA5.0 软件构建系统发育树，结果如图 2 所示，
菌 株 HA10401 与 菌 株 Streptomyces variabilis NRRL
B-3984T 在系统发育树上处于同一分支，亲缘关系
最近。
2.4 菌株的鉴定结果
菌 株 HA10401 与 Streptomyces variabilis 同 源 性
最高（99.8%），且在发育树上处于同一个分支。HA-
10401 可以水解淀粉、纤维素，液化明胶，但不能
还原硝酸盐 ；可以利用 D-甘露醇、L-鼠李糖和 L-肌
醇，但不能利用蔗糖和棉籽糖。将菌株 HA10401 与
Streptomyces variabilis 的形态和生理生化特征进行比
较［19］，除了 Streptomyces variabilis 的最高生长温度
为 45℃，二者在各方面基本一致。综合以上形态、
生理生化特征和 16S rDNA 序列分析［20］，将菌株
HA10401 鉴定为 Streptomyces variabilis。
3 讨论
松材线虫和根结线虫均为植物寄生性线虫，在
生理结构、代谢规律和生活习性等方面有一定的相
似性。根结线虫要从植物病根中获取，目前尚不能
人工培养，不能满足大量的筛选需求［3］，而松材线
表 1 菌株 HA10401 的生理生化特征
特征 结果 特征 结果
温度范围（℃） 20-40 D-果糖 +
生长 pH 6-8 D-葡萄糖 +
黑色素产生 - D-甘露醇 +
明胶液化 + D-木糖 +
硝酸盐还原 - L-肌醇 +
淀粉水解 + L-阿拉伯糖 +
牛奶凝固 - 棉籽糖 -
牛奶胨化 - 蔗糖 -
纤维素水解 + L-鼠李糖 +
H2S 产生 - 过氧化氢酶 +
“＋”：阳性结果，“-”：阴性结果
Streptomyces variabilis NRRL B-3984TNR-043840
HA10401KJ523176
Streptomyces griseoincarnatus LMG 19316TAJ781321
Streptomyces labedae NBRC 15864TAB184704) 100
Streptomyces aureorectus NBRC 15896TAB184710
Streptomyces pseudogriseolus NRRL B-3288TNR-04383576
Streptomyces vinaceus NBRC 13425TAB184394
Streptomyces lateritius LMG 19372TAJ781326 87
Streptomyces aureofaciens DSM 40127 TAY207608
Micromonospora aurantiaca ATCC 27029TCP00212692
100
图 2 基于 16S rDNA 的菌株 HA10401 与相关菌株的系统发育树
虫培养技术比较成熟，使用镰刀菌来培养松材线虫，
繁殖时间短，易培养，可在短时间内（3-5 d）获得
大量供试线虫，因此，本试验中使用松材线虫为初
筛线虫，而根结线虫在复筛试验中才采用。
红树林由于生境的特殊性，具有丰富而独特的
生物多样性和天然产物资源［21］，在陆地天然产物的
开发趋于饱和的状态下［22］，具有更大的发现新型抗
线虫产物的潜力。根据菌株 HA10401 的形态特征、
生理生化特征和 16S rDNA 系统发育分析结果，将其
鉴定为 Streptomyces variabilis。曾有报道从该菌发酵
液中分离到新型抗生素 variapeptin，该复合物能有
效对抗革兰氏阳性菌，并对哺乳动物显示有细胞毒
性［23］；Pan 等［24］从 Streptomyces variabilis 中分离的
天然产物 ammosamide D 也对 MIA PaCa-2 胰腺癌细
胞系有一定的细胞毒性。而关于该菌株的抗根结线
虫活性在本研究中进行了首次报道，具有进一步开
发的潜能。
4 结论
本试验从海南东寨港红树林植物根际土壤中分
离放线菌，采用 24 孔板液体筛选模型筛选出具有
较高抗线虫活性的放线菌菌株 HA10401。该菌株发
酵液在稀释 40 倍、处理时间 24 h 时，线虫校正击
倒率为 58.4%，校正死亡率为 52.6%，在发酵液稀
释 20 倍时，校正死亡率为 58.2%。对菌株 HA10401
的形态学和生理生化鉴定结果显示，其孢子丝螺旋
形，孢子卵形，表面带短刺，能利用 D-甘露醇、L-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期178
鼠李糖和 L-肌醇等，但不能利用蔗糖和棉籽糖，能
水解淀粉、纤维素，明胶液化。菌株的 16S rDNA
序 列 与 Streptomyces variabilis NRRL B-3984T 同 源 性
最高（99.8%），在系统发育树上处于同一分支。综
合形态、生理生化特征及 16S rDNA 序列分析，将
菌 株 HA10401 鉴 定 为 变 异 链 霉 菌（Streptomyces
variabilis）。
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（责任编辑 李楠）